Method Article

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

DOI:

10.3791/53564

⸱

April 6th, 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전기 분무 이온화(ESI) 질량 분석기와 결합된 사내 내장 플로우 스루 트립틱 마이크로리액터를 사용한 단백질 분해 분해를 위한 빠른 프로토콜이 제시됩니다. 마이크로 리액터의 제작, 실험 설정 및 데이터 수집 프로세스에 대해 설명합니다.

Abstract

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질량 분석 (MS)의 대부분은 단백질 분석 방법은 일반적으로 트립신, 검출 효소 분해 단계 전에 수반 기반. 이 단계는 질량 분석 기기의 유효 주사 범위 내에 MW <3,000-4,000 다 함께 일반적으로 분자량이 작은 펩타이드의 생성을 위해 필요하다. 종래의 프로토콜은 37 ºC에서 O / N 효소 소화를 포함한다. 최근 발전은 전형적으로 예를 들면, 전자 렌지 나 고 고정화 효소 또는 몇 분에 단백질 가수 분해에 필요한 시간을 단축 상보 물리적 처리 (범위의 마이크로 리액터의 이용을 포함하는 다양한 전략의 개발을 주도 압력). 본 연구에서는 단백질을 빠르게 분해 효소를 달성하기 위해 임의의 실험실에서 구현 될 수있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단백질 (또는 단백질의 혼합물)은 결합 된 C18 역상 높은 퍼포에 흡착모세관 컬럼에서 사전로드 된 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 실리카 입자를 필요치 않는, 수성 완충액 트립신은 짧은 시간 동안 입자를 통해 주입된다. 온라인 MS 검출을 사용하려면 트립신 펩티드는 MS 이온 소스에 직접 증가 유기물 함량과 용매 시스템과 용출된다. 이 방법은 고가의 고정화 효소 입자의 사용을 회피하고, 처리를 완료하는 처치를 필요로하지 않는다. 단백질 소화 완전한 샘플 분석은 각각 ~ 30 분 이하 ~ 3 분 이상으로 달성 될 수있다.

Introduction

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정제 된 단백질의 동정 및 특성화 자주 MS 기술을 사용함으로써 달성된다. 단백질은 효소로 분해되고 그 펩티드는 더 간단한 주입 실험 장치를 사용하여 MS로 분석된다. 단백질 분해 소화 가장 MS 분석기의 유효 질량 범위에 속하는 작은 펩티드 단편을 생성하기 위해 필요하고, 그 용이 아미노산 서열 정보를 생성하기 위해 저 에너지 충돌 유도 된 분해를 통해 단편화 될 수있다. 절연 단백질 또는 단순 단백질 혼합물, MS 검출하기 전에 펩티드의 크로마토 그래피 분리에 대한 추가적인 필요가 없다. 25-50 펩티드의 혼합물을 용이 MS 이온 소스에 직접 주사기 펌프 시료를 주입하여 분석 할 수있다.

질량 분석 장치는 분석을 수행하고, 짧은 시간 프레임 내에서 단백질의 서열을 확인할 수있다. 현대 데이터 수집 방법과,이 프로세스는 승 달성 될 수있다몇 분 또는 초 ithin. 단시간 스케일에 대한 전체 프로세스를 완료하는 제한 요인이 단백질 분해성 분해 공정이다. 일반적으로, 이것은 수 시간에 걸쳐 수행된다 (또는 O / N) 용액에 37 ºC에서 사용한 기판 (50-100) 효소의 비를 1. 설명 된 미세 반응기 또는 시판되는 카트리지의 형태로, 분, 초, 고정화 효소의 마이크로 리액터의 효소 소화 시간을 감소시킨다. 1-6....

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Protocol

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모세관 마이크로 반응기 1. 준비

  1. 100 μm의 내경 (ID)이 360 ㎛의 외경 (OD) 7-8cm 길이로 모세관 유리 모세관 칼 3-5 센티미터 20 μm의 ID X 0.09의 OD 모세관 X 컷; 어떤 돌출 버없이, 모두 모세관 끝이 깨끗하고 스트레이트 컷을 현미경으로 확인합니다.
  2. ~ 6mm의 길이, 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 한쪽 끝으로 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 삽입; 필요한 경우에, 현미경이 동작을 관찰한다.
  3. 면봉의 끝이 90 μm의 OD / 100 μm의 아이디 모세 혈관의 교차점 주위에 접착제 E6000의 작은 방울을 적용하고 RT에서 접착제 경화 O / N을 할 수 있습니다.
  4. ~ 10-15mm의 길이에 삽입 된 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 잘라; 이것은 전기 분무 이온화 방출 될 것입니다.
  5. 미리 잘라 1/32 "OD의 PEEK, 1/16"OD의 PEEK 및 1/16 "OD의 PTFE 욕조길이 4-5cm의 조각 보내고; 이러한 누출이없는 연결을 제공하기 위해 모세관 조합에 사용되는 소매 될 것입니다.
  6. 까꿍 조합에 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 반대쪽 끝을 연결합니다; 누출이없는 연결....

