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방법 논문

의 측면 루트 유도 성 시스템

13.8K 조회수

DOI:

10.3791/53481

2016년 1월 14일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

LRIS(Lateral Root Inducible System)는 측근의 동기 유도를 허용하며 Arabidopsis, thaliana 및 maize에 대해 제공됩니다.

초록

측면 뿌리 발달은 뿌리 시스템에 크게 기여하므로 식물 성장에 중요합니다. 그러나 측면 뿌리 시작에 대한 연구는 뿌리 내부의 소수의 세포에서만 예측할 수 없는 방식으로 발생하기 때문에 지루합니다. 이 문제를 피하기 위해 LRIS(Lateral Root Inducible System)가 개발되었습니다. 옥신 수송 억제제와 합성 옥신으로 묘목을 연속적으로 처리함으로써 1차 뿌리에서 고도로 제어된 측면 뿌리 시작이 동시에 발생하여 원하는 발달 단계의 풍부한 샘플링을 가능하게 합니다. LRIS는 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 위해 처음 개발되었지만, 다른 식물에도 적용할 수 있습니다. 따라서 옥수수 (Zea mays)에 사용하도록 조정되었습니다. 두 공장에서 LRIS의 여러 단계에 대한 자세한 개요가 제공됩니다. 이 시스템과 비교 전사체학의 조합으로 CYCLIN B1에 대해 여기에 설명된 바와 같이 다른 종에서 애기장대 측면 뿌리 개시 유전자의 기능적 상동체를 식별할 수 있었습니다. 1 (CYCB1; 1) 옥수수의 세포주기 유전자. 마지막으로, 다른 식물 종을 위해 LRIS를 개발할 때 고려해야 할 원칙에 대해 논의합니다.

서론

이 토양에서 앵커리지 및 물 섭취와 영양분을 보장 이후 루트 시스템은 식물 성장에 중요하다. 루트 시스템의 팽창은 주로 측면 뿌리의 생산에 사용하기 때문에, 그 개시 및 형성은 널리 연구되고있다. 측면 뿌리는 설립자 세포 1이라고 pericycle 세포의 특정 부분 집합으로 시작됩니다. 옥수수와 같은 외떡잎에, 그들은 사부 극 3에서 발견되는 반면, 같은 애기 장대와 같은 대부분의 dicots, 이러한 세포, protoxylem 기둥 2에 있습니다. 설립자 세포는 특정 세포주기 유전자의 발현에 이어 증가 옥신 반응 (4)에 의해 표시된다 (예를 들어, 사이클린 B1 1 / CYCB1는 1), 그 후 그들이 비대칭 배사 부문 (5)의 첫 번째 라운드를 겪는다. 조정 배사와 periclinal 부문의 일련의 후 측면 루트 primordium 최종적으로 부상 할 것으로 형성된다utonomous 측면 루트. 이러한 이벤트가 풍부한이나 동기화도 있기 때문에 위치 및 측면 루트 개시 타이밍은, 그러나 예측하지 않습니다. 여기에는이 과정을 연구하기 transcriptomics 분자 접근법의 사용을 방해한다.

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프로토콜

1. 애기 장대 LRIS 프로토콜

참고 : 텍스트는 "작은"또는 "큰"규모의 실험을 의미한다. 이러한 마커 라인 분석 및 조직 학적 염색법 6, 14 등의 소규모 실험은 단지 몇 개의 샘플을 필요로한다. 이러한 정량적 실시간 QRT-PCR 마이크로 어레이 9-11 또는 RNA 시퀀싱 같은 대규모 실험은 샘플의 더 많은 양을 필요로한다. 따라서, 샘플 1000 모종이 Vanneste 등의 알에 의해 사용되었다 ~의. (11) 양이 루트 세그먼트 절개 후 마이크로 어레이 실험을 수행 할 수 있습니다.

DAY 1

  1. 애기 씨의 살균
    참고 : 종자 살균을위한 다음 절차 중 하나를 선택합니다. 그들 중 임의의 프로토콜의 다음 단계에 적합하다. 가스 멸균 (1.1.2) 액체 살균 (1.1.1)을 통해 두 가지 장점을 제공합니다 : 큰 감각을 처리 할 때이 시간이 적게 걸립니다씨앗 어, 더 피펫 개별 샘플에 대한 발생이 없기 때문에, 및 소독 종자 장기간 저장 될 수있다. 그러나, 건조기 및 취급에주의가 필....

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결과

LRIS의 응용 프로그램 측면 루트 개시 과정의 비교 Transcriptomics를 수행하는

LRIS의 하나의 응용은 다른 종에서 횡 루트 형성시와 비교하여 유전자 발현 양상의 상관 관계이다. 비교 transcriptomics는 다른 종의 측면 루트 개발 과정에 참여 orthologous 유전자를 찾아 낼 수있는 가능성을 만들어 접근한다. 이미 형성된 루트 축에 포함 된 셀의 서브 세트로부터 새로운 장기의 형성으로 구성되어 측면 루트 개시는 그들의 뿌리 구조를 제어 할 속씨 공유 주요 메커니즘이다. 결과적으로,이 공통 조상에서 본 기존 경로로부터 진화 및 진화에 걸쳐 보존 된 가능성이 높다. 실제로, 측면 루트 개시의 일반적인 잠재적 규​​제는 다른 종에서 발견 된 17, 18.

