방법 논문

준비 및 시험 독성에 대한 신속한 평가 음주의 물 샘플에 대한 RTgill-W1 세포와 유체 바이오칩을 임피던스 기반

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DOI:

10.3791/53555

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2016년 3월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1U.S. Army Center for Environmental Health Research, 2Nanohmics, Inc.

이 논문에서

요약

이 원고는 무지개 송어 아가미 상피 세포를 사용하여 현장 휴대용 전기 전지 기판 임피던스 센서에 사용하기 위해 유체 바이오칩을 준비하는 방법을 설명합니다. 센서를 사용하여 신속한 음용수 독성 테스트를 실행하기 위한 프로토콜도 설명합니다.

초록

이 원고는 무지개 송어 아가미 상피(RTgill-W1) 세포를 사용하여 현장 휴대용 수독성 센서에 사용하기 위해 유체 바이오칩을 준비하는 방법을 설명합니다. RTgill-W1 세포의 단층은 바이오칩 내에 둘러싸인 감지 전극에 형성됩니다. 그런 다음 바이오칩은 음용수의 신속한 독성 테스트를 위해 설계된 휴대용 전기 셀 기판 임피던스 감지(ECIS) 장치에서 테스트하는 데 사용됩니다. 원고는 제조된 바이오칩을 사용하여 독성 시험을 실행하는 방법을 추가로 설명합니다. 대조수 샘플과 테스트 용수 샘플은 사전 측정된 분말 매체와 혼합되어 바이오칩의 별도 채널로 주입됩니다. 각 바이오칩 채널의 감지 전극에서 임피던스 판독값은 자동화된 통계 소프트웨어 프로그램에 의해 측정되고 비교됩니다. ECIS 기기의 화면에는 샘플 주입 후 한 시간 이내에 "오염 감지됨" 또는 "오염 감지됨 없음"이 표시됩니다. 장점은 인체 건강 문제와 관련된 농도에서 광범위한 무기 및 유기 화학 물질에 대한 사용 용이성과 신속한 응답뿐만 아니라 테스트를 위해 준비된 상태로 저장된 바이오칩의 장기 안정성입니다. 한계는 바이오칩의 냉장 보관에 대한 요구 사항과 콜린에스테라제 억제 살충제에 대한 제한된 민감성입니다. 이 독성 감지기의 응용 분야는 육군 예방 의학 요원에 의한 식수 공급의 신속한 현장 휴대용 테스트 또는 도시 수처리 시설에서 사용하는 것입니다.

서론

전반적인 목표는 ECIS 바이오 센서의 셀 시드, 유체 저장 및 바이오칩의 테스트 방법을 개발 하였다. 이 바이오 센서의 개발 목표는 군인에 의해 사용되는 식수 공급의 오염 가능성을 감지 할 수있는 필드 휴대용 장치에 대한 미 육군 사양을 충족하는 것이 었습니다. 독성 센서 요구 장치가 전계 휴대용 것이 그것이 인간의 건강에 중요한 농도 (시간 이내)이 급속히 독성 산업 화합물의 넓은 스펙트럼을 검출 할 수 및 생물학적 성분의 저장 수명을 가질 것으로했다 적어도 구개월. 부패하기 쉬운 구성 요소가 허용되었다 냉동,하지만, 냉동 없습니다.

역사적으로, (항체, 효소, 또는 핵산 등) 그들에게 생물학적 구성 요소 필드 휴대용 물 테스트 기술은 분석 고유의 1-3이었다. 바이오 센서의 이러한 유형의 단점은 ONL 것입니다Y는 한번에 한 종류의 화학 물질을 검출한다. 이는 하나 이상의 화학 물질이 존재하는 것으로 의심되는 경우에는 다수의 센서가 필요하다. 특정 센서 테스트 레퍼토리에없는 경우 물, 화학적 오염 물질은 쉽게 발견되지 않을 수있다.

광범위한 독성 센서, 다른 한편으로는, 이러한 기술의 갭을 ​​채울 수있는 잠재력을 가지고있다. 이들은 일반적으로 그들 4-8로 휴대 구성 요소가 있습니다. 광범위한 독성 바이오 센서의 장점은 시간 5,9,10 비교적 짧은 기간에서의 혼합물과 미지수를 포함한 화학적 오염 물질의 다양한 배열의 존재를 감지 할 수있다.

또한 전지 셀 기판 임피던스 센서 (ECIS)로 알려져 가능한 독성 센서와 같은 세포 단층의 온 저항의 측정을 사용하는 개념은 제 Giaever 및 Keese 11에 의해 설명되었다. 지난 20 년 동안이 세포 viab의 중요한 지표가 될 것으로 나타났다ility 및 세포 독성. 기본적으로, 바이오칩에 전극에 부착 된 세포 단층 고주파 낮은 전압 및 전류량 교류 신호에 노출된다. 세포의 융합 단층은 전자의 흐름을 방해한다. 세포 단층의 무결성 (예 : 독성 화학 물질이 도입되는 경우와 같이)이 손상되면 ECIS 센서는 전기 임피던스의 변화를 기록 11-14.도 1은 바이오칩에 세포 단층 관련 ECIS의 원리를 도시 .

