신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

요약

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

초록

척수 손상 (SCI)는 일반적으로 특히 척수는 뇌에서 내려 섬유에 손상을 통해 파괴적인 신경 학적 결손이 발생합니다. 연구의 주요 전류 영역은 SCI 다음과 같은 자연 또는 유도 기능 회복의 기초가 적응 가소성의 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 자연 기능 회복은 척수가 개발로 어떻게 적응 가소성의 변화에​​ 대한 흥미로운 문제를 제기, 인생에서 더 이른 것으로보고있다. 이 역동적의 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 신생 마우스의 SCI 모델을 개발 하였다. 이 모델은 너무 적은 연구되고 소아 SCI에 대한 관련성을 가지고있다. 성인의 신경 가소성은 어린 시절 ^일에 신경 가소성과 같은 메커니즘의 일부를 포함하기 때문에,이 모델은 잠재적으로 성인 SCI에 대한 일부 관련이있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스에 재현 척수 압축 (SCC) 부상을 생성하는 전체 과정을 설명일찍 출생 후의 (P) 날로 1. SCC가 주어진 척추 수준에서 추궁 절제술을 수행함으로써 달성된다 빠르게 압축 및 척수의 압축을 수정 Yasargil 동맥류 미니 클립을 사용하여 다음과 (여기 흉부 레벨 9-11에서 설명) . 전술 한 바와 같이, 부상 신생 생쥐 행동 결손 시험 또는 전기 생리 학적 및 높은 처리량 광 기록 기술을 사용하여 ^하나의 시냅스 연결의 생체 생리 학적 분석을 위해 희생 될 수있다. 행동 및 생리 학적 평가를 사용하여 이전 및 지속적인 연구 2 주 이내에 완전한 기능 회복 다음에 사지의 운동의 극적인 급성 손상 및 시냅스 연결 ^{한 내림차순} 식별 된 수준에서 기능 회로의 변화의 첫 번째 증거를 증명하고있다.

서론

지난 10년 동안 다양한 척수 손상(SCI) 모델에서 얻은 증거가 증가함에 따라 척수 네트워크가 기능 회복에 기여하기 위해 자발적으로 재조직될 수 있음을 보여주었습니다^1-9. 그 결과 적응 가소성은 SCI 연구에서 중요한 주제가 되었습니다. 가소성은 보존된 축삭돌기의 재성장, 새로운 축삭돌기 담보의 발아 및 새로운 시냅스 연결의 형성을 포함하는 것으로 나타났습니다. 이 지식의 대부분은 성인 동물을 대상으로 한 행동 또는 해부학 연구에서 얻은 것입니다. 성인 척수 검사의 중요한 한계는 고처리량 생리학적 평가를 수행하기 어렵다는 것인데, 이는 신생아 준비에서 더 쉽습니다¹. 한 가지 주요 차이점은 성인 뇌간과 척수의 전체 산외 생체 외 제제는 생존력이 낮다는 것입니다. 또 다른 하나는 성인 척추 조직은 더 두껍고 수초화되어 있기 때문에 빛에 더 불투명하다는 것입니다. 최근 생체 내 이미징(예: ^10-12 참조)의 발전으로 이러한 문제를 부분적으로 극복할 수 있지만, 주어진 뇌간-척수 준비를 따라 여러 부위에서 원하는 배복부 깊이에서 높은 처리량의 이미징을 수행할 수 있는 가능성은 현재 신생아에서만 가능합니다. 신생아 척수에서 축삭돌기 수초화의 미성숙 상태는 고처리량 생체 외 광학 기록을 용이하게 하여 기능적 시냅스 연결의 동적 평가를 가능하게 합니다^13-17. 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터와 광유전학적 자극 및 약리학 도구와 결합된 광학 접근 방식은 적응 가소성의 기저에 있는 메커니즘을 더 깊이 이해하는 데 기여할 수 있습니다.

모든 척수 손상의 1-10%가^18-22세의 유아와 어린이에게 영향을 미치는 것으로 추정됩니다. 성인 SCI와 대조적으로, 소아 SCI의 발병 기전과 자발적 회복 가능성은 연구가 적다. 따라서 신생아 SCI 모델을 사용하면 소아 SCI에 대한 더 많은 통찰력을 제공하고 관련된 병리학 및 회복 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 더욱이, 성인 척수의 기능적 회복을 지원하는 SCI 후 가소성은 축삭 성장, 분지 및 새로운 시냅스^{형성 23-26}과 같은 중추 신경계의 발달을 지배하는 동일한 메커니즘을 적어도 부분적으로 포함하는 것으로 여겨집니다. 따라서 신생아 SCI 모델을 사용하면 성인 척수에서도 작동하거나 성인 척수에서 잠재적으로 복원될 수 있는 메커니즘(예: 태아 세포나 조직 또는 만능 줄기 세포에서 새로 구성된 조직의 이식)에 대한 중요한 통찰력을 제공하여 회복을 촉진할 수 있습니다.