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Results

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단백질 분해 소화 공정의 대표적인 결과가 상기 마이크로 반응기 (도 1, 2) 표 1에 제공하여, 단백질의 혼합물을 동시에 수행 하였다.이 표는 특정 단백질을 식별하는 고유의 펩티드 서열을 포함하는 십자가 상관도 스코어 (Xcorr) (즉, 대응하는 탠덤 질량 스펙트럼 실험 투 이론적 매치의 품질 특징 스코어) 놓친 분열 횟수, 펩티드 충전 상태 (z) 및 질량 / 전하 ( 양성자 펩티드 m / z). 단백질 수준에서의 표는 단백질, 단백질 및 단백질의 점수 범위의 UniProt 단백질 ID, 설명 (명칭)을 제공한다. 단백질 분해 소화 90 초 동안 수행 한 후에 모든 단백질은 여러 펩타이드에 의해 식별했다.

에 필요한 시간모든 펩타이드의 용출은 300 NL / 분, 나노 ESI 최.......

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Discussion

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이 작품에서 설명하는 마이크로 반응기가 제공하는 간편한 구현 미만 30 분에서 MS 분석 및 식별을 가능하게하는 단백질의 효소 소화를 수행하기위한 실험 장치를. 기존의 방법에 비해이 시스템의 뚜렷한 장점은 단순성, 속도, 낮은 시약 소모와 낮은 비용을 포함한다. 특히, 고가의 트립신 고정화 비드 카트리지가 필요 없다. 모세관 마이크로 리액터의 제조는 간단 (도 1a), 그리고 통상적으로 크로마토 그래피 실험에서 발견 된 표준 용품에서 분 이내에 달성 될 수있다. 역상 C18 입자 흡착 단백질 또는 펩티드의 완전한 제거를위한 높은 유기 함량 용제 (CH 3 CN 또는 CH 3 OH)로 세정 할 수있어, 마이크로 리액터는 간단하고 비용 효과적인 제조 공정을 다시 사용할 수 있지만 일회용 APPLIC 일회용 유닛의 제조를 위해 초대관리 포인트. 모세관 마이크로 반응기는도 1b에 도시 된, 또는 표준 상업적인 이온 소스에 삽입 할 수 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 IML에 대한 NSF/DBI-1255991 보조금에 의해 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
이온 트랩 ESI-MSThermo ElectronLTQLTQ 질량 분석기는 탠덤 MS 데이터
XYZ 스테이지Newport다중 부품을가정용 XYZ 스테이지는 다양한 샘플 전달 시스템에서 입력을 수신하도록 상용 LTQ nano-ESI 소스를 조정하는 데 사용됩니다
스테레오 현미경Edmund opticsG81-278현미경은 마이크로 리액터 패킹 프로세스를 관찰하는 데 사용됩니다
분석 저울 / MetlerVWR46600-204저울은 단백질 샘플의 무게를 측정하는 데 사용됩니다
초음파 수조 / BransonVWR33995-540음파 수조는 샘플을 혼합 / 균질화하고 C18 입자 슬러리
주사기 펌프 22Harvard Apparatus552222마이크로 펌프는 패킹된 모세관 마이크로리액터
Milli-Q 초순수 시스템EMD MilliporeZD5311595 MilliQ 정수 시스템은 정제된 DI 물을 준비하는 데 사용됩니다
피펫터/에펜도르프 (1,000  &마이크로; l)VWR53513-410피펫터는 소량의 시료 용액을 측정하는 데 사용됩니다
Pipettor/Eppendorf (100  &마이크로; l)VWR53513-406피펫터는 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다
Pipettor/Eppendorf (10  &마이크로; l)VWR53513-402피펫터는 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다
실리카 모세관(100 µ m ID x 360 &마이크로; m OD)Polymicro TechnologiesTSP100375이 모세관은 마이크로리액터
용융 실리카 모세관(20  &마이크로; m ID x 100 &마이크로; m OD)Polymicro TechnologiesTSP020090이 캐필러리는 ESI 이미터
융합 실리카 캐필러리(50  &마이크로; m ID x 360 &마이크로; m OD)Polymicro TechnologiesTSP050375이 모세관은 주사기 펌프에서 샘플과 용리액을 모세관 마이크로리액터
유리 모세관 식칼Supelco23740-U원하는 길이로 융합 실리카 모세관을 절단하는 도구입니다.
GlueEclectic ProductsE6000 Craft이 접착제는 ESI 이미터를 모세관 마이크로리액터 또는 미세유체 칩
접착제Epo-Tek353NDT접착제는 C18 입자가 로드되는 미세유체 입구 구멍을 밀봉하는 데 사용됩니다