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그림 1 :.. 단순화 ECIS 리더 전기 회로도와 바이오칩에 세포 단층의 ECIS 그림의 원칙 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우선, 포유 동물 세포주 유체 바이오칩에 접종하고, 여기서 12 바와 ECIS 센서 기술에서 사용되었다. 들이 자주 미디어 변경 요구 제한된 저장 수명을 가지고, 그리고 인공 CO 2 환경과 37 ° C에서 배양 온도를 요구하기 때문에이 세포 그러나 필드 실용화되지 않았다. 그것은 무지개 송어 아가미 상피 세포 (RTgill W-1 세포)에서 유래하는 시판 세포주 주위 CO 2에서 실온에서 테스트 할 수 있다는 것을 발견하고, 바이오칩에서 합류 단층을 형성 냉장 온도에서 저장 될 수도 인체 (12)에 관련된 화학 물질의 농도의 광범위한 스펙트럼에 신속한 응답 (1 시간 이하)였다. 독성에 RTgill-W1 세포의 응용 프로그램뿐만 아니라 기초 연구에서와 같이, Lee 등을 검토한다. (15)

시드, 저장 및 포함 된 유체 바이오칩의 테스트를위한 방법ECIS 바이오 센서의 유체 바이오칩에 RTgill-W1 세포의 단층 여기에 설명되어 있습니다. 유체 바이오칩은 냉장 상태에서 최대 9 개월 동안 저장 될 수 있으며, 별도로 배송되며, 식수 supplies.The 동반 ECIS 리더, 테스트 단위 테스트, 냉장 컨​​테이너에 선적 할 수있다. 바이오칩은 그들에게 두 가지 구성 요소가있다; 두 개의 유체 채널 및 임피던스 검출 용 채널당 네 개의 전극 패드를 포함한 전자 하부 층 상부의 폴리 카보네이트 층을 포함한다. 패드 당 10 작동 전극이있다; 각 전극은 직경 250 μm의입니다. 조립 된 바이오칩은 ECIS 테스트 장치에 삽입 할 때 임피던스 측정을 취득 금 전극 연결이 있습니다. 두 개의 밀폐 된 유체 U 자형 채널 각각. RTgill-W1 세포 현탁액 2 ㎖를 보유이 단일 감지 전극에 합류 셀 배율 ECIS 판독기 유체 바이오칩을 보여준다 할 것이다.

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그림 2 :.. ECIS Reader에서 유체 바이오칩 확대 된 영역이 하나의 감지 전극에 RTgill-W1 세포의 합류 단층을 보여줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

시험 재료 1. 준비

주 : 테스트 용 바이오칩을 제조하기 위해, RTgill-W1 셀의 몇몇 융합 플라스크 준비 할 필요가있다. 바이오칩 (16)가 시딩 될 필요 플라스크 수의 양호한 추정 한 합류 T175 플라스크이다.

  1. 무균 기술을 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (biohood)에서 다음 단계를 수행합니다. biohood과 후드에 배치 된 모든 자료를 소독 70 % 에탄올을 사용합니다.
    1. 피브로넥틴의 1 mg의 유리 병을 해동 및 10 μg의 / ml의 농도에 대한 멸균 L-15 미디어 100ml에 희석하여 유체 바이오칩에 대한 피브로넥틴 기판을 준비합니다. -20 ° C에서 멸균 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브에 40 ML의 분량 씩 고정. 바이오칩을 파종하기 전에 실온 몇 시간에서 해동. 해동 후 재 냉동하지 않습니다.
    2. 소 태아 혈청을 50 ㎖, 5 ㎖의 200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민 SUP를 첨가하여 세포 배양 배지를 준비영양 보충제 및 L-15 500 mL의 매체에 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 5 ㎖ (페니실린 10000 단위 / ㎖ 10,000 μg의 스트렙토 마이신 / ㎖) 주식. 이는 9 %의 혈청을 함유하는 세포 배양 배지 560 mL로 수득한다. 냉장.
      주 :이 배양 플라스크와 바이오칩에 사용되는 전체 세포 배양 배지 일 것이다.
  2. 분말 미디어 폐기
    1. 미리 자동 분말 디스펜서를 사용하여 L-15ex 분말 0.5 % ± 60 ㎎을 함유하는 0.1 DRAM 스냅 캡 튜브를 준비합니다. recloseable 금속 화 폴리 가방 (50 개당) 분말이 분배 된 날짜와 냉장 유리 병에 유리 병 레이블; 각각 포함하는 세 1g 실리카 겔 탈수 팩.
      참고 : L-15ex 분말 미디어 병이 만들어 테스트에 앞서 최대 9 개월 동안 저장 될 수있다.
  3. 탈 (DI) 물과 가정용 표백제를 희석하여 100 ml의 20 % 표백제 용액을합니다. 표백제 용액 5 ㎖를 각 쌍에 대해 요구 될 것으로 예상ochip.
  4. (각 바이오칩 2 섹션이 시드 할) 오토 클레이브 생체 적합성 튜브의 27mm 부분을 절단하여 바이오칩 튜브 어셈블리를 확인하고 폴리 카보네이트 슬립 루어 피팅 튜브의 양단에 맞게. 134 ° C에서 8 분 동안 오토 클레이브 가방 오토 클레이브에 튜브 어셈블리를 놓습니다. 동일한 설정에서 별도의 가방에 또한 오토 클레이브 바이오칩 플러그 (바이오칩 당 2).
  5. at121 ° C에서 30 분간 고압 DI 물.
    참고 :이 물이 시딩 후 바이오칩 세척에 사용됩니다. 10 ml의 각 바이오칩에 필요한 될 것으로 예상된다.
    주 : 각 바이오칩 채널의 실제 부피는 2 ㎖의이지만 멸균 물 5 mL를 표백제 용액의 제거 후, ​​각 채널을 통해 세정된다.
  6. 생체 튜브 27mm의 부분을 절단하고 튜브의 양단 말레 루어 슬립 피팅을 부착하여 주사기 주입 튜브 어셈블리를 만든다. 134 ℃에서 8 분 동안 종이 열 밀봉 멸균 주머니와 오토 클레이브 튜브 조립체를 배치# 176; C.

