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방법 논문

조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53465

⸱

2016년 3월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

이 논문에서

요약

내열반응성 블록 공중합체로 구성된 나노 스케일의 바다 섬 표면은 자발적인 세포 접착 및 분리를 제어하기 위해 Langmuir-Schaefer 방법에 의해 제조되었습니다. 표면의 준비와 표면에 있는 세포의 접착 및 분리가 모두 시각화되었습니다.

초록

세포 접착 및 박리를 제어하기 위한

'jove_content'>Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) 고정 표면은 Langmuir-Schaefer 방법으로 제작되었습니다. 폴리스티렌과 PIPAAm(St-IPAAms)으로 구성된 양친매성 블록 공중합체를 RAFT(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer) 라디칼 중합에 의해 합성했습니다. St-IPAAm 분자의 클로로포름 용액을 Langmuir-trough 장치에 부드럽게 떨어뜨리고 장치의 두 장벽을 수평으로 이동하여 필름을 압축하여 밀도를 조절했습니다. 그런 다음 St-IPAAm Langmuir 필름을 표면 고정 장치에 의해 소수성 변형 유리 기판에 수평으로 전사했습니다. 원자력 현미경 이미지는 표면의 나노 스케일 바다 섬 구조를 명확하게 보여주었습니다. 준비된 표면의 세포 부착 및 박리의 강도, 속도 및 품질은 PIPAAm 분자의 낮은 임계 용액 온도 범위에서 온도 변화에 의해 조절되었습니다. 또한, 최적화된 표면에서 2차원 세포 구조(세포 시트)를 성공적으로 복구했습니다. 이러한 고유한 PIPAAm 표면은 세포 접착 및 박리의 강도를 제어하는 데 유용할 수 있습니다.

서론

나노 구조화 된 표면은 최근에 의한 패터닝, 세포 배양, 세정, 표면 스위칭 포함한 다양한 응용 가능성으로 상당한 주목을 받고있다. 예를 들어, 연꽃 잎과 다른 반응 표면의 나노 구조에서 영감을 초 소수성 표면은 외부 자극 1-4에 반응 할 수있다.

랭 뮤어 막은 가장 널리 연구 폴리머 코팅이다. 랭 뮤어 막은 공기 - 물 계면에 5-8 양친 성 분자를 적하함으로써 형성된다. 필름은 물리적 또는 화학적 흡착에 의해 고체 표면에 전사 할 수 있으며, 고체 표면에 분자 형태는 수직 및 수평 전송 방법 9-12를 사용하여 제어 될 수있다. 랭 뮤어 막의 밀도는 정확하게 공기 - 물 계면을 압축에 의해 조절 될 수있다. 최근,이 방법은 관련된 과학 바다 섬 structur를 제조하는 효과가 입증되었습니다양친 성 블록 공중 합체를 이용하여 에스. 나노 구조는 소수성 세그먼트의 코어 및 친수성 세그먼트 13-17의 쉘 구성 간주됩니다. 또한, 표면에 나노 구조체들의 수는 인터페이스에서 블록 공중 합체의 분자 당 면적 (m)를 제어함으로써 조절된다.

우리는 온도에 응답하여 배양 표면을 이용하여 원래의 고유 지지체없는 조직 공학 방법, 세포 시트 공학에 초점을 맞추고있다. 개발 된 기술은 다양한 기관 (18)의 회생 치료에 적용되고있다. 온도 응답하여 배양 표면은 표면 상에 19 ~ 27 폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드의) (PIPAAm), 온도 반응 분자를 그 래프팅에 의해 제조 하였다. PIPAAm 및 공중 합체 전시 32 ° C에 가까운 온도에서 수성 매질에서 낮은 임계 용액 온도 (LCST). 배양은 표면 온도 응답 교류 직류을 나타내 소수성과 친수성 ​​사이에. 37 ° C에서 PIPAAm 그래프트 표면은 친수성이되고, 세포는 쉽게 부착 표면 상뿐만 아니라, 종래의 조직 배양에서 증식 된 폴리스티렌. 온도를 20 ℃로 하강 될 때, 표면은 친수성이되고, 세포는 자발적으로 표면으로부터 분리. 따라서, 표면 상에 배양 세포 융합 온도를 변화시킴으로써 본래 시트로서 수확 될 수있다. 이러한 세포 접착 및 박리 특성도. 실험실 데모 26 27 랭 뮤어 필름 코팅하여 제조면에서 표시 한 폴리스티렌 (P (성)) 및 PIPAAm (세인트 IPAAm)로 이루어지는 블록 공중 합체의 랭 뮤어 필름을 제조 하였다. 특정의 m과 랭 뮤어 막을 가로 소수성 개질 된 유리 기판에 전사 할 수있다. 또한, 온도에 응답하여 상기 제조 된 표면으로부터 세포의 부착 및 박리를 평가 하였다.

