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방법 논문

치근단 절제술 마우스 모델은 초기 포유류의 심장 재생을 연구하는

11.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53488

⸱

2016년 1월 23일

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

이 논문에서

요약

이 연구에서는 정점 절제술의 단계별 비디오 프로토콜이 입증되었습니다. 정점 절제술은 포유류 심장 재생 연구에서 최근 주목받고 있는 수술 방식입니다. 이 연구는 심장 재생의 기저에 있는 메커니즘에 대한 연구에서 정점 절제술의 표준 방법론으로 적용을 촉진할 수 있습니다.

초록

심혈관 질환으로 인해 집중적 인 생활 습관의 변화로 전 세계를 재앙. 심장 재생은 수리 인한 부상과 질병에 손실 심근 세포를 복원하는 큰 약속을 보유하고있다. 특정 낮은 척추 동물의 강력한 심장 재생과는 달리, 성인 포유류의 마음은 일반적으로 심장 재생 및 수리를위한 최소한의 용량을 보여줍니다. 그러나, 최근의 연구 (P7에 P1) 1-7 출생 후의 일 사이에, 신생아 마우스 마음이 혀끝의 절제 (즉, 수술 절단 및 좌심실 정점의 노출) 후 상당한 회생 가능성을 유지, 연구 결과와 상당한 과학적 관심을 촉발했다. 이 발견을 통해 하나의 주요 논쟁은 복제하거나이 중요한 발견에 확장하기위한 노력에 사용되는 다양한 수술 관련 절차로 인해 수 있습니다. 이 지침은 동적으로 마우스 모델에서 혀끝의 절제에 대한 자료와 방법론을 제시한다. 이 설치류 surviva의 두드러진 단계L 수술은 저체온 마취, 개흉술, 심장 심실 정점의 수술 절단 및 봉합와 마우스의 회복을 포함한다. 심장 혈관 연구를위한 치근단 절제술 마우스 모델의 응용 프로그램을 확장 할 수 설명하는 방법.

서론

인간의 수명이 길어지면 주요 사망 원인인 심부전을 포함한 다양한 노화 및 생활 습관 관련 질병이 발생합니다. 그러나 손실되거나 기능 장애가 있는 심장 근육 세포를 대체하지 않으면 현재의 치료법은 심장 기능을 일시적으로 개선할 수 있을 뿐이다1, 2. 따라서 심장 재생 및 복구를 위한 혁신적인 전략을 발견하고 개발해야 합니다. 다 자란 포유류의 심장은 재생 잠재력이 제한적입니다. urodele 양서류와 teleost fish와 같은 하등 척추 동물에 대한 연구는 심장 재생의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 전례 없는 통찰력을 제공했습니다3, 4. 최근에는 심장 재생에 대한 신생아 마우스 모델이 등장하여 인간의 심장 재생에 필요한 보다 진화적으로 보존된 병태생리학적 사건을 식별하고 특성화할 수 있습니다5.

정점 절제술은 좌심실 정점을 외과적으로 제거하는 것을 말합니다. 이 절차는 1-7일 된 생쥐(P1-P7) 생쥐로 제한되는데, 그 이유는 나이가 많은 생쥐에서 치사율이 높기 때문이다6. 정점 절제 후 신생아 마우스의 심장 재생 과정은 다음과 같을 것으로 예상됩니다: (I) 정점을 밀봉하고 출혈을 방지하기 위한 혈종의 빠르고 효과적인 형성; (II) 심근세포 재생과 수축기 기능 회복5, 7. 최근 연구는 이 모델8-11의 중요성과 효율성에 대한 논쟁을 불러일으켰습니다. 따라서 정점 절제술을 명확하고 자세하게 제시하는 것이 중요합니다. 이를 위해 이 프로토콜은 이전 프로토콜6을 기반으로 정점 절제술을 어떻게 수행했는지에 대한 비디오를 생생하고 구체적으로 설명합니다.

심장 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 심부전과 같은 심근세포의 손실 및/또는 손상을 특징으로 하는 심장 질환의 치료에 중요합니다1, 2. 심장 재생 연구에서 정점 절제술의 현재 유망한 진전을 감안할 때, 이 연구는 심장 재생 연구에서 이 기술의 사용과 사용을 촉진할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 마우스 실험 프로토콜 번호 H0083R3와 국립 보건원 (NIH)의 동물 관리 및 사용 프로그램에 의해 승인되었다. NHLBI IACUC는 진통제없이 프로토콜을 승인했다.