. 역위상 C18 입자 (5  &마이크로; m)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18이들은 단백질이 흡착 된 C18 입자입니다. 입자는 4 에서 추출되었습니다. mm x 20cm C18 LC 컬럼, 애질런트
주사기/유리(250 µ l)Hamilton81130-1725RN유리 주사기는 모세관 마이크로 반응기에 C18 입자 슬러리를 적재하고 샘플과 용리액을 마이크로 반응기에 전달하는 데 사용됩니다
환원 PEEK Union (1/16 "에서 1/32")ValcoZRU1.5FPK이 조합은 250 µ l 5 µ를 적재하기 위한 microreactor에 주사기; m 입자 슬러리
스테인레스 스틸 유니온 (1/16 ")ValcoZU1XC스테인리스강 유니온은 유리 주사기 바늘을 주입 모세관
미량 PEEK 티 커넥터(1/32")ValcoMT.5XCPKPeek 티는 샘플 전송 모세관을 모세관 마이크로 리액터에 연결하는 데 사용됩니다. 측면 암에는 Pt 와이어
Tee 커넥터 (경량)ValcoC-NTXFPK통해 미세 유체 칩에 ESI 전압을 적용하는 데 사용됩니다
VWR66260-126Pt 와이어는 ESI 생성을 위한 전기 연결을 제공하며 질량 분석기 ESI 전원 공급 장치
PTFE 튜브(1/16") OD)ValcoTTF115-10FT테플론 튜빙은 주사기 바늘과 스테인리스 스틸 유니온 사이의 밀폐 연결을 가능하게 하는 데 사용됩니다 
PEEK 튜빙 (0.015 " ID x 1/16 인치 OD)Upchurch Scientific1565Peek 튜빙은 스테인리스 스틸 유니온과 50  &마이크로; m ID 전달 모세관
PEEK 튜빙(0.015" 아이디 x 1/32 " OD)ValcoTPK.515-25Peek 튜빙은 융합 실리카 모세관과 Peek Tee
클린 컷 폴리머 튜빙 커터ValcoJR-797커터는 1/16 "및 1/32"를 미리 절단하는 데 사용됩니다. 길이가 ~4-5cm 인 조각에서 누출 없는 연결을 위한 슬리브로 사용되는 Peek 폴리머 튜
빙 호박색 바이알(2ml)Agilent HP-5183-2069바이알은 샘플 용액과 C18 입자 슬러리를 준비하는 데 사용됩니다.
호박색 바이알 (4 ml)VWR66011-948바이알은 샘플 용액을 준비하는 데 사용됩니다
. 폴리프로필렌 튜브 (15  ml)Fisher12-565-286D바이알은 버퍼 용액을 준비하는 데 사용됩니다
실린더(100ml)VWR24710-463실린더는 용매
실린더(10ml)VWR24710-441실린더는 용매
피펫 팁(1,000 µ l)VWR83007-386피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다
. 피펫 팁(100 µ l)VWR53503-781피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다
펫 팁(10 µ l)VWR53511-681피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다
유리 기판 나노필름B270 흰색 크라운, 3" x 3"이들은 마이크로칩 제조를 위한 유리 기판입니다
수 너트 피팅 (1/16 ")UpchurchP203X이 피팅은 전송 캐필러리를 미세유체 칩 Nanoport 어셈블리에 연결하는 데 사용됩니다.
UpchurchN-122H이 피팅은 전송 캐필러리를 미세유체 칩
단백질 표준SigmaMultiple #
Acetonitrile, HPLC 등급FisherA955
Methanol, HPLC 등급FisherA452
이소프로판올, HPLC 등급시그마650447
트리플루오로아세트산시그마302031
중탄산 암모늄AldrichA6141
트립신, 시퀀싱 등급PromegaV5111
획득하는 데 사용됩니다 를 분산시키는 데 사용됩니다.. . . 용융 로 옮기는 데 사용됩니다. 이것은 에폭시 에 고정하는 데 사용됩니다. 이 . 내부 에 연결하는 데 사용됩니다.를 삽입 할 수 있습니다 이 Tee 커넥터는 샘플 전송 라인 Pt 와이어 (0.404 mm)를 . 사이의 누출없는 연결을 가능하게하는 슬리브로 사용됩니다. 이 의 부피를 측정하는 데 사용됩니다.. 피

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol.

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Enzymatic DigestionFlow through MicroreactorProtein DigestionTrypsin SolutionC18 ParticlesMass SpectrometryCapillary ColumnElectrospray IonizationPeptide ElutionSample Analysis

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