_content "> 여기에서는 유리 기판 상에 열 응답하여 양친 성 블록 공중 합체로 이루어지는 나노 구조 랭 뮤어 필름의 제조에 대한 프로토콜을 설명한다. 우리의 방법은, 표면 과학의 다양한 분야에서, 유기 나노 필름에 효과적인 제조 방법을 제공 할 수 있고, 더 용이하게 할 수있다 에 대한 세포 부착을 효율적으로 제어하고 표면으로부터 자연 박리.

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프로토콜

폴리스티렌 - 블록 - 폴리 (N의 이소 프로필 아크릴 아미드) 2 단계 가역 추가-조각화 체인 전송 (RAFT) 라디칼 중합에 의해 1. 합성

  1. 스티렌 (153.6 밀리몰)을 용해시키고, 4- 시아 노 -4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic 산 (ECT 0.2 mmol) 및 4,4'- 아조 비스 (4- 시아 노 발레르 산) (ACVA 0.04 mmol)을 1 mL의 40에서 1,4- 디 옥산. 반응 종을 제거하고 실온에서 서서히 해동 15-20 분 동안 진공 하에서 액체 질소 용액을 동결. 이 솔루션은 완전히 해동되어 있는지 확인이 동결 펌프 - 해동 탈주기를 세 번 반복한다.
  2. 오일 조에서 15 시간 동안 70 ° C에서 중합에 의해 매크로 RAFT 제로 : 폴리스티렌 (PST) (13,500 Mw)이옵니다.
  3. 침전물 PSt와 매크로 RAFT 에테르 800 mL를 제하고, 진공에서 건조.
  4. 1,4- 디 옥산 중 4 ㎖ 중의 IPAAm 단량체 (4.32 밀리몰) : PST 매크로 RAFT 에이전트 (0.022 mmol) 및 ACVA (0.004 밀리몰)을 녹인다.
  5. 풀다동결 - 펌프 - 해동 사이클에 의해 탈기 용액 중의 산소는 단계 1.1에 나와있다.
  6. 탈기 후, 오일 욕에서 15 시간 동안 70 ℃에서 중합 반응을 수행한다. 태평양 표준시 매크로 RAFT 에이전트와 동일한 방식으로 : 합성 세인트 IPAAm 분자 (32,800 Mw)이옵니다.

실란 소수성 수정 된 유리 기판 2. 준비

  1. 5 분 동안 아세톤, 에탄올 및 초음파 처리 과량의 워시 유리 기판 (24mm X 50mm)의 표면 오염물을 제거한다.
  2. 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 기판을 건조. 이어서 RT에서 기판의 표면을 활성화하기 위해 산소 플라즈마 (400 W, 3 분)를 사용한다.
  3. 기판 silanization합니다 위해 RT에서 밤새 1 % 헥실 트리 메 톡시 실란을 함유하는 톨루엔 기판을 담가.
  4. 톨루엔에 실란 화 기판을 세척하고 미 반응 에이전트를 제거하는 30 분 동안 아세톤에 몰입.
  5. 110 ° C에서 2 시간 동안 어닐링 기판을 철저들 고정하기urface.
  6. 세포 배양 접시 (: φ35 mm 접시 크기)에 맞게 25mm X 24mm에 유리 커터로 실란 화 된 기판을 잘라.