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토론

애기 LRIS 프로토콜에서, 오직 완전히 NPA 함유 증식 배지와 접촉 성장한 묘목을 전송하는 것이 중요하다. 이 측면 루트 개시는 전체 루트 길이에 걸쳐 차단되는 것을 보장한다. 전송 중에 묘목 부상 방지하기 위해, 만곡 된 포셉 팔 종묘의 자엽 하에서 후크 될 수있다. 전송시, 묘목의 뿌리가 NAA 함유 한천 배지와 충분한 접촉에 있는지 확인하십시오. 이것은 작은 거리에 걸쳐 한천 표면에 뿌리를 감추고에 의해 달성 될 수있다. 이것은 전체 루트 길이에 걸쳐 횡 루트 개시의 효율적인 동기화되도록 유도한다. 뿌리는 부정적인 측면과 성장 루트 유도에 영향을주지 않고 노광 성장 될 수있다.

옥수수 LRIS 프로토콜에서는 커널 잔뿌리 D가 증가 할 루트를 보장하기 위해 아래로 용지를 향해 대면하는 것이 중요ownwards 올바른 측 16 용지에 부착합니다. NPA 처리의 삼일 후, 모종은 작은 촬영, 기본 루트와 정액 뿌리 (16)

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 기술 지원과 사진 촬영에 대해 Davy Opdenacker에게 감사를 표합니다. 원고를 개선하는 데 도움이 되는 제안을 해주신 Annick Bleys 박사님께 진심으로 감사드립니다. 이 작업은 벨기에 연방 과학 정책국의 Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS', FWO 보조금 G027313N 및 과학기술혁신청(IR)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ARABIDOPSIS LRIS
Seeds
Arabidopsis seedsCol-0 ecotype
Gas sterilization of seeds
micro-centrifuge tubes 1.5 mlSIGMA-ALDRICH0030 125.215Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean
micro-centrifuge tubes 2 mlSIGMA-ALDRICH0030 120.094Eppendorf Safe-Lock micro-centrifuge tubes
hydrochloric acidMerck KGaA1,003,171,00037% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
유리 건조제SIGMA-ALDRICH파이렉스
유리 비커
플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브 상자 또는 홀더
<강>표백제 종자 살균
에탄올Chem-Lab nvCL00.0505.1000에탄올, abs. 100% a.r. 70%
로 희석차아염소산나트륨(NaOCl)Carl Roth9062.312%
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379
멸균수
<강>성장매체
Murashige 및 Skoog 염 혼합물DUCHEFA Biochemie B.V.M0221-0050
미오 이노시톨시그마 알드리치I5125-100G
2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES)DUCHEFA Biochemie BVM1503.0100
자당VWR, Internation LLC27483.294D(+)-설탕 Ph. Eur.
KOHMerck KGaA분석용 1050211000 펠릿(최대 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
식물 조직 배양 AgarLabM LimitedMC029
Lateral Root Induction Chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)DUCHEFA Biochemie BV번호 N0926.025010 &마이크로; M (애기장대)
1-나프탈렌 아세트산 (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.번호 N0903.005010 &마이크로; M (애기장대)
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
전사 용 메쉬 만들기< / strong>
nylon 메쉬Prosep byba합성 나일론 메쉬 20 µ m
파종 및 묘목 처리
square 페트리 접시GOSSELINBP124-0512 x 12 cm
50 ml DURAN 튜브SIGMA-ALDRICHCLS430304 Corning  50 ml 원심분리기 튜브
drigalskiCarl RothK732.1
피펫
컷 피펫 팁Daslab162001XUniversal 200, 고압클레이브 전 팁 5mm 절단
통기성 테이프 3M Deutschland GmbH카탈로그 번호 1530-1
핀셋Fiers nv/saK342.1; K344.1Dumont 핀셋 유형 a nr 5; Dumont 핀셋 유형 e nr 7
<강한>성장 조건
성장실deg; C, 연속 빛
< 강한 > 재료 < / 강한 >< 강한 > 회사 < / 강한 >< 강한 > 카탈로그 < / strong >< strong > Comments < / strong >
< strong > MAIZE LRIS < / strong >
< strong > 씨앗 < / strong >
옥수수 커널B-73
Bleach 커널 살균
glass 비커
자석 교반기 Fiers nv/saC267.1
차아염소산나트륨(NaOCl)Carl Roth9062.312%
멸균수
<강한>측면뿌리 유도 화학 물질
N-1-나프틸프탈람산(NPA)DUCHEFA Biochemie BV번호 N0926.025050 &마이크로; M (옥수수 1 차 뿌리), 25 µ M (옥수수 외래 뿌리)
1- 나프탈렌 아세트산 (NAA)DUCHEFA Biochemie BV번호 N0903.005050 &마이크로; M (옥수수)
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
파종 및 묘목 처리< / strong>
종이 핸드 타월Kimberly-Clark Professional *6681SCOTT 핸드 타월 - 롤 / 화이트; 시트 크기 (24 x 46 cm)
종자 발아 종이Anchor Paper Company10 X 15 38 # 종자 발아 종이
핀셋Fiers nv/saK342.1; K344.1Dumont 핀셋 유형 a nr 5; Dumont 핀셋 유형 e nr 7
250 ml (원심분리기) 튜브SCHOTT DURAN2160136약 5.6 cm 지름과 14.7 cm 높이 
700 ml 튜브DURAN GROUP213994609실린더, 라운드 풋 튜브, D 60  x 250
, 옥수수 튜브용, 집에서 만든
멸균수
<강>성장 조건
성장 캐비닛27 ° C, 연속광, 70% 상대 습도
21 &

참고문헌

  1. Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
  2. Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development.....

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재인쇄 및 허가

태그

Arabidopsis thalianaZea maysNPA NAACYCB1 1