2. 유체 바이오칩 시드 절차

참고 : 바이오칩 또는 미디어가 무균 기술을 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 처리됩니다 모든 절차를 수행합니다.

  1. 사전 예약 시드에 스물 네 시간은 제조 업체 biohood 포장 및 멸균 플라스틱 악기의 경우 장소에서 바이오칩을 제거합니다.
  2. 다음 20 % 표백제 용액을 사용하여 바이오칩을 소독
    주 : 역사적으로,이 표백 절차는 제조자에 의해 수행 바이오칩의 플라즈마 살균 효과 아니라고시 장기 보존시 바이오칩에 곰팡이 성장을 방지 하였다.
    1. 20 ㎖ 주사기 주입 튜브 멸균 주사기 조립체 부착 biohood에서 작업을 사용 바이오칩의 각 채널에 20 % 표백제 용액 2 ㎖를 주입. 바이오칩은 표백제 용액으로 1 시간 동안 앉아 할 수 있습니다.
    2. 1 시간 진공 ASP 후진공 흡입 배관에 부착 된 웅성 불임 슬립 루어 조립체를 사용하여 두 채널의 표백제 용액을 화나게. 바이오칩을 세척 할 때 드레인으로 바이오칩 튜브 어셈블리 중 하나를 사용합니다.
    3. 멸균 주사기 분사 조립체에 부착 멸균 20 ㎖ 주사기를 사용하여 과량의 물이 biohood의 용기에 배출 할 수 있도록 멸균 된 물 5 ml의 칩의 각 채널 플러시. 그런 다음 표백제에 대한 설명 및 플라스틱 악기 케이스에 다시 바이오칩을 배치하고 다음날 세포를 파종 할 때까지 biohood에 떠날 물 오프 진공 흡인.
  3. , 바이오칩 시드 바이오 칩의 각 채널에 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴 용액 2 ㎖를 주입 할 육십 분 전. 60 분 동안 biohood에 바이오칩을두고 (단계 2.2.3에 설명 된대로) 다음 세포와 바이오 칩을 심는 전에 피브로넥틴 떨어져 흡인 진공. 참조 (멸균 바이오칩 튜브 어셈블리의 두 섹션 배치바이오칩의 포트 섹션 1.4).
  4. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 제품 설명 시트 (16)에 설명 된 절차를 이용하여 매 16 바이오칩 하나 합류 RTgill-W1의 T175 플라스크를 Trypsinize.
    1. 세포의 합류 플라스크 (들)에서 용지 해제 대기음.
    2. PBS의 15 mL를 셀 층을 씻어 다음 대기음.
    3. 각각 T175 플라스크 세포층 트립신 / EDTA 6 ml에 첨가하고 세포를 ~ 5 분간를 Trypsinize 할 수있다.
    4. 트립신을 중지하기 위해 각 플라스크에 전체 L-15 세포 배양 매체의 15 ML을 추가합니다.
    5. 멸균 일회용 용기에 세포 현탁액을 결합합니다.
      주 : 컨테이너 크기가 바이오칩의 수에 좌우되는 시드 150~500 ㎖, 다를 수있다. 세포 현탁액을 5 ml의 바이오 칩은 필요에 따라 추정된다.
  5. 세포 현탁액 ~ 1 ml의 분리 계수하는 마이크로 원심 튜브에 놓는다. 10 배 objecti으로 시야 현미경을 사용하여적이과 혈구는 세포의 10 μL 분취를 계산하고 2.5 × 105 세포 / ml의 세포 현탁액을 달성하는 데 필요한 전체 L-15 세포 배양 배지의 부피를 계산.
    참고 : 세포 현탁액을 사용하는 문화를 계속 플라스크 시드하는 경우,이 그렇게 할 수있는 포인트가 될 것입니다. 완전한 L-15 세포의 배양액을 사용하여 세포 현탁액 농도를 조정한다.
  6. 바이오칩의 각 채널의 외부 포트에 세포 현탁액 2.5 ml를 주입, 무균 주사기 주입 튜브 조립체 (섹션 1.6 참조) syringeattached 멸균 20 ㎖를 사용하여 (즉, 연결 관이없는 포트) biohood에서 폐기 용기에 튜브 유출 여분 세포 현탁액의 일부를 허용한다.
    참고 :이 전체 채널과 연결된 튜브가 세포 현탁액의 전체 될 수 있도록 할 것이다.
    1. 루어 fitti와 호스의 자유 단부를 삽입하여 각 바이오칩 채널 둘러싸인 루프를 생성각 채널의 외부 포트에 ng를.
    2. 70 % 에탄올에 적신 종이 타월로 폐쇄 루프 오프 초과 미디어를 닦은 20 ° C 배양기에서 다시 플라스틱 상자에 바이오칩을 배치합니다. 각 바이오 칩에 고유 식별 번호를 제공합니다.
  7. 일 4, 7, 20 ° C 배양기에서 바이오칩을 제거하고 온도 평형 전체 L-15 세포 배양 미디어와 바이오칩의 모든에 용지를 보충. 사용을 제외하고 단계 2.6 단지 L-15 세포 배양 배지 대신 (아무 세포 현탁액)에서와 동일한 절차를 따르십시오. 4 일 수유 후 20 ° C 배양기에서 바이오칩을 다시 배치합니다.
    1. 7 일 공급 한 후, 제거하고 칩에서 호스를 무시하고 바이오칩에 멸균 드레인 플러그를 삽입합니다.
    2. 테스트에 사용 될 때까지 6 ° C를 인큐베이터에있는 상자에 바이오칩을 놓습니다.
      이 칩은 최대 9 개월 동안 냉장 온도에서 저장 될 수 있으며, 아직 테스트 전을위한 실행 가능한 있습니다 참고 :n은 ECIS 리더.