신생아 마우스 1. 저체온 마취

  1. 수술 전에 오토 클레이브 스폰지 및 수술 장비 소독. 모든 수술 재료를 준비하고 270 ° C에 240 ° C에 도달하기 위해 사전에 뜨거운 구슬 살균기 15 ~ 20 분에 전환합니다.
  2. 신선한 침구와 중첩 재료와 깨끗한 마우스 케이지에 자신의 간호 어머니의 모든 C57BL / 6 새끼 (연령 P1)를 전송합니다. 새끼는 수술 방으로 촬영하면, 자신의 시간은 어머니로부터 분리 된 시간에 산모 잠식의 위험을 줄이기 위해 최소화하기 위해 신속하게 혀끝 수술을 수행합니다.
  3. 얼음 침대에 스폰지를 넣고 2 ~ 3 분 저체온 마취를 달성하기 위해 다음 스펀지에 한 강아지를 놓습니다. AP를 관찰하여 마취를 확인NEA와 무 운동과 후방 발을 곤란. 너무 적은 시간이 강아지의 무 운동성 및 apneic 및 생존율 (12)을 낮출 수 마취의 과도 기간을 확인하지 않습니다 자주하기 때문에 신생아의 상태를 확인합니다.

2. 개흉술

  1. 수술 벤치 탑 지역에 얼음 침대에서 강아지를 전송하고 앙와위에서의 팔, 다리, 꼬리를 고정하는 테이프를 사용합니다.
  2. betadine을 사용하여 가슴을 소독하고 부드럽게 70 % 알코올 준비 패드를 사용하여 청소합니다.
  3. 스프링 Vannas 가위를 사용 흉강의 항 늑간 영역을 따라 횡 피부 절개를하고 심장에 대한 액세스를 용이하게하기 위해 기재된 늑간 근육을 무디게 절개.
    참고 : 혈액 손실이 수술 과정에서 최소화 될 때 생존율을 향상시킬 수 있습니다.

심장 심실 에이펙스 3. 수술 절단 수술

  1. 손으로 부드럽게를 외면 화하다하기 위해 복부에 압력을가마음의 정점. 명확한 시각화를위한 멸균 면봉 어플리케이터와 외과 영역의 주위에 피를 흡수한다. 가짜 운영 제어 신생아의 경우, 4 (봉합 및 마우스의 복구) 단계로 직접 진행합니다.
  2. 돋보기 램프와 가위를 사용하여 홍채 절제술에서 부드럽게 LV 실이 노출 될 때까지 좌심실 (LV)의 단편적인 절제술을 수행합니다. LV의 절제 부분을 최소화하기 위해주의해야합니다. 약 15 %의 절제는 LV 챔버의 최적의 노출을 달성 할 필요가있다.
  3. LV 실이 노출되면 심장이 흉강에 반환해야합니다.

4. 봉합 및 마우스의 복구

  1. 멸균 프롤린 6-0 봉합사를 사용 흉강을 함께 밀봉 립과 근육을 봉합 한 후 조심스럽게 피부 접착제를 이용하여 피부 절개 부위를 닫는다.
  2. 복구 ~ 3 분 동안 가열 램프하에 신생아를 따뜻하게 한 후 70 % 알코올을 준비 사이클로 작업하기 전에 패드를 사용하여 혈액과 접착제 흔적을 깨끗하게그 한배 새끼에 재 소개 재. 어머니로부터 분리 소요되는 시간을 최소화하는 것이 치근단 절제술 후 강아지의 생존을 향상하기 때문에 10 분 이내에 전체 수술 절차를 완료하려고합니다.
  3. 각각의 수술 후, 완전한 살균 약 20 초 동안 뜨거운 구슬 살균기의 구슬과 접촉 수술 도구를 배치합니다. 수술 도구는 각각의 수술 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  4. 쓰레기의 모든 새끼에 대한 수술을 완료 한 후, 어머니의 둥지로 돌아 오기 전에 어머니의 침구와 배설물로 새끼를 섞는다.
    참고 : 일반적으로, ICR / CD-1 마우스는 더 나은 위탁 C57BL / 6보다 어머니,하지만 심지어 같은 유전 적 배경의 간호 어머니 사이는, 육성 본능에 따라 다릅니다. 간호 어머니를 변경하면, 산모의 잠식에 의해 사망​​률을 감소 간호 어머니 P0 새끼를 제거한 다음 (P1)에 혀끝의 절제술을 수행 할 필요가있는 경우. 만 허위 조작이나 혀끝의 연구를 수행새끼의 한 쓰레기에서 esection, 혼합 가짜 수술 새끼가 새끼 6 수술 군의 생존율을 감소 할 수 있기 때문이다.

