배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

요약

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

초록

대뇌 피 질을 포함 하는 출생 결함-대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형으로 알려진-어린 시절에 지적 장애 및 간 질 약물 내성의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. 고해상도 뇌 영상 vivo에서 상승할 고기의 큰 그룹의 식별을 용이 있다. 뇌 이미징, 게놈 분석 및 동물 모델의 발전에도 불구 하 고 간단한 워크플로 putative 돌연변이의 기능 효과 테스트 하 고 체계적으로 후보 유전자를 우선 순위를 없습니다. 이 문제를 해결 하려면 MCD에 대 한 새로운 원인 유전자의 id를 사용 하는 실험적인 전략 개발 및 검증. 식별 후보 게놈 지역 또는 배열 CGH 또는 전체-exome 시퀀싱 및 그들의 비활성화의 또는 utero 통해 설치류 두뇌 개발에 특정 변이의 overexpression의 효과 통해 유전자를 기반으로 하는이 전략 electroporation입니다. 이 방법은 뇌 결 heterotopia, 결함이 있는 신경 마이그레이션에 의해 발생 하는 MCD의 병 인에 상 상속 기공을 단백질에 대 한 인코딩 C6orf70 유전자의 id에 지도 했다.

서론

대뇌 피 질 인지, 지적 프로세스에서 중요 한 역할 이며 참여 감정 컨트롤, 학습 및 메모리. 그것은 따라서 놀라운 많은 신경 및 정신 질환에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형 발생 하지입니다. MCD의 병 인 모두 인수 이후 복잡 한 이며 유전적 요인 관련. MCD의 유전자 결정된 비율의 누적 보급은 약 2% 이며 대부분의 경우에서 산발적. 예를 들어, 선 천 성 뇌 dysgenesis의 발생률은 인간의 인구에 1% 보다 높은 것으로 추정 하 고 MCD의 일부 형태의 간 질을 가진 모든 환자의 14% 이상에 고 심한 또는 다루기 어려워 간 질^1, 의 40%에서 관찰 된다 ².

뇌 결 Heterotopia (PNH) 가장 일반적인 MCDs 중 하나 이며 발전 대뇌 피 질에 심 실 영역 (VZ)에서 신경 세포의 비정상적인 이동에 의해 발생 합니다. 마이그레이션 결과 클러스터에는 일반적으로 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 구상 될 수 있다 측면 뇌 실 벽을 따라 heterotopic 뉴런의 신경의 실패. PNH의 임상, 해부학 및 이미징 기능 유형이 다른 있습니다. 혹 양측을 대칭 작고 일방적인에서 범위 수 있습니다. 일반적인 ....

프로토콜

윤리 성명: Wistar 쥐 성관계, 유지 되었고 INMED 동물 시설, 유럽 연합 및 프랑스 법안 동의에서 사용.

1. DNA 추출 및 배열 CGH와 웨스에 대 한 정량화

1. 자동된 DNA 분리 로봇 또는 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 수동 DNA 추출 키트를 사용 하 여 환자에서 인간의 혈액 백혈구에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 계량 한 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 샘플.

2. 배열 CGH 프로토콜

1. GDNA의 제한 소화
   1. 환자 및 2 h 37 ° c.에 대 한 상용 인간의 제어 RsaI와 AluI DNA에서 순화 gDNA의 두 배 다이제스트 500 ng 10 U/μ 효소의 0.5 μ를 사용 하 여 각 반응에 대 한. 효소를 비활성화 하 여 얼음 샘플 튜브를 이동 65 ° C에서 20 분 동안 품 어.
2. 샘플 라벨
   1. 각 반응 관 (예: 5 1 팩, 2 팩, 4 팩 microarrays에 µ l)을 사용 하 고 있는 microarray 형식에 필요한 임의의 뇌관의 적절 한 볼륨....

결과

소설 상승할 원인 유전자를 식별 하도록 설계 된 실험 전략은 그림 1에서 지.

변함없이 PNH (그림 2A), 신체 callosum dysgenesis, colpocephaly, 소 뇌 hypoplasia 및 간 질와 관련 된 polymicrogyria를 결합 하는 발달 두뇌 이상으로 155 환자의 코 호트에서 배열 CGH를 수행 하 여 증 및 인지 장애, 우리는 12 환자 (그림 2B)²¹에 의해 공유 하는 6q27에 1.2 m b의 최소한의 중요 한 삭제를 확인. 게놈 지역 포함 4 개의 알려진된 유전자 (THBS2, PHF10, TCTE3 및 DLL1)와 2 유전.......

토론

MCDs는 지적 장애 및 약물 내성 유년기 간 질^1,2의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. MCDs에 관심 두 가지 주요 요인으로 인해 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다. 첫 번째는 개선 의사와 과학자는 이전 인식 하지 많은 두뇌 기형의 시각화 하을 수 있는 이미징 (특히 MRI) 두뇌에서. 다른 많은 소설 상승할 원인이 유전자의 id 허용 유전 도구의 발전 이다. 이것은 크게 기초 두뇌 개발 및 기능, 그리고 더 정확한 유전 상담에 대 한 허용 하는 메커니즘의 우리의 지식을 향상.