바이오칩 3. ECIS 테스트

  1. 사용하는 경우 테스트 화학 물질을 준비합니다. (참조 브레넌, 등., 시험 화학 물질의 제조를위한 2012 7).
  2. 휴대용 케이스에서 ECIS 리더 및 테스트 공급 장치를 제거합니다. 6 ° C 배양기에서 제조 된 바이오 칩을 제거합니다. 종이 타월에 바이오칩을 놓습니다. ECIS 리더를 켭니다.
  3. 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 표지 된 0.5 온스 투명 플라스틱 제어 항아리에 컨트롤을 물 10ml와 표지 0.5 온스 투명 플라스틱 용기에 시험 시료 10ml를 분배.
    주 : 1) 정확한 측정을 위해 거품을 제거해야합니다. 2) 주사기, 항아리는 색으로 구분됩니다; 시험에 대한 제어와 빨간색 파란색.
  4. 호일 가방에서 두 개의 분말 미디어 튜브를 제거합니다. 열기 분말 미디어 바이알 중 하나 (필요한 경우 사용 다목적 도구) 및로 전체 유리 병을 떨어 뜨리고, 제어 물 항아리에 한 병의 전체 내용을 부어솔루션뿐만 아니라. 테스트 항아리이 절차를 반복합니다. 모자 및 분말이 용해 될 수 있도록 항아리를 흔들.
  5. 중 제어 (파란색 주사기) 또는 테스트 (빨간색 주​​사기) 각각의 유리 병에서 솔루션의 9​​ ml의 색깔 10ml를 주사기를 각각 입력합니다. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다.
  6. 바이오칩 포트에서 플러그를 제거하고 배수를 연결합니다.
  7. ECIS 리더에 이동식 플라스틱 트레이에 바이오 칩을 넣고 뚜껑을 닫습니다.
  8. 외부 바이오칩 포트에 충전 된 주사기를 연결하고 주사기 플런저를 연결합니다.
  9. 메인 화면에서 "다음"을 선택 사전 테스트를 시작합니다.
    참고 : Reader 소프트웨어는 임피던스를 확인합니다. 임피던스는 사용자 (보통 사이 1,000 및 3,000 옴) 화면을 등록합니다 설정 범위 내에있는 경우 그림 3에 표시하고 "다음"을 선택 사용자 지시 및 소프트웨어) 3.10 단계로 진행되므로 "카트리지 통과". 임피던스는 내 수없는 경우때문에 결함이있는 바이오칩 또는 (일반적으로 인해 전극의 어긋남에) 독자에게 바이오칩의 결함이 연결의 설정 범위, 다음 화면을 등록합니다 "는 카트리지 실패"사용자는 하나 "취소"할 수있는 옵션이 또는 것 테스트를 "확인".
    1. ) 3.9 단계로 돌아가려면 "취소"를 선택합니다. "확인"을 선택 "카트리지 통과"메시지를 수신하고 "다음"을 선택한 후) 3.10 단계로 진행합니다.
      참고 :이 바이오칩을 꺼내 시각적 결함이나 메시지가 새로운 바이오칩을 진행하기 전에 수신 "카트리지 실패"경우 누출을 검사하는 것이 가장 좋습니다.