>jove_content<따라서 신생아 마우스는 척수 손상 후 적응 가소성을 조사하기 위한 통합적이고 다중적인 방법론적 접근 방식을 위한 플랫폼을 제공하며, 여기에는 행동학적, 생리학적, 해부학적, 분자적 및 유전적 방법의 조합이 쉽게 사용될 수 있습니다. 표준화된 신생아 부상 모델을 수립하는 것은 이러한 연구를 시행하는 데 있어 중요한 단계입니다.

프로토콜

이 실험 프로토콜이 국립 동물 연구에서 노르웨이 당국에 의해 승인되었습니다 (Forsøksdyrutvalget, 현지 실험 승인 번호 12.4591) 유럽 연합 (EU)의 동물 관리 규정에 따라 (연맹 유럽 실험 동물 학회). 노력은 사용되는 동물과 이들의 고통 수를 최소화 하였다. 이 글에서 출생 (P) 일 1 야생형 ICR (각인 제어 영역) 마우스 (잭슨, USA)에 사용 된 절차에 대해 설명 되나 동일한 방식은 나중 단계에서 사용될 수있다.

1. 마우스 신생아 용 가스 마취 시스템을 구성 (도 1)

1. 주사기의 끝에서 코 마스크를 구축 할 수 있습니다. 플라스틱 튜브 (- 빨간색 튜브도 2A1 그림 1)과 3 방향 스톱 콕이 연결합니다.
2. 코 마스크의 측면에 작은 구멍을 뚫어 가스로부터의 오버 플로우를 제거하기 위해 플라스틱 배관이 연결마스크. 튜브 하나에 약간의 부압에 대해 설정된 진공 펌프에서, 또는 흄 후드 (- 밝은 녹색 튜브 그림 1)에서를 종료합니다.
3. 150mm X 25mm 플라스틱 페트리 접시 (그림 2A2)에서 마취 챔버를 확인합니다.
   1. 한 측면에서, 마우스의 머리와 코 마스크를 수용 할만큼 충분히 큰 구멍을 만든다.
   2. 반대편에 코 마스크에서 플라스틱 튜브가 삽입 될 수있는 두 개의 작은 구멍 (- 각각 적색 및 녹색 밝은 튜브,도 1)을 만든다.
   3. 뚜껑의 상단에 세 번째 구멍을 만들고 여기에 진공 펌프 (그림 1 - 진한 녹색 튜브)에서 종료 제 플라스틱 튜브를 연결합니다. 이 제 튜브의 목적은 코 마스크로부터 출구에 의해 포착되지 않은 임의의 잉여 가스가 제거되도록한다.
4. C만큼 큰 것을 실험실 접시 모든 종류의 바닥에 구멍을 만들어 수면 챔버 빌드마우스 ontain 및 평활 심지어 에지를 갖는다 (접시의 개구는 가스의 누출을 방지하기 위해 테이블​​이 놓여 플러시 함). 플라스틱 튜브 (- 갈색 튜브 그림 1)과 3 방향 스톱 콕에 챔버에 구멍을 연결합니다. 흄 후드 슬립 챔버를 놓습니다.
5. 기화기 (- 노란색 튜브도 2A3 그림 1)에서 배출 튜브에 3 방향 꼭지를 연결합니다.
6. 산소 공급 (- 파란색 튜브 그림 1)에 기화기의 입구를 연결합니다.

압축 도구를 만들기 위해 Yasargil 임시 동맥류 미니 클립 2. 변경 (그림 2, 표 1)

1. 클램프와 스탠드에 단단히 클립을 부착합니다. 선명 돌을 이용하여 약 150 ㎛의 최종 두께에 각 클립의 블레이드의 팁의 외면을 접수 시각 제어 양안 확대경을 사용하여 드릴 (도 2B와 C)에 탑재.
2. 마이크로 나이프 (표 1)를 사용하여 실체 현미경 폴리에틸렌 모세관 튜브 (표 1)의 짧은 신장을 절단하여 클립 스토퍼 확인하고, 블레이드의 하나의 이러한 배치 (도 2A4 및도 2B와 C도). 이 클립의 전체 폐쇄를 방지하고 표준화 된 압축 치수를 작성합니다. 클립이 닫히면 interblade 거리는 약 230 μm의 것이다. interblade 공간을 변경할 것이다 사용하는 동안 압축 할 수있는 폴리에틸렌 소재, 각 실험에 대한 새 스토퍼를 확인합니다.
   주 : 클립의 스프링 장력은 시간이 지남에 따라 감소 약 80 압축 이후 클립이 더 이상 상기 스토퍼를 완전히 폐쇄하고 교체해야되도록.