랭 뮤어 필름 및 필름 전송 표면 3. 준비

  1. 먼지의 축적을 방지하기 위해 캐비​​넷 랭 뮤어 막 악기를 놓는다.
  2. (: 580mm X 145mm 크기) 및 증류수와 오염 물질을 제거하기 위해 에탄올 장벽 랭 뮤어 통을 씻으십시오.
  3. lintless 타월로 닦아 저점과 장벽을 건조시킵니다. 그런 다음 증류수 약 110 ml의에 저점을 작성하고 통의 양쪽에 장벽을 설정합니다. 증류수가 3.5-3.13 다음 단계에 유출하지 않고 추가해야합니다.
  4. 플레이트는 적색으로 변할 때까지 가스 버너 표면 장력을 모니터링하고 오염물을 제거하기 위해 증류수로 세척 : 백금 빌헬 플레이트 (39.24 mm 경계)를 가열한다. 부착 와이어 빌헬 플레이트 일시표면 압력 측정 장비.
  5. 제조사의 프로토콜에 따라, 표면 압력 측정기구를 제로. 인터페이스 중합체 물기없이 약 50 ㎠로 될 때까지 골의 양측에 장벽 홈통에 공기 - 물 계면을 압축한다.
  6. 표면 압력까지 대기음 작은 오염 물질은 거의 0 MN / m이다.
  7. 양쪽에 장애물의 위치를​​ 변경하고, 단계 3.6에서 증류수의 감소를 보상하기 위해 증류수를 추가합니다.
  8. 클로로포름 현상 용액 5ml에 합성 세인트 IPAAm 분자 5 ㎎을 녹인다.
    참고 : 디클로로 메탄 또는 톨루엔과 같은 용매로서 사용될 수있다.
  9. 조심스럽게 마이크로 실린 또는 마이크로 피펫을 사용하여 통에 클로로포름에 용해 세인트 IPAAm의 27 μl를 놓습니다.
  10. 5 분 동안 대기 한 후, 클로로포름의 완전한 증발을 허용 세인트 IPAAm의 molecu를 압축 수평으로 장벽을 이동계면 르. CM이 도달 할 때 (50)의 타겟 영역까지 0.5 mm / 초에서 장벽의 압축률을 유지한다.
    주의 : 급속한 압축률 랭 뮤어 막 내의 결함을 야기한다.
  11. 제조사의 프로토콜에 따라 압축하는 동안 표면 압력 측정기구에 부착 빌헬 백금 접시 표면 압 (π) -A m 등온선을 측정한다.
  12. 대상 지역의 크기에 도달 한 후, 세인트 IPAAm 분자 이완 할 수 있도록 5 분 동안 표면을 유지; 분자 압축 직후에 평형에 도달하지 않는다.
  13. 견고 필름 흡착 5 분 동안 전송 장치를 이용하여 소수성 개질 된 유리 기판에 랭 뮤어 막을 옮긴다. 단말기 병렬 소수성 유리 기판을 고정한다. 정렬 단계에 장치를 연결하고 수직으로 이동합니다.
  14. desiccato에서 1 일 동안 전송 장치 및 건조 수평 기판을 들어 올려아르 자형.

4. 세포를 배양하고, 랭 뮤어 필름 전송 된 표면에 세포 부착 및 박리 최적화

  1. 10 % 태아를 포함하는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 조직 배양 폴리스티렌 (FPC 기판)에 CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 삼분의 합류점에 세포 현탁 배양 소 경동맥 내피 세포 (BAECs)을 제조 소 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린.
  2. 합류점에 도달 한 후, CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 3 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 3 ㎖와 BAECs 치료.
  3. DMEM 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신 EDTA를 비활성화하고, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
  4. 5 분 120 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. DMEM 10 mL로 세포를 다시하면 일시 중지합니다.
  5. 5 분 동안 살균 클린 벤치에 자외선 아래에있는 세인트 IPAAm 표면을 놓습니다.
  6. 회수 된 가전을 시드세인트 IPAAm에 LLS 일회용 혈구에 의해 계수 1.0 × 104 세포 / ㎠의 농도로 표면 및 5 % CO 2 및 95 %로 37 ℃ 배양기 구비 현미경으로 표면에 세포를 관찰 공기.
    참고 : 클린 벤치에 장착 된 자외선에 의해 세인트 IPAAm 표면을 소독.
  7. 10 배 확대와 위상 현미경에 의해 37 ° C에서 약 24.5 시간 동안 부착 BAECs의 녹음 시간 경과 이미지. BAEC 부착, 약 3.5 시간 동안 20 ° C에서 세인트 IPAAm 표면에서 BAECs의 기록 분리 후.