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그림 3 :. 가능한 임피던스 읽기와 바이오칩의 ECIS 리더 스크린 샷 스크린 샷은 4 공동의 각 옴의 초기 임피던스 수치를 보여줍니다ntrol 전극 (CE) 및 유체 바이오 칩 내에서 4 시료 전극 (SE). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 독자 메시지가 표시되면, 소프트 키보드를 사용하여 샘​​플 정보를 입력하고 완료되면 다음 "동의"를 선택합니다.
    참고 : ECIS 리더 소프트웨어가 자동으로 날짜, 시간 및 사용자가 입력 한 다른 정보와 각 데이터 집합을 스탬프 것이다; 이러한 바이오칩 번호 및 화학적 농도의 종류 등. 임피던스 데이터의 두 분은 삽입 된 바이오 칩에서 수집되고 화면에 타이머가 카운트 다운하는 시간을.
  2. 빨간색 상자 내에서 깜박이는 화면의 지시에 의해 메시지가 두 분 후, "다음"을 누르십시오. "지금 샘플을 주입"할 수있는 깜박이는 녹색 상자에 연결되면, 바이오칩 chann에 동시에 연결된 주사기에서 제어 및 테스트 미디어를 삽입ELS. 완료되면 바이오칩에 장소에 주사기를 남겨주세요.
    참고 : 임피던스 값은 60 분 동안 한 번 분당 수집됩니다. ECIS 리더 소프트웨어 처리 채널이 시험 개시 후 10 ~ 60 분 사이의 임의 지점에서의 제어 채널로부터 통계적으로 상이한 것으로 판단되면, 온 스크린 디스플레이는 샘플 "오염"것을 나타내는 것이다. 처리 제어 채널 다르지 않은 경우, 화면 테스트 실행의 끝에서 "감지 된 오염"을 나타낼 것.
  3. 오염 여부 등의 기록 시험 결과는 각 샘플에 대해 오염.
  4. 테스트 실행의 끝에서 제거 바이오칩 버린다. 헹구고 시험 중에 바이오칩을 수용 주사기, 테스트 튜브 및 이동식 플라스틱 트레이를 공기 건조.
    참고 : ECIS의 독자가 운영 소프트웨어에 대한 온보드 스토리지 4GB의를 가지고, 제어 모델 및 테스트 파일은 테스트를 실행에서 생성 된. 이것은 여러 가지 일 수 있습니다ousand 테스트 파일 판독기에 저장 될 수있다. 파일 USB 점프 드라이브 검색하고 필요한 경우 연구 목적으로 추가 분석을 위해 컴퓨터로 전송 될 수있다.

결과

이 문서에 설명 된 ECIS 기술은 미국 환경 보호청 (USEPA)에서 기술 테스트 및 평가 프로그램 (TTEP)를 -sponsored 테스트를 받았다. 열세 화학 물질 식수 가능한 오염 물질이 될 수 유독 산업 화합물의 광범위한 스펙트럼의 대표로 테스트하기 위해 선정되었다. 테스트하는 동안, 13 (9)가 사람의 건강에 관련된 농도 시간 내에 ECIS 의해 검출 된 8. 표 1은 이러한 오염 시험의 결과를 도시한다.도 4를하면 "오염"결과가 어떻게 보이는지 대표 ECIS 리더 화면. 대부분의 경우, 셀룰러 임피던스 컨트롤과 비교하여 오염 된 샘플에 대해 감소되었다. 때때로, 특정 화합물 임피던스의 증가를 야기 할 수있다.

또한 표 1에 나타내 깨끗한 물 테스트입니다. 마흔 깨끗한 물 시료를 실행하고, 어떤 오염이 표본에서 검출되지 않았다 "어떤 오염이 검출되지 않는"의 대표적인 스크린 샷 (도 5 참조).