수술 3. 준비 이전

1. (그림 2a에 나타낸를 슬립 챔버 (그림 1)에 마우스를 놓고 4 % 이소 플루 란으로 마취를 시작 ) 기화기 (도 2A3 및 표 1)을 사용하여, 순수 산소에서 기화.
2. 부드럽게 얇은 플라스틱 집게로 발가락 사이 피부의 웹 곤란하여 마우스의 철수 반사를 테스트합니다. 새로운 태어난 쥐가 쉽게 부상으로 신중하게이 작업을 수행합니다. 즉시 멍이 너무 어려운 결과를 곤란. 진정 작용의 시작 부분에이 시험을 수행하면 반사를 유발하고 필요한 힘의 크기의 좋은 표시를 제공합니다.
3. 반사적가 폐지되면, 잠 실에서 마우스를 제거하고 순수한 산소 (그림 1) 혼합 4 % 이소 플루 란의 지속적인 공급을 제공하는 코 마스크에 삽입 된 주둥이와 운영 테이블에 발생하기 쉬운 위치에 배치합니다. 온난화 패드는 치명적일 수 있습니다 수술 중 저체온증으로 37 ~ 38 ℃로의 전환 및 설정되어 있는지 확인합니다.
4. 완전한 진통을 달성하기 위해, (피하 국소 마취제 부피 바카 인의 50 μl를 주입 2.5 ㎎ / ㎖, 수술 사이트에서 그림 2A6) 9-T11) (여기에서보고 된 실험에서,이 흉부 레벨 (T에서)입니다. 주입을 수행하는 (300 μL, 30 G, 그림 2A7 표 1) 인슐린 주사기를 사용합니다.
5. 1 ~ 2 %에 코 마스크에 전달되는 이소 플루 란 농도를 줄일 수 있습니다.

4. 지느러미 후궁 절제술

1. 미세한 통제하에 수술을 수행합니다.
2. 적어도 30 초 동안 클로르헥시딘 글루코 네이트 (표 1 # 19)로 수술 영역을 청소 한 후, microknife (그림 2A8)를 사용하여 T9-T11에서 1-2mm 가로 피부 절개를합니다.
   주 : 신생아 ICR 마우스의 복부의 입쪽 부분을,이 우유를 포함 볼 때 척추 레벨 T12-T13 (도 3)에 직면하고있다. 또 다른 랜드 마크는 T8-9에 대한 끝나는 흉부 피하 지방 조직 골재의 주동이의 일부입니다. 이 랜드 마크는 피부 절개 후 만 볼 수 있습니다.
3. 사용 포셉 (도 2A9 및 A10)은 (a 매끄러운 직선 상처 생성 피부가 쉽게 찢어) 부드럽게 rostrally와 미부 피부를 당겨 8-9mm에 가로 방향의 피부 개구를 넓혀. 이는 척주 충분한 측면 액세스를 제공한다.
4. 지혈 젤라틴 스폰지 조각 무균 절개 부 (도 1 및 표 2A11) 피하 주동이와 꼬리를 삽입하여 하부 구조로부터 피부 절개 가장자리 후퇴. 이것은 개방을 확대하고 후퇴 및 수술시 영역을 왜곡으로부터 피부를 방지 할 수 있습니다. 지혈 젤라틴 스폰지는 사용하기 전에 식염수에 담가 할 필요가 없습니다.
5. 척추를 노출 얇은 위 (도 2A12, 표 1)를 사용하여 척추 주위 근육 해부. 척추에 근육의 첨부 파일을 잘라 라미 (그림 4A)를 노출합니다. 아니전자는 또한이 단계에서 척추 과정은 저개발이다.
6. 정중선을 확인하고 얇은 가위 (그림 4B)와 (이 단계에서 연골입니다) 두 라미 사이에 횡 방향으로 잘라. 조심스럽게 얇은 판과 경질 (그림 4C) 사이의 얇은 집게 중 하나 블레이드를 배치, 포셉으로 얇은 판을 잡고 조각을 그대로 두라 (그림 4D)을 떠나 멀리 휴식 때까지 조심스럽게 들어 올립니다. 1-2 세그먼트 긴 추궁 절제술을 얻기 위해이 2 ~ 3 번 반복합니다.
7. rongeurs 같이 얇은 집게를 사용하여 척추 도관 내에 클립을 배치 할 충분한 공간을 확보하기 위해 좌우 추간 관절의 부분을 제거한다. 외과 영역을 청소하고 지혈 젤라틴 스폰지의 작은 조각으로 출혈을 제어 할 수 있습니다.