과거에는, 연구원은 나중 단계에 두뇌 개발에 그들의 역할을 명확 하 게 기능적인 분석 실험의 디자인을 떠나 원인 유전자 식별에 주로 그들의 노력을 집중. 이 메서드는 의무가 찾는 어떤 전통적인 유전자에 대 한 보다 일반적인 산발적 장애, 재발 성 유전 질환의 연구에서 진행으로 인해 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	세포 내 미세주입 디스펜스 시스템
패스트 그린 FCF	Sigma-Aldrich	F7252	패스트 그린 주사의 시각적 모니터링 가능
BTX ECM 830 전기천공기	BTX Harvard Apparatus	45-0002	ECM 830은 in vitro 및 in vivo 애플리케이션을
위해 설계된 구형파 펄스 발생기입니다.Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz(진동 블레이드 포함
) FluoView 300	Olympus		Olympus FluoViewTM 300은 생물학 연구 응용 분야용으로 설계된 포인트 스캔, 포인트 감지, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경입니다
eCELLence 소프트웨어	Glance Vision Technologies		eCELLence는 세포 이동의 정량 분석을 위해 설계된 소프트웨어입니다
1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K 또는 8 x 15K용	질런
		n G4900DA 또는 G2565CA
하이브리드화 챔버, 스테인리스	애질런트	질런트 p/n G2534A	어레이 CGH 하이브리드화
혼성화 챔버 개스킷 슬라이드, 어레이용 5팩			개스킷 1팩 마이크로어레이용 CGH 하이브리드화
또는	2	Agilent p/n G2534-60003
또는	4	Agilent p/n G2534-60002
또는	8	용 Agilent p/n G2534-60011
		Agilent p/n G2534-60014
혼성화 오븐	Agilent	Agilent p/n G2545A
Agilent 마이크로어레이 혼성화 챔버용 하이브리드화 오븐 회전자	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
가열식 뚜껑이 있는 열 순환기	Agilent	Agilent p/n G8800A 또는 동급의	큐베이션용 Termal cycler
1.5mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 또는 동급의	마이크로 원심분리기
마그네틱 교반 막대	Corning	p/n 401435 또는 동급	Qubit
Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	DNA 정량화를 위한 기기
Qubit dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS 분광 광도계	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 또는 2000 또는 동급	기기 DNA 정량화용 기기
P10, P20, P200 및 P1000 피펫	Pipetman 또는 동급		DNA 분배기
진공 농축기	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 또는 동급	DNA 농축 기기
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
정제 컬럼(50개)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
AutoScreen A, 96웰 플레이트	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
GenElute PCR 클린업 키트	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
인간 게놈 DNA		p/n G1521	DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
CGH 마이크로어레이용:	Promega	(여성) 또는 p/n G1471(남성)	어레이 CGH 제어 DNA
CGH+SNP 마이크로어레이용:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 또는 NA18579	어레이 CGH 제어 DNA
올리고 aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 키트 또는	애질런트	p/n 5188-5226	어레이 CGH 혼성화 및 세척
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 1 및	Agilent	p/n 5188-5221	어레이 CGH 하이브리드화 및 워시
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 워시 버퍼 2	Agilent	p/n 5188-5222	어레이 CGH 하이브리드화 및 세척
안정화 및 건조 솔루션	Agilent	p/n 5185-5979	어레이 CGH 하이브리드화 및 워시
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 하이브리드화 키트	애질런트	p/n 5188-5220 (25) 또는 p/n 5188-5380 (100)	어레이 CGH 혼성화 및 세척
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	어레이 CGH 혼성화 및 세척
Agilent C 스캐너	어레이 CGH 슬라이드용	애질런트
SureSelect XT2 시약 키트			Kit for target enrichment
HiSeq 플랫폼(HSQ), 16개 시료	애질런트	p/n G9621A
HiSeq 플랫폼(HSQ), 96 샘플	애질런트	p/n G9621B
HiSeq 플랫폼(HSQ), 480 샘플	애질런트	p/n G9621C
MiSeq 플랫폼(MSQ), 16 샘플	애질런트	p/n G9622A
MiSeq 플랫폼(MSQ), 96 샘플	애질런트	p/n G9622B
MiSeq 플랫폼(MSQ), 480 샘플	애질런트	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	25 - 1000 bp의 dsDNA 단편의 분리, 크기 조정 및 정량화를 위한 키트.
고감도 DNA 키트	Agilent	p/n 5067-4626	키트: 단편화된 DNA 또는 DNA 라이브러리 분석용 키트.
자동 PCR 정제를 위한	AMPure XP Kit
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			비오틴화 핵산의 분리 및 취급
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기			DNA 정량
분석 100 어세이, 2-1000ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 어세이, 2-1000ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit 어세이 튜브	Life Technologies	p/n Q32856	DNA 정량
SureSelec tXT2 캡처 라이브러리	애질런트는	실험에 따라	라이브러리 캡처
키트, SureCycler 8800 Thermal Cycler	, Agilent	p/n G8800A	DNA 증폭
96웰 플레이트 모듈, SureCycler 8800 Thermal Cycler,	Agilent	p/n G8810A	DNA 증폭
, SureCycler 8800 호환 96웰 플레이트	, Agilent	p/n 410088	DNA 증폭
광학 스트립 캡	애질런트	p/n 401425	DNA 증폭
튜브 캡 스트립, 돔형	애질런트	p/n 410096	DNA 증폭
압축 매트	애질런트	p/n 410187	DNA 증폭
2100 바이오분석기 노트북 번들	애질런트	p/n G2943CA	DNA 증폭
2100 바이오분석기 전기영동 세트	애질런트	p/n G2947CA	DNA 증폭
Covaris 시료 전처리 시스템, E-시리즈 또는 S-시리즈	Covaris		DNA 전단
Covaris 시료 홀더		p/n 520078	DNA 전단
Nutator 플레이트 믹서	BD Diagnostics	p/n 421105 또는 동급의	플레이트 믹서
GaIIx	Illumina		차세대 염기서열분석 기계

. 애트 마이크로어레이 번들 어레이 슬라이드 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K 또는 8 x 60K용 애질런트 애질런트 p/G2565BA G2565CA G4900DA 애용 챔버 팩 마이크로어레이용 팩 마이크로어레이용 팩 마이크로어레이 인의 스캐너 Kit Kit.