5. 수술 후 분석

  1. 하루 수술 후, 새끼를 모니터링하고 가짜 수술 군 간의 차이가 없다는 것을 확인하고 생존율을 측정하는 새끼의 개수를 카운트. 수술이 적절하게 수행되는 경우, 생존율은 가짜 수술 군 모두에서 유사한 60 % 이상이어야한다.
  2. 심장 격리 및 고정.
    1. 일 1에서 새끼 자궁 전위에 의해 사망​​ 보장과 이산화탄소에 의해 참수하고 21 일 후 수술을 통해 2 후 수술을 안락사, 다음 70 % 알코올 준비를 사용하여 가슴을 청소합니다.
    2. 가슴의 중간 선 피부와 근육을 절개 한 후 가슴을 엽니 다.
    3. 흉강에서 전체의 마음을 절제하고 4 % 파라 포름 알데히드의 O / RT에서 N 5ml에 각 샘플의 전체 마음을 고정한다.
  3. 다음날, 70 % 에탄올로 샘플들을 전달. 샘플은 파라핀 삽입하기 전에 일주까지 저장할 수 있습니다.
  4. 슬라이스는 5 μm의 두께의 파라핀 전체 심실을 통해 섹션과 회생 응답 5, 7을 검토 표준 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 메이슨의 트리 크롬 염색을 수행한다. 특히, H & E 염색은 근육의 교체를 검토하는 데 사용되며 메이슨의 트리 크롬 염색이 사용됩니다 섬유 성 반응 (5)을 조사한다.
  5. 관심의 영역을 선택하여 수동으로 슬라이드 스캐너를 사용하여 샘​​플 당 적어도 세 초점을 설정합니다. 이미지 및 디폴트 매개 변수와 제조자의 지시에 따라 40 × 배율에서 염색 슬라이드를 분석한다.

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결과

마우스 새끼는 1, 2, 이십일일 후 치근단 절제술을 안락사시키고, 그들의 마음을 H & E 및 메이슨 트리 크롬 염색의 수집 하였다. 메이슨의 트리 크롬 염색 블루 색상은 심 외막 세포 외 기질 (5)의 증착을 나타냅니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이 성공적인 치근단 절제술, 혈병을 효과적으로, LV 일일 후 치근단 절제술을 밀봉하도록 형성된다. 혈액 응고 초기 심장 섬유화의 점진적인 흡수가 관찰되고, 심근의 완전한 재생이 이십일일 치근단 절제술 후 (그림 1B 및 C)를 배치한다 때까지 심근 조직으로 대체가 발생합니다. 형태 학적 분석은 이십일일 수술 후 (그림 1C와 D)에서 절제와 가짜로 작동하는 마음 사이에 차이점을 보여줍니다.

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토론

심장 재생은 심부전의 치료 및 예방 가능성을 보여줍니다1, 2. 동물 모델은 필수 불가결하며 심장 재생이 어떻게 발생하는지 이해하는 데 중요한 역할을 합니다3-6. 많은 양서류와 어류는 부상에 대한 반응으로 심장 조직을 재생하여 인간 심혈관 질환에 대한 이해에 대한 통찰력을 제공합니다13, 14. 그러나 진화 측면에서 병태생리학은 마우스 모델과 인간 사이에서 더 보존되어야 합니다. 포유류 동물 모델의 심장 재생은 심부전 치료에 대한 비교적 새롭지만 급성장하는 연구 분야입니다3-6.

최근 신생아 마우스의 심장 재생 연구에서 정점 절제술과 심근경색술이라는 두 가지 외과적 접근법이 확립되었습니다6. 치근단 절제술은 심근 세포의 손실 및/또는 손상에 대한 비교적 쉽고 직접적인 모델을 제공하지만, 심근경색에 비해 치근단 절제술의 주요 한계는 높은 사망률로 인해 이 수술 방법을 P7 이상으로...

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공개 사항

이 기사에 대한 출판 비용은 박사 지앤 허우에 파인 과학 도구의 선물 후원했다.

감사의 글

저자는 박사 감사합니다. 제임스 호킨스, 국립 심장, 폐에서 즈 - 사이 유와 법사 숨어 및 마우스 수술 준비와 파라핀 섹션의 염색과의 도움을 혈액 연구소 (NHLBI). 저자는 편집 지원에 대한 NIH 휄로우 편집위원회에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가위가 있는 Olsen-Hegar 바늘 홀더, 1.5mmFine Science Tools12002-12
Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-03홍채 절제술 가위
핫 비드 살균기Fine Science Tools18000-45
홍채 집게, 직선, 톱니 모양의Fine Science Tools11064-07
홍채 집게, 곡선, 톱니 모양의정밀 과학 도구11065-07
시어 가위 - 곡선/둔기/12cm정밀 과학 도구14105-12
원형 핸들 봉합사 묶는 집게, 직선미세 과학 도구18025-12
원형 핸들 반나스 스프링 가위정밀 과학 도구15400-12
미세 지혈정밀 과학 도구13007-12
확대Luxolamp CorpIM120 
난방 램프Brandt Equipment llc51152/3
6-0 Prolene 봉합사Ethicon8889H
피부 접착제-Vetbond 조직 접착제 3M 1469
멸균 면 팁 애플리케이터Dynarex4305
WEBCOL 알코올 준비 패드Covidien6818중간 2 PLY, 200/BOX, 70% 이소프로필 알코올
큐리티로 포화 다목적 스폰지Covidien9024비직물 4 PLY, 4"x4" (10.2cm× 10.2cm)
벤치탑 보호시트KIMTECH SCIENCE754618" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% 염화나트륨, 250ml호스피라NDC 0409-6138-22
Betadine 솔루션 SwabsticksPurdue Products LPNDC 67618-153-03
오토클레이브TOMY 디지털 생물학SX-700고압 증기 살균기
슬라이드 스캐너HAMAMATSUNanoZoomer 2.0-RS
등

참고문헌

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