5. 척수 압축 부상

1. 클립 홀더 수정 된 동맥류 미니 클립을 엽니 다 (그림 2A13 그림 2B) 및 장소 일패싯 조인 사이의 공간 및 코드의 척수의 양쪽에 전자 블레이드. 블레이드는 척수의 복부 부분에 영향을 깊게 충분히 삽입되어 있는지 확인합니다. 이것이 가능하지 않으면,면 관절 이상을 제거한다.
2. 미끄러지는 것을 방지하기 위해 클립 홀더와 장소에 들고, 빠르게 미니 클립을 해제합니다. 15 초 동안 압축을 유지한다.
3. 빠르게 미니 클립을 열고 제거합니다. 종래 (제 15 초 압축 반대 방향으로 클립을 재배치, 미니 클립의 방향을 반대로하고, 기준으로 제 1 압축에서 출혈성 부종 이루어지는 쉽게 볼 마크를 사용하여 대칭 압축을 달성하기 위해, 하나의 압박이없는 ^일을 반면 실험)이 대칭 조직 학적 및 생리 학적 적자를 생성하는 것으로 나타났다. 경질은 압축에 의해 손상되지 않아야한다.
4. 지역을 청소하고 지혈 젤라틴 스폰지의 조각 지혈을 유지한다.
5. 수술 시작시 피부 절개 가장자리하에 넣었다 지혈 젤라틴 스폰지 조각을 제거하고 6.0 멸균 봉합사와 바늘 홀더 (2A14도 15)과 피부 절개를 닫는다.
6. 피하 주사는 0.75 ㎎ / ㎏ 체중 부 프레 놀핀 인슐린 주사기 (300 μL, 30 G)를 사용하여 멸균 PBS에 희석 (도 2A16).

6. 수술 후 케어

1. 코 마스크에서 마우스를 제거하고 마취 기운이 떨어지기와 마우스 (1-3 시간은 일반적으로 충분합니다) 경고가 될 때까지 30 ° C에서 온도 제어 챔버 세트에 넣습니다.
2. 복강 내 어머니 (8g / kg 체중)에 다이아 제팜 (그림 2B17)를 주입한다. 이것은이 위험이 높은 경우, 첫 번째 밤 동안 고기를 먹는 풍습의 위험을 감소 무기력을 만듭니다.
3. 쓰레기로 운영 마우스를 돌려줍니다.
4. 쓰레기가 난 경우ARGE (> 12 새끼) 우유에 대한 경쟁을 감소시키는 작동이되지 않는 일부의 새끼들은 크기가 다를 경우, 우선적으로 큰 동물을 제거한다. 쓰레기 크기가 약 9 새끼 경우 운영 새끼의 모성 보호는 ICR 라인에 가장 적합합니다.
5. 통증 관리를 들어, 인슐린 주사기 (300 μL, 30 G)를 사용하여, 제 수술 일 동안 부 프레 놀핀 (0.75 ㎎ / ㎏ 체중)을 피하 하루에 한 번 투여. 피하 주사에 적합한 부피는 30 내지 50 μL이다. 신생아 쥐의 발성과 동요에서 고통의 좋은 지표이다.
6. 영양, 체중, 탈수, 통증, 상처 치유, 소변 보유 감염 상태를 평가 점수 시트를 사용하여 손상된 생쥐 매일 검사를 수행한다. 얻은 점수에 따르면, 이러한 비정상적인 영양의 경우에는 멸균 소아 영양 용액 (표 1 # 18)의 주사로, 특별한주의를 제공합니다. 또한 점수 시트0; 인도 엔드 포인트의 기준을 정의합니다. 부상당한 새끼를 거부하지 않는 어머니는 최고의 교사이다.
7. 기능이 복원 될 때까지 방광 기능 장애의 비정상적인 경우, 하루에 두 번 방광 마사지를 수행합니다. 이것은 한 손에 부정사 위치에 마우스를 놓고 손가락을 사용하여 rostro - 꼬리 방향으로 부드럽게 낮은 복부를 마사지하여 수행됩니다.

결과

척수 압축 부상 및 기능의 상실

수술 전, 수술 및 수술 절차를 최적화함으로써, 상술 한 바와 같이, 신생 마우스의 재현성 압축 SCI 모델 ^(1)을 얻을 수있다. 클립 (도 2B와 C) 중 하나의 블레이드에 놓여진 폴리에틸렌 스토퍼 클립의 완전 폐쇄를 방지하며, 약 230 ㎛의 일관 상호 블레이드 간격을 유지한다. 조직 학적 후유증 판단 같이 대칭 부상 개의 압박 결과 사이에서 클립의 방향을 반전 (도 5a 및도 ^1). 바로 미니 클립 제거 후, ​​압축 척수 조직 출혈성 타박상과 부종으로 인해 어두워집니다. 에오신과 헤 마톡 실린 이미 일일 A의 스테인드 부상 척수의 직렬 섹션의 관측병변 진원지 (그림 5A)를 접근 할 때 따고 부상은 조직의 점진적 저하를 보여준다. 병변의 척수 공동의 존재 또는 피가 드문 일이 아니다.

