DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

요약

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

초록

성숙한 근육은 살아있는 세포 이미징에 적합한 독특한 구조를 가지고 있습니다. 여기에서는 FDB(flexor digitorum brevis) 근육에서 형광 표지된 단백질을 발현하기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 근육 손상을 최소화하면서 전기천공된 플라스미드를 발현하는 고품질 근섬유를 다수 제공할 수 있도록 조건이 최적화되었습니다. 이 방법은 다양한 단백질에 형광 태그를 사용합니다. 이 발현 방법을 고해상도 컨포칼 현미경과 결합하면 레이저로 인한 손상 후의 이미징을 포함하여 라이브 셀 이미징이 가능합니다. 형광 표지된 단백질의 이미징과 결합된 형광 염료는 근육의 기본 구조와 자극에 대한 근육의 반응에 관한 정보를 제공합니다.

서론

각각의 근섬유가 큰, 매우 조직 세포 융합 세포이다. 근육에 대한 몇 가지 세포 배양 모델이 있습니다; 그러나,이 모델은 완전히 성숙한 근섬유로 분화하지 않는 전공 제한으로있다. 예를 들어, L6 및 C2C12 세포주는 마우스 및 래트 각각 ^1-4로부터 유도된다. 혈청 기아 조건 하에서, 단핵 "근육 모세포 같은"세포 증식을 중단 세포주기 회수를 받아야하고 sarcomeres과 다핵 세포를 형성하는 근육 조직 프로그램에 입력 myotubes라고 함. 장기간 배양 조건으로, myotubes는 수축 특성을 나타낼 수 있으며, 문화의 "트". 인간 세포주는 이제 ⁵ 확립되었다. 이들 불멸화 세포주 이외에, 단핵구는 근육 아세포로부터 myotubes을 형성 할 것이다 혈청 기아 유사한 조건 하에서 분리 될 수있다. 이들 세포주 및 일차 근원 세포 배양 물은 높은 사용 아르FUL들은 플라스미드로 형질 감염 또는 바이러스 형질 도입 및 염기성 세포 생물학적 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있기 때문이다. myotubes를 형성하도록 유도 된 경우에는, 이들 세포는 심지어, 성숙한 근육 조직의 많은 두드러진 특징이 부족하다. 구체적 myotubes 개별 성숙한 근섬유보다 훨씬 작고 근섬유의 정상적인 형상이 부족하다. 비판적으로, myotubes는 가로 (T-) ....

프로토콜

본 연구의 방법은 가이드 라인을 승인 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 노스 웨스턴 대학 파인 버그 학교 (IACUC)와 윤리에 따라 수행되었다. 모든 노력이 고통을 최소화 하였다.

마우스의 굴근 심지 브레비스의 생체 내의 Electroporation (FDB) 근육 번들 1. 실험 절차

1. 포유 동물 세포에서 발현하는 것으로 알려져 프로모터를 사용하여 생체 내 발현을위한 디자인 플라스미드 (예를 들어, 거대 세포 바이러스, CMV) 또는 근육 (예를 들어, 근육 크레아틴 키나제, MCK) ^6,7. 큰 플라스미드는 낮은 수준에서 표현 할 수 있습니다. CMV 프로모터 광범위 ^6,7 사용되어왔다.
2. E.로부터 플라스미드를 정화 대장균은 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 조건을 사용하여. 5 μg의 플라스미드 / μL - 2에서 무균, 내 독소 무료 TE 버퍼에 플라스미드를 녹인다.
3. 희석 및 concentratio에 플라스미드 나누어지는멸균 독소 무료 TE (2 μg의 / μL) 10 μL에서 DNA의 20 μg의의 n은 멸균 microcentrifuge 관에 주입 당 버퍼. ....

결과

전기 효율적으로 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 번들 (그림 1A)로 정제 된 플라스미드 DNA를 소개하는 최소 침습 기술이다. 이레는 형질 전환 형광 태그 단백질은 고립 된 근섬유 (그림 1B)에 가시화 게시 할 수 있습니다. 고립 된 섬유는 도금 공 초점 현미경 이미징에 대 한 준비가되어 있습니다. 섬유 레이저 유도 부상으로 실시 할 수있다. FM 염료 막 손상의 위치를 식별하는 데 사용될 수있다 (도 1C)

소화 과정 중에, 근섬유의 소수 (흰색 화살표) (도 2A)를 손상 될 수있다. 손상된 근섬유는 sarcolemma (검은 색 화살표)에서 막에 blebbing 존재로 식별 할 수 있습니다. 섬유 손상은 또한 실험에 적합하지 않.......

토론

생체 내 형광 태그로 단백질을 연구하는 전기의 사용은 이상적으로 충실히 근육 전체 셀 구조를 복제 적합한 세포주 모델의 부재 주어진 근육의 연구를 위해 적합하다. 이 프로토콜은 레이저 상처 후 단백질 지역화 및 전좌의 상세한 화상을 제공하는 일렉트로 고해상도 공 초점 현미경의 사용률을 설명한다. 이 방법은 세포 골격 재구성, 인신 매매 및 융합을 포함한 다른 세포 과정을 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

FDB 근육 다발 익스프레스 플라스미드 내의 근섬유의 90 %까지,이​​ 프로토콜을 사용하고, 이것은 이전과 이후 모두 분해 근섬유 형광 현미경에 의해 용이하게 알 수있다. 주사 부위에 가깝게 관찰 높은 식 표현의 경사는 일반적으로 존재한다. 때문에 발현 그라디언트, 다양한 단백질 발현의 효과를 모니터링 할 수 아프로엄마 하나의 실험. 모든 형질 전환 방법과 마찬가지로이 방법은 과잉 발현과 관련된 문제에 의해 제한된다. 특히, 높은 수준의 표현으로, 단백질.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Life Technologies	11995-073	해부 매체 희석: 50 ml +100 g BSA
콜라겐 분해 효소, 유형 II	Life Technologies	17101-015	섬유 소화 희석: 160 mg / 4 ml DMEM (재고 40 mg/ml 분취)
Falcon 12-well 접시	Fisher Scientific	877229	섬유 소화
링거 솔루션			섬유 소화 및 이미징 희석: 146 mM NaCl 5 mM    KCl 2 mM    CaCl2 1 mM    MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml 피펫	Axygen	T-1000-C-R	소화
면도날	Personna	94-120-71	소화
정밀 글라이드 30 G 바늘	BD Biosciences	305128	해부
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	해부
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	해부
집게	FST by Dumont	#5/45	해부
집게	Roboz	RS-4913	해부
가위	세계 정밀 기기	500260	해부
BSA	시그마	A7906	해부 매체 희석: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm 접시	Fisher Scientific	08772B	Dissection- 실가드
클레이			전기자극
	잔디	s88x	Electroporation
클램프	라디오 판잣집	270-356	Electroporation
Triadine	Aplicare	82-220	Electroporation
Precision Glide 27 G 바늘	BD Biosciences	305136	Electroporation
시뮬레이터	잔디	SIU-V	Electroporation
거즈	Covidien	2146	전기충격법
히알루로니다아제	시그마	H4272	주입 희석: 160 ul PBS (1x)를 40 &마이크로에 첨가; l 5x 재고
1cc U-100 인슐린 주사기 (28G1/2)	BD Biosciences	329420	주입
Eppendorf 튜브	Fisher Scientific	02-682-550	주입
35mm 유리 바닥 Microwell 접시	MaTek	P35G-1.5-14-C	현미경
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	현미경 희석 : 최종 2.5 ug / ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	현미경 < br/> 희석: 최종 2.5 ug/ml
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