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그림 4 : "오염 된"물 샘플의 ECIS 리더 스크린 샷 오염 된 물 샘플에서 정규화 된 임피던스 그래픽과 결과의 예.. 청색 라인은 제어 전극의 각각의 정규화 된 임피던스를 나타내고; 빨간색 선이 시료 전극의 각각의 정규화 된 임피던스를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5 : "어떤 오염 신호가 없습니다"물 샘플의 ECIS 리더 스크린 샷 오염되지 않은 물 샘플에서 정규화 된 임피던스 그래픽과 결과의 예.. 청색 라인은 제어 전극의 각각의 정규화 된 임피던스를 나타내고; 빨간색 선이 시료 전극의 각각의 정규화 된 임피던스를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

범주 오염 물질 농도 테스트 (㎎ / ℓ) 1 감지 ≤1 시간
N = 4/4 칩
살충제 Aldicarb 0.17 아니
아르센 IC (아비산 나트륨) 4.5 예
아 지드 (아지 화 나트륨) 46.​​7 예
Fenamiphos 0.56 아니
Methamidophos 1.4 아니
메틸 파라티온 33.6 예
파라쿼트 (디 클로라이드) 4.6 아니
Pentachlorophenate (나트륨) 71.9 예
산업 화학 암모니아 (924) 예
구리 (구리 II 황산) (103) 예
시안화물 (나트륨) 예
수은 (염화) 24.7 예
톨루엔 (444) 예
깨끗한 물 2 없음 NA 아니
시험 한 농도 등은 양자리 의해 원고와 동일하다. (2014).
2 40 깨끗한 물 샘플이없는 오염으로 실행되었다.
3 "> (14)

표 1 : ECIS에 의해 탐지 된 물 샘플에서 오염 물질.

토론

ECIS 기술로 실험실 환경에서 잘 수행 인체에 적합하다 농도 전위 물 오염 물질을 검출 할 수 있었다. 기술의 이동성 및 포장 필드를 사용하는 것이 도움이 있습니다.

1) 문화, 파종하는 동안 무균 상태를 유지하고, 바이오칩의 공급, 2) RTgill-W1 세포부터 테스트를위한 준비가 될 때까지 냉장 조건에서 시드 바이오칩을 계속 다음과 같이 기술의 성공을위한 프로토콜의 중요한 단계는 매우 긴 그들이 25 ° C 이상의 온도에 노출되면 살아남지 못할 것이다, 3) 정확하게 분말 미디어 유리 병에 L-15ex의 무게를 정확하게의 변화에​​ 의해 발생할 수 있습니다 오탐 (false positive)을 생산 방지하기 위해 물 샘플을 측정 미디어가 아닌 샘플 독성의 삼투압은, 4) 테스트를 실행하기위한 ECIS 화면에 사용자의 지시 사항을 따르십시오. 독자의 소프트웨어는 양방향이 경우 사용자에게 경고합니다바이오칩은 먼저 판독기에 삽입 될 때 ochip은 (초기 임피던스 측정 기준) 테스트를위한 받아 들일 수없는 것입니다. 임피던스 레벨 테스트에 대한 수용 할 수없는 경우, 소프트웨어는 새로운 바이오 칩이 사용될 때까지 사용자가 검사를 진행하는 것을 허용하지 않을 것이다. 용인 임피던스 측정 이유 때문에 ECIS 리더 핀 또는 바이오칩의 접착 에지 중 하나를 따라 유체 누출로 바이오칩 전극 약간 오정렬 보통이다.

ECIS 센서 만 마시는 물 테스트하지 표면의 물 되었기 때문에이 기술에 약간의 제한이 있습니다. 바이오 칩에있는 RTgill-W1 세포 (기간은 온도에 따라 일 시간에서 할 수있는 시간의 연장 기간 동안 많은 25 ° C 이상 동결 또는 온도를 견딜 수 없습니다. 바이오칩은 온도 범위에서 최선을 기능에 냉장에서 실온 7. 그들은 바로 연구 된 후, 그러나, 즉시 사용할 준비가냉장에서 emoved. 휴대용 냉장 컨​​테이너는 현재 온도에 민감한 소모품 분야에서 육군 요원에 의해 사용됩니다. 이 같은 용기 시드 바이오칩 전송을 위해 사용될 수있다.

이 기술에 대한 다른 제한은 광대역 독성 센서 비록 모든 경우는 일부 살충제로서 콜린 에스 테라 제 - 억제 화합물에 잘 응답하지 않는다는 것이다. 이러한 성능 갭을 채우기 위해, ECIS 센서 독성 시험의 넓은 범위를 사용자에게 제공하기 위해 물 샘플 테스트시 시판 신속한 농약 시험 분석과 함께 사용하도록 설계된다. 키트는 30 분 내에 유기 인계와 카바 메이트 살충제를 검출하기위한 신속 효소 분석법이다.