행동 평가는 수술 후 담지 상태를 비 중량 하에서 몇 시간 뒷다리 궤적을 추적하여, 예를 들어 단지 절제술이 수행되는 허위 대조군에 비해 SCC 부상 마우스 뒷다리 운동의 극적인 손상을 나타낸다 (도 5b 및도 ¹⁾ . 마우스가 자중 ^{한 베어링이} 필요한 다른 행동 검사를 수행 할 때까지이 테스트는 반복 될 수있다.

수술 후 사망률 및 복구

수술 사망률은 가사 충분한 anesthesi를 달성하는 데 필요한 이소 플루 란의 높은 농도로 인한 심장 마비에 주로 기인에이. 수술 프로토콜에 국소 마취제 부피 바카 인을 소개하면 이소 플루 란 농도의 감소를 가능하게하여 크게 사망률 감소. 20 개 이상의 동물을 포함하는 최근의 실험 시리즈에서 수술 사망률은 전무했다. 대조적으로, 수술 후 생존 주로 어미 의해 조작 된 마우스의 수용에 의해 영향을 받는다. 중요한 개선은 불안과 공격성이 쓰레기 ^1로 운영 쥐를 반환하기 전에 어머니에게 다이아 제팜 (IP 8g / kg 체중)의 단일 주사를 제공함으로써 감소 될 때 발생했습니다. 조작 된 생쥐의 수용과 수술 후 회복이 위장에서 우유의 존재에 의해 모니터링 할 수 있습니다. 술 취한 우유가있는 P1-P7 마우스의 위는 복부 피부 (그림 3)을 통해 명확하게 흰색과 볼 수 있습니다. 운영, 가짜 제어 및 작동이되지 않는 쥐에 먹이의 비교는 부상에서의 영양 상태를 평가하는 데 유용합니다D 마우스. 작동이되지 않는 마우스에 비해 동작의 성장을 평가하여 (도 6) 제 수술 후 하루 동안 약간의 체중 감소에도 불구하고, 작동 마우스의 성장 곡선이 빠르게 정상화 후 보여준다. 방광 기능 장애 또는 감염과 관련된 사망은 한 7로 주 동안 공부 마우스에서도 관찰되지 않았다.

도 수. 이	이름	제조 / 제공	참조 #	링크			논평
1	플라스틱 주사기 (30, 50 mL) 중
이	플라스틱 페트리 접시 (150 × 25 ㎜)
삼	FORTEC 이소 플루 란 기화기	Cypra네브라스카		http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/			우리는 사용 및 생산 중 오래된 장치는 새로운 장치에 대한 링크를 확인
도 4a	Yasargil 임시 동맥류 미니 클립	AESCULAP	FE681K	http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
(b)	미세 구멍 폴리에틸렌 모세관 튜브 ID 0.58 mm, 외경 0.96 mm	스미스 의료	800/100/200	http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
(5)	이소 플루 란 (Forene)	애보트 GmbH & Co. KG에		http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6	Marcain (부피 바카 인)	아스트라 제네카		http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
(7)	인슐린 주사기 0.3 ml의 30 G의 X의 8mm	VWR	80086-442	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8	초 미세 마이크로 칼 5mm 절삭 날	파인 과학 도구	10315-12	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 캣 & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9	엑스트라 파인 Graefe 씨의 집게 - 0.5 mm 팁	파인 과학 도구	1천1백53에서 10 사이	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 캣 & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1			정말 필요하지, 종종 치아가 너무 큰
(10)	집게 SUPERGRIP 스트레이트	파인 과학 도구	00632-11	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 캣 & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1			두 집게가 필요합니다
(11)	Spongostan 특별 70 × 50 X 1mm	Ferrosan
(12)	Vannas 스프링 가위 - 2mm 블레이드 스트레이트	파인 과학 도구	15000-03	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= 캣 & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
(13)	바리오 클립 적용 집게	AESCULAP	FE502T	http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
(14)	Vicryl 60 (Ethicon는)	존슨과 존슨	J105G
(15)	Diethrich 마이크로 바늘 홀더		11-510-20	http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
(16)	Temgesic (프레 노르 핀)	쉐링 - 플라 우
(17)	Stesolid (다이아 제팜)	ACTAVIS					또한 발륨로 알려진
(18)	Pedamix	FRESENIUS 카비		http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernæring/parenteral-ernæring
(19)	Klorhexidinsprit (클로르헥시딘 글루코 네이트)	FresenIUS 카비	D08A C02	http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

신생아 마우스의 클립 기반 척수 압축 부상을 생성하기위한 도구 및 장비 표 1. 목록.