랭 뮤어 필름 전송 표면 5. 세포 시트 제작

  1. 동일한 방식으로 사용되는 배양 BAECs는 4 절에 설명.
  2. 세인트 IPAAm 표면에 1.0 × 105 세포 / ㎠의 총 시드 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 일간 배양한다. 합류 BAECs는 자발적으로 20 ° C에서 분리.

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결과

폴리스티렌 특정 분자량의 폴리 (이소 프로필 아크릴 아미드의 N) (세인트 IPAAms)로 이루어지는 블록 공중 합체 RAFT 라디칼 중합에 의해 합성 하였다. Moad 외. (28)에 기재된 바와 같이 ECT는 연쇄 이동제로서 제조 하였다. 다른 PIPAAm 사슬 길이의 두 세인트 IPAAm 분자를 합성하고, 얻어진 블록 중합체 1 H 핵 자기 공명 (NMR) 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 특징 하였다. 세인트 IPAAms의 분자량은 분자량 분포가 좁은 (1.31 및 1.50)으로 32,800 및 67,900이었다. 폴리스티렌 매크로 RAFT 에이전트와 PIPAAm의 단량체 전환은 17.4 % 이상 85.0 % 인 것으로 확인되었다. 합성 세인트 IPAAms는 각각 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480 선정됐다.

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토론

온도 응답 표면은 랭 뮤어 - 쉐퍼 방법에 의해 제조하고, 세포 부착 / 분리 및 세포 시트 회수 표면 특성이 최적화되었다. 표면의 제조에 본 방법을 사용할 때, 몇 가지 단계가 중요하다. 세인트 IPAAm 분자의 분자 조성물은 세포 부착 및 박리에 표면 구조에 큰 영향 표면의 안정성, 확장자를 갖는다. 특히, 세인트 IPAAm 분자는 좁은 분자량 분포를 가져야한다. 제안 된 방법에서, 상이한 PIPAAm 쇄 길이를 갖는 두 세인트 IPAAm 분자는 분자량 및 분자량 분포를 제어 할 수 RAFT 중합에 의해 합성 하였다.

단계 나노 구조물의 결함을 방지 세인트 IPAAm 표면의 제조 동안 공기 - 물 계면의 오염을 방지하기 위해주의해야한다. 인터페이스에 폴리머 분자를 삭제, contaminan 전표면 압력은 대략 0 MN / m에 도달 할 때까지 TS를 흡입한다. 오염은 저점 빌헬 플레이트의 가장자리 주위에 축적되는 경향이있다. 빌헬 판의 표면에 약간의 오염이 있었기 때문에,...

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공개 사항

모든 저자는 원고 작성에 동등하게 기여했으며 최종 버전을 승인했습니다. 저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 일본 문부과학성(MEXT)의 '세포시트 조직공학센터(Cell Sheet Tissue Engineering Center, CSTEC)'의 혁신 시스템 개발 프로젝트인 '첨단 학제간 연구 프로그램을 위한 혁신 센터 조성(Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program)'의 재정 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
N-isopropylacrylamideKohjin카탈로그 번호
없음 Azobis(4-cyanovaleric acid)Wako Pure Chemicals016-19332
스티렌시그마-알드리치S4972
1,3,5-트리옥산시그마-알드리치T81108
1,4-다이옥산Wako 순수 화학045-24491
DMEM시그마 D6429
PBS나카라이11482-15
스트렙토마이신GIBCO BRL15140-163
페니실린GIBCO BRL15140-122
트립신-EDTA시그마T4174
FBS일본 BioserumJBS-11501
BAECs건강 과학 Reserch 자원 은행JCRB0099
커버 안경Matsunami Glass IndustryC024501
AFM NanoScope VVeeco
1H NMR INOVA 400Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPCTosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000Tosoh
Langmuir-Blodgett 증착 트로프 KSV 인스트루먼트KN 2002KSV NIWA 미듐 트로프
니콘 ECLIPSE TE2000-U니콘

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