현재 검색 군사 예방 의학 담당자가 사용하는 필드 물 테스트 시스템, 아르센 - ECIS 센서는 WQAS-PM (예방 의학 수질 분석 시스템)를 보완식수 샘플 IC에서, 납, 또는 시안화. ECIS 센서는 오염물이 무엇인지 식별​​하지는 않지만 특정 금속 또는 유기 화합물이 존재하는 경우, 물이 인간 소비에 적합하지 않을 수 있음을 나타내는 표시된다. ECIS 테스트 결과는 시간 내에 사용할 수 있습니다. 양성 결과가 있으면 물 샘플이어서 오염물의 식별을 추가 분석을 위해 송출된다.

전술 한 바와 같이, ECIS 판독기 오염물 검출의 광범위한 스펙트럼을 커버하기 위해 별도 효소 ACE 키트를 포함하는 시스템의 일부가 될 수 있도록 설계된다. 이 독자는 모두 군인에 의해 필드에 사용할 필드 전송을위한 튼튼한 케이스에 포장되고있다.

공개 사항

의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 미 육군이 보증하는 것은 아닙니다. 이 보고서에서 상업 조직 또는 상호를 인용하는 것은 이러한 조직의 제품 또는 서비스에 대한 육군부의 공식 보증 또는 승인을 구성하지 않습니다. 미 육군 환경 보건 연구 센터의 저자 Linda M. Brennan과 Mark W. Widder는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다. Michael Mayo, Michael McAleer 및 Alex Greis는 이 기사에 사용된 일회용 바이오칩 및 기구를 생산하는 Nanohmics의 직원입니다.10251980