마취 설정 그림 1. 도식.이 회로도는 초기 마취 및 수술 동안 계속 마취 코 마스크 장치의 수면 챔버와 신생아 마우스 디자인 마취 설정을 제공합니다.

그림 2. 주요 도구 및 압축 클립. (A) 절차를 수행하는 동안 사용되는 도구. 숫자는 표 1. (B 및 C)을 수동으로 약 150 ㎛의 두께까지 트리밍 된 각 블레이드의 선단부와 Yasargil 임시 동맥류 미니 클립에 사용되는 특수 효과에 해당한다. 폴리에틸렌 튜브 (표 1)의 조각으로 이루어지는 스토퍼 클립의 완전 폐쇄를 방지하기 위해 블레이드들 중 하나에 배치된다. 스케일 바 : 2mm. 응용 프로그램 : 클립 어플리케이터 (A에서 # 12); 세인트 :. 스토퍼 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신생아 ICR 마우스의 척추 수준의 수술 전 평가를위한 그림 3. 랜드 마크. (가)의 흰 우유와 P1 ICR 마우스의 측면보기 tomach. 위의 주동이의 부분은 T12-T13 척추 수준에 해당합니다. (B)가 발생하기 쉬운 위치에 마취하에 P1 ICR 마우스입니다. (A)보다 시각화하기 어려운 있지만, 우유 가득 위는 인식이다. 위의 주동이의 부분은 T12-T13 척추 수준을 나타냅니다. 스케일 바 : 0.5 cm.

척추 주위 근육의 그림 4. 지느러미의 추궁 절제술. (A) 해부. 이 나이에 척추 프로세스가 낙후되어 있습니다. 얇은 가위로 얇은 판의 (B) 횡단 절편. 라미와 경막 사이에 얇은 집게 중 하나 블레이드 (C) 소개. 진입 점은 화살표로 도시된다. (D) 라미의 제거. 스케일 바 : 2mm.

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그림 5. 조직 학적 및 P1에서 척수 압축 부상 후 행동의 결과. (A) 부상 진원지에서 다른 거리 (손상 후 1 일) 부상 마우스에서 척수 섹션 에오신과 헤 마톡 실린 염색. (B)는 앞다리와 뒷다리 궤적 주제 흔적 손상 후 또는 가짜 제어 절제술 후 6 시간 동안 관찰 하였다. 상단에 흔적 동물의 측면도에서 볼 궤적을 나타냅니다. 하단 흔적 동물의 복부 측면에서 볼 궤도를 나타낸다. 도 ^1을 참조하십시오. 스케일 바 : 250 μm의. DH : 지느러미 혼; L, 왼쪽; R : 오른쪽; SCC : 척수 압축; VH :. 복부 혼 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

생후 9 생후 1 일부터 작동이되지 않는 상태 및 SCC 부상 마우스의 체중 증가를 도시 한도 6, 비교 성장 곡선. 히스토그램.

토론

이 기사에서는 P1 마우스의 클립 생성 된 SCC 부상에 대한 절차를 설명한다. 동일한 방법은 후기 단계에서 수행 될 수있다. 압축 부상 P5, P7, P9 및 P12 (Züchner, 등., 준비 원고)에서 성공적으로 수행 하였다. 모든 출생 후의 단계에서, 전신 마취는 순수한 산소에서 기화 이소 플루 란으로 얻을 수 있지만, 마취 결과는 나이에 크게 의존한다. 국소 마취를 프로토콜에 도입되기 전에 P1-P4의 초기 시도에있어서, 그 부족의 진정 및 과다 간의 좁은 투여 효과 창 깊고 장기간 진정을 얻기 어려웠다. 또한, 신생아 동물의 이소 플루 란의 신경 독성 효과에 관한 우려가 ^{27-30 제기되고있다.} 이소 플루 란의 조합 깊고 더 안정 마취에서 국소 마취제 부피 바카 인 결과 2-3의 인자에 의한 이소 플루 용량 감소를 허용하면서. anesthe의 종류SIA는 ^31,32 cryoanesthesia 포함 신생아 설치류 설명되었지만 cryoanesthesia 하나 전위 불편 효율적이고 재현 손상의 발생을 어렵게 할 수 ^(33,34 검토)의 신경 보호 효과가있다. 바르비 투르 산염 계 마취 인해 성인의 ^{35, 36에} 비해 혈청 알부민 및 체지방의 낮은 수준으로 신생아 마우스에서 낮은 효율을 갖는 것으로 간주된다.