감사의 글

이 작업은 미 육군 의료 연구 및 물자 사령부와 중소기업 혁신 연구 및 중소기업 기술 이전 프로그램의 지원을 받았습니다. 계약 번호 W81XWH-13-C-0093. RTgill-W1 세포 배양 멘토가 되어 주신 프레이저 대학의 Lucy Lee 박사님께 감사드리며, RTgill-W1 세포주 개발에 대해 워털루 대학교의 Niels Bols 박사님께 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 태아 혈청Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com16000-085Store @ -20 °C. 사용 전 실온에서 @ 해동하십시오. 완전한 L-15 세포 배양 배지용 성분(10%).
피브로넥틴, 소 혈장EMD Millipore Corp.    www.emdmillipore.com           341631-1 mg보관 @ -20 °C. 사용하기 전에 @ 실온에서 해동하십시오. 10 μ의 농도를 위해 L-15 매체와 혼합하십시오. g/ml 및 동결 @ -20 ° 부분 표본의 C. 바이오칩의 기판으로 사용합니다.
L-글루타민이 없는 L-15 배지Lonza  www.lonzabioscience.com12-700F기초 배지. 6 °C에 보관하십시오.
함유한 L-15ex 분말 매체              www.usbio.netL1501Media는 0.1 dram 바이알에 60 mg 분취량으로 계량하고 6 °C에서 보관합니다. C 건조제 팩이 있는 호일 파우치. 유통 기한은 9개월입니다. 바이오칩에서 테스트하기 위해 10ml의 물 샘플과 혼합합니다.
PBS, Ca2+ 또는 Mg2+Lonza  www.lonzabioscience.com없음 17-516F실온에서 보관하십시오. 세포 배양 플라스크를 트립신화할 때 배지를 헹구는 데 사용됩니다.   
Trypsin, EDTALonza  www.lonzabioscience.comCC-5012Store @ -20 °C. 실온에서 해동하고 세포 배양 플라스크를 트립신화하는 데 사용합니다. 
T175 배양 플라스크Fisher Scientific
www.fishersci.com		12-565-30RTgill-W1 세포 배양에 사용됩니다.
표백제클로록스                                                                ECIS 칩을 세척하기 위해 밀리크 또는 증류수로 20%로 희석합니다. 모든 가정용 표백제는 허용됩니다.
70% 에틸 알코올바이오후드 표면 및 바이오후드에 배치되는 모든 재료를 소독합니다.
무지개송어 아가미 세포(RTgill-W1) 아메리칸 타입 티슈 배양 컬렉션                      www.atcc.orgCRL-2523세포를 배양하여 바이오센서(seeding biochips)에 사용
GlutaMAX-1 보충제, 200 mMLonza  www.lonzabioscience.com35050-061실온에서 보관하십시오.  완전한 L-15 세포 배양 배지용 성분(1%).
Penn/Strep Stock 10K/10KLonza  www.lonzabioscience.com17-602EStore @ -20 °C. 사용 전 해동 @ 실온. 완전한 L-15 세포 배양 배지용 성분(1%).
Pharmed BPT 튜빙U.S. Plastic Corp.          www.usplastic.com5731727mm 단면 절단 및 오토클레이브. 세포가 있는 바이오칩을 파종하고 배지 변경 사이의 폐쇄 루프로 사용됩니다.
Pharmed 튜빙 어셈블리용 폴리카보네이트 루어 피팅Value Plastics             MTLS210-9바이칩에 삽입하기 위해 절단된 Pharmed 튜브의 각 끝에 고정됩니다.
20ml 주사기, 슬립 팁VWR Scientific          us.vwr.comBD302831ECIS 칩을 파종하기 위한 세포 현탁액 주입 및 칩 공급에 사용됩니다.
0.1 드람 스냅캡 폴리프로필렌 마이크로바이알병 항아리 및 튜브, Inc.    www.bottlesjarsandtubes.com30600L-15ex 분말 매체 60mg 분취액을 저장하는 데 사용됩니다.
60 mil Lexan 유체 ECIS 바이오칩Nanohmics, Inc.      www.nanohmics.com Nanohmics, Inc. RTgill-W1 세포를 바이오칩에 주입하고 시드된 칩을 테스트를 위해 ECIS 리더에 넣습니다.
오토클레이브 가능한 플라스틱 악기 상자
17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"		Medi-Dose EPS        medidose.comIB701다음을 저장하는 데 사용됩니다; 오토클레이브 플러그, 청소된 바이오칩, 시드된 바이오칩. 
종이 열 밀봉 살균 파우치, 7 ½ ” X 13인치카디널헬스              www.cardinalhealth.com90713오토클레이브 튜빙 및 피팅 및 플러그에 사용됩니다.
Quantos 자동 분말 디스펜서Mettler Toledo            www.mt.comQB5분말 L-15ex 분취액 60mg을 0.1 드람 바이알로 자동 분출.
ECIS 리더Nanohmics, Inc.      Nanohmics, Inc.에서 맞춤 제작한 Seeded 바이오칩을 판독기에 삽입하여 수독성 테스트를 수행합니다.
3 x 5 금속화된 2.5 mil 폴리프로필렌 재밀봉 가능한 가방Uline                                www.uline.comS-16893파종 바이오칩 및 분말 L-15ex 미디어 바이알을 위한 포장 및 보관.
레더맨 시오후키 ps4아마존                  분말 매체 바이알을 여는 데 사용됩니다.
실리카 겔 건조제 패킷 1g 울린                                www.uline.comS-3902흡수하는 것을 방지하기 위해 L-15ex 분말 미디어 바이알이 든 폴리프로필렌 백에 넣습니다.
멸균 250 또는 500ml Nalgene 병Fisher Scientific
www.fishersci.com		09-740-25C 또는 EBiohood에서 ECIS 칩을 파종하기 위한 세포 현탁액을 유지합니다.
바이오칩용 플러그Nanohmics, Inc.      Nanohmics, Inc.에서 맞춤 제작 6°C에서 보관하기 전에 바이오칩의 포트를 밀봉하는 데 사용됩니다.
ECIS 바이오칩용 드레인Nanohmics, Inc.      www.nanohmics.com Nanohmics, Inc.에서 맞춤 제작한 제품으로, ECIS 리더에 삽입하기 전에 바이오칩의 내부 포트 2개에 부착합니다. 테스트 주입 중에 채널에서 과도한 매체가 배출될 수 있습니다. 
혈구계Fisher Scientific
www.fishersci.com		S17040바이오칩에 주입하기 위해 세포 현탁액을 조정하기 전에 세포 계수에 필요합니다.
명시야 현미경(10X 대물렌즈 포함Leitz Labovert모든 명시야 현미경을 사용할 수 있습니다.
Class II 생물 안전 작업대멸균 조건에서 세포 배양을 수행할 수 있는 모든 class II 생물학적 안전 작업대가 허용됩니다.
마이크로 원심분리기 튜브, 0.6mlFisher Scientific
www.fishersci.com		02-681-311세포 계수 전에 1ml의 세포 현탁액을 보유합니다.
슬립 10cc 빨간 주사기시술 제품, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-R9ml의 시험수 시료를 회수하여 시료를 바이오칩에 주입하는 데 사용됩니다.
슬립 10cc 파란색 주사기Procedure Products, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-B9ml의 대조수 시료를 회수하여 시료를 바이오칩에 주입하는 데 사용됩니다.
½ oz. 투명 애완 동물 플라스틱 항아리 w/ 흰색 골지 안감 캡SKS 병 & 패키징, Inc.              www.sks-bottle.com0605-30L-15ex 분말과 테스트를 위한 물 샘플 10ml를 혼합하는 데 사용되는 샘플 바이알.
50ml 멸균 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브Fisher Scientific        www.fishersci.com12-565-26910 μ의 40ml 분주량을 담는 데 사용됨; g/ml 피브로넥틴 -20 °C.
NIDS ACE 아세틸콜린에스테라제 억제제 검출 테스트ANP Technologies, Inc.
www.anptinc.com		ACE-400센서는 음용수에서 살충제를 신속하게 검출하도록 설계되었습니다.
세포 배양 및 공급 바이오칩을 위한 페놀 레드 US Biological을 www.chlorox.com www.nanohmics.com www.Amazon.com 분말이 수분을 www.nanohmics.com ) :

참고문헌

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