매우 침습적 외상성 비록 수술 절차 동안 사망률 설정되면 낮다. 그러나, 운영 마우스의 회복과 생존을 개선하기 위해 특별한주의가 필요한 절차를 수행하는 동안 중요한 단계가 있습니다. 한 가지 중요한 문제는 수술을 살아남을 수있는 가장 좋은 기회를 가질 것입니다 새끼를 선택하는 것입니다. 쓰레기가 크면 개별 새끼의 영양 상태가 변한다. 수술시에 발생하는 불가피한 출혈에 더하여, 동작 새끼는 시간을 소비멀리 어머니에요, 그들은 종종 다음날 아침 전에 우유를 마시지 않는다. 따라서 그것은 이미 위에서 우유의 특정 양이 새끼를 선택할 수있는 장점이다. 이 P0에서 P7에 복부 피부를 통해 쉽게 볼 수 있습니다.

첫 번째 밤 동안 운영 강아지는 어머니에 의해 잠식되는 큰 위험에 있습니다. 더 조작 쥐의 절반 이상이 모델의 초기 개발 과정 케이지 혈액의 명확한 징후, 다음 아침에 실종되었다. 설치류에서 Necrophagy, 식인 풍습과 영아 살해는 수십 년 ^37-40에 대한 연구되어왔다. 본 연구에서는 식인 풍습은 한 번만 목격했지만, 케이지에 반환 된 새끼가 밤 동안 자연적인 원인에 의한 사망이 불가능한 듯 같은 좋은 형태로 일반적으로 있었기 때문에 necrophagy보다 더 그럴듯한 설명으로 간주되었다. 이 불안과 공격성 ​​나 감소 등 디아제팜으로 가역적 약학 제를 사용하는 아이디어를 프롬프트N ^((41)에 의해 검토) 어머니. 다이아 제팜의 복강 내 주사는 크게 20 % 미만에 60 % 이상에서 첫 밤 사망률을 떨어 뜨리고, 상황을 개선.

수술 후 복귀를 다음 컬링 가능한 쓰레기가 적게 방해에 의해 쓰레기 크기 축소 조작 된 동물을 혜택을 누릴 수 있습니다 추​​가 요소입니다. 그러나 어머니 만 작동 새끼를 떠나는 것은 도움이되지 않습니다. / 운영 작동이되지 않는 새끼의 최적의 균형 라인에 따라 다양하지만, 3-4 작동이되지 않는 새끼와 함께 4-5 운영 새끼 (부상 또는 가짜)를 떠나 ICR 및 SCID-ICR 마우스에 가장 적합한 결과를 제공 할 수 있습니다.

일반적인 의미에서,이 신생아 SCI 모델의 주요 한계는 신생아 척수 성인 SCI 모델로부터 얻어진 것과 비교할 실험 결과를 제공 할 수있다, 따라서 성인 척수에서 많은 점에서 상이하고 있다는 것이다. 이러한 차이는 전체 크기를 포함척수의 부피, 세포 수, 언더 표현 같은 희소 돌기 아교 세포, 미성숙 면역 반응 미성숙 신경 회로와 같은 특정 세포 유형. 이 모델 실험에서 도출 결론 따라서 신중하게 고려되어야한다. 한편,이 모델은 소아 SCI의 상대적 조사 시나리오에 적합하다. 또한, 성인 SCI 모델에 대하여 명백한 약점은 복원 경우 성인 척수 최소 남아 있지만 치료 기질을 나타낼 수 소성 메커니즘의 해명 할 수 있으므로 잠재적 강도도이다. 신생아 또는 배아 상태의 회복이 덜 개발 된 세포 나 조직의 이식을 통해 이전의 발달 특성 성인 조직을 낳다 시약 치료에 의해 구현 될 수 있다고 생각할 수있다. perineuronal 그물을 제거하는 효소를 사용하여 ^{42, 43} 후자의 방법의 일례이다.

SCI에 대한 동물 모델을 확립하는 중요한 문제는 표준화 부상을 얻는 것이다. 이것은 다수의 SCI 모델에서 해결 된 예는, 절개가, 반 절단은, impactors, 장치에 영향을 미치지에 대하여 등 풍선 압축, 집게 호감, 정적 무게 압축,이 방향으로 노력에서 SCI 모델 초래 한 중요한 측면이다 ^((44)에 의해 검토) 등의 속도, 힘과 시간 등의 영향 여러 매개 변수를 조작 할 수있는 성인 설치류. 또 다른 방법은, 더 적은 장비를 포함하는, 커 -로 히드 동맥류 클립 ^(45,46)의 변형을 이용한다. 충돌체 클립을 모방 동시 허혈 어느 정도의와 압축 부상 반면 타박상 부상을 모방 이러한 두 방식은 상호 보완 적이다. 때문에 상당한 크기 제약 및 신생아 생쥐보다 취약성, 높은 사망률이 길어 수술뿐만 아니라 (STABLE)의 비용과 연관된소규모 설비 도상국이를 임팩터 생성 타박상 방식보다는 클립 생성 압축을 개발하기 위해 선택되었다. 이 신생 쥐 ^1의 척주의 크기를 수용하기 위해 시판 동맥류 미니 클립을 채택함으로써 달성되었다. 스토퍼를 추가하는 것은 표준 압축 폭을 보장하고 긴 클립의 장력이 상기 스토퍼의 한계까지 압축으로 최소 폭의 고정 단계에서 압축의 힘이 약간 다를 것이다. 이 수명을 통해 클립 장력의 변화에​​ 따라 달라질 수 있기 때문에 무엇 표준화되지 않은 것은, 동적 단계에서 압축의 속도입니다. 압축의 정적 위상 동적 위상보다 더 오래 지속되고 척수 조직 미니 클립 블레이드 대하여 반력 많이 미치는 것을 제안 거의 존재하므로, 그 부상의 정도가 가장 의존하는 것으로 보인다 정적 단계입니다. 그러나, 이것은 실험 일이다. 해심각도 정적 압축력 및 지속 시간, 압축 및 압축 해제의 속도, 미니 클립의 위치와 동일한 위치에서 수행되는 압축의 개수 등 다양한 요인에 의존 할 가능성이 높다. 따라서, 이러한 매개 변수의 조합 변화는 약한에서 심각한 부상의 심각도의 스펙트럼의 발생 될 수 있습니다. 변화의 가능성에도 불구하고, 우리의 이전에 게시 된 연구 ^1에서 우리는 조직 학적, 생리 학적 및 행동 수준에서 일관된 결과를 얻을 수 있으므로 허용 표준화 달성하기 어려운 제안 거의가있다. 우리는 연구에서 우리는도 5에 도시 된 바와 같이 공기 스테핑 같은 행동 검사를 포함한 각 레벨에서 검증을 여러 방법을 사용했다.

이 신생아 SCI 모델에서 부상이 축삭의 일정 비율을 예비하여 재 modelin을 통해 적응 가소성을 유도하기위한 유리한 상황을 제공합니다스페어 연결 g 및 새로운 회로의 형성. 신생아 마우스가 아니라 많은 실험적인 방법으로 조사에 적합하기 때문에 또한, 행동 검사, 역행 및 선행 성 축삭 추적, 면역 조직 화학, 전기 생리학 및 높은 포함하는 통합적인 접근 방식과 기능 회복 및 적응 가소성을 연구하기 위해이 모델을 사용하는 것이 가능하다 -throughput 광 기록 ^1. 예를 들어, 우리는 생체 wholemount 뇌간의 제제 및 손상된 척수 ¹ 높은 처리량 칼슘 이미징을 사용하여 특정 하강 입력의 레벨에서 네트워크 재 모델링을 설명이 통합 접근법을 이용했다. 이것은 척수 뉴런의 특정 개체군 중 시냅스 연결의 재 형성을 평가하기 위해 신경 optogenetic 및 optogenetic 약학 도구를 사용하여 상기 가압 할 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스틱 주사기(30 또는 50  ml)
플라스틱 페트리 접시 (150 x 25  mm)
Fortec isoflurane 기화기	Cyprane		우리는 생산에서 벗어난 오래된 장치를 사용하고 있으며 최신 장치
Yasargil 임시 동맥류 미니 클립	및 AElig에 대한 링크를 확인하십시오. sculap	FE681K
세밀-보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.58  mm, OD 0.96  mm	Smiths Medical	800/100/200
Isoflurane (Forene)	Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain)	AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3  ml 30  G x 8  mm	VWR	80086-442
초미세 마이크로 나이프 5  mm 커팅 엣지	파인 사이언스 도구	10315-12
엑스트라 파인 그레이프 펜치 – 0.5  mm Tip	Fine Science Tools	1153-10	실제로 필요하지 않습니다, 종종 이빨이 너무 큽
SuperGrip Straight	Fine Science Tools	00632-11	두 개의 펜치가 필요합니다
Spongostan Special 70 x 50 x 1  mm	Ferrosan
Vannas 스프링 가위 – 2  mm 블레이드 스트레이트	파인 사이언스 도구	15000-03
Vario 클립 적용 펜치	Aesculap	FE502T
Vicryl 6– 0 (Ethicon)	Johnson and Johnson	J105G
Diethrich 마이크로 바늘 홀더		11-510-20
Temgesic(부프레노르핀)	Schering-Plough
Stesolid(디아제팜)	Actavis		, Valium
Pedamix	Fresenius로도 알려져 있음, Kabi
Klorhexidinsprit(클로르헥시딘 글루코네이트)	Fresenius 카비	D08A C02