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방법 논문

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

8.1K 조회수

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DOI:

10.3791/53570

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2017년 12월 1일

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1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

초록

대뇌 피 질을 포함 하는 출생 결함-대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형으로 알려진-어린 시절에 지적 장애 및 간 질 약물 내성의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. 고해상도 뇌 영상 vivo에서 상승할 고기의 큰 그룹의 식별을 용이 있다. 뇌 이미징, 게놈 분석 및 동물 모델의 발전에도 불구 하 고 간단한 워크플로 putative 돌연변이의 기능 효과 테스트 하 고 체계적으로 후보 유전자를 우선 순위를 없습니다. 이 문제를 해결 하려면 MCD에 대 한 새로운 원인 유전자의 id를 사용 하는 실험적인 전략 개발 및 검증. 식별 후보 게놈 지역 또는 배열 CGH 또는 전체-exome 시퀀싱 및 그들의 비활성화의 또는 utero 통해 설치류 두뇌 개발에 특정 변이의 overexpression의 효과 통해 유전자를 기반으로 하는이 전략 electroporation입니다. 이 방법은 뇌 결 heterotopia, 결함이 있는 신경 마이그레이션에 의해 발생 하는 MCD의 병 인에 상 상속 기공을 단백질에 대 한 인코딩 C6orf70 유전자의 id에 지도 했다.

서론

대뇌 피 질 인지, 지적 프로세스에서 중요 한 역할 이며 참여 감정 컨트롤, 학습 및 메모리. 그것은 따라서 놀라운 많은 신경 및 정신 질환에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형 발생 하지입니다. MCD의 병 인 모두 인수 이후 복잡 한 이며 유전적 요인 관련. MCD의 유전자 결정된 비율의 누적 보급은 약 2% 이며 대부분의 경우에서 산발적. 예를 들어, 선 천 성 뇌 dysgenesis의 발생률은 인간의 인구에 1% 보다 높은 것으로 추정 하 고 MCD의 일부 형태의 간 질을 가진 모든 환자의 14% 이상에 고 심한 또는 다루기 어려워 간 질1, 의 40%에서 관찰 된다 2.

뇌 결 Heterotopia (PNH) 가장 일반적인 MCDs 중 하나 이며 발전 대뇌 피 질에 심 실 영역 (VZ)에서 신경 세포의 비정상적인 이동에 의해 발생 합니다. 마이그레이션 결과 클러스터에는 일반적으로 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 구상 될 수 있다 측면 뇌 실 벽을 따라 heterotopic 뉴런의 신경의 실패. PNH의 임상, 해부학 및 이미징 기능 유형이 다른 있습니다. 혹 양측을 대칭 작고 일방적인에서 범위 수 있습니다. 일반적인 임상 sequelae 포함 간 질과 지적 장애3. Xq28에 지도, Filamin A (또는 FLNA) 유전자에 돌연변이 산발적 환자3,4의 26%에서 양측 PNH X 연결 된 가족의 100%에 발견 했다. 20q13에 지도 하는 ARFGEF2 유전자에 있는 돌연변이 기인한 PNH의 희귀, 열성 형태 두 consanguineous 가족5에 보고 되었습니다. 최근, biallelic 돌연변이 유전자 DCHS1 및 FAT4 수용 체 ligand cadherin 쌍을 인코딩 PNH6을 포함 하는 multisystemic 장애에 의해 영향을 받는 9 환자에서 확인 되었습니다. PNH 또한 연관 되어 연약한 X 증후군7, 윌리엄스 증후군8, 22q11 microdeletion 증후군9, 5 p 1510중복, 삭제 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 및 6q 터미널 삭제 증후군14,15,,1617,18,19, 추가 원인 유전자 흩어져 있습니다 제안 전체 게놈. 그러나, 약 74%의 산발적 PNH 환자에 대 한 유전으로 해명된17수 남아 있습니다.

그러나 고아 한 유전자 매핑 접근 배열 비교 Genomic 교 잡 (배열 CGH) 입증 하위 미세한 염색체 이상,,이 접근을 사용 하 여 식별 하는 게놈 영역 검출을 위한 강력한 도구와 같은 종종 큰 많은 유전자를 포함 하 고.

대규모 병렬 시퀀싱 기술 (즉, 전체 Exome 시퀀싱 (WES) 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS))의 출현은 실질적으로 비용 및 전체 인간의 exome 또는 게놈을 시퀀싱 하는 데 필요한 시간이 감소 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 웨스와 WGS 데이터의 해석 데이터 필터링에서 각 환자 수만 수백 (또는 수천, 분석의 유형에 따라) 변종 등장에 대 한 이후 대부분의 경우에 도전 남아 있습니다.

소설 상승할 원인이 유전자, 배열 CGH를 결합 하 여 새로운 체계적인 전략을 식별의 과정을 속도를, 후보 유전자의 웨스와 utero에서 electroporation (IUE) 심사 설계 되었습니다. IUE 있게 선택적으로 비활성화 (또는 overexpress) 특정 유전자 돌연변이 설치류 두뇌에 corticogenesis18,19에 있는 그들의 관련의 급속 한 평가 사용 합니다. RNAi 중재 최저 또는 하나 이상의 후보 유전자의 overexpression 발생할 유전자 관련 질병 개발, 신경 마이그레이션 또는 성숙에 지역화 된 결함은 예상 된다. 누구의 비활성화 (또는 overexpression) 재현 설치류에 환자에서 관찰 표현 형 유전자의 식별에 따라 상승할 산발적 인 환자에서 심사에 대 한 뛰어난 후보 된다. 우리 최근 환자 6q27 염색체 삭제16오 병 인 PNH에 C6orf70 유전자 (일컬어 ERMARD)의 중요 한 기여를 밝혀이 접근을 사용 하 여.

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프로토콜

윤리 성명: Wistar 쥐 성관계, 유지 되었고 INMED 동물 시설, 유럽 연합 및 프랑스 법안 동의에서 사용.

1. DNA 추출 및 배열 CGH와 웨스에 대 한 정량화

  1. 자동된 DNA 분리 로봇 또는 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 수동 DNA 추출 키트를 사용 하 여 환자에서 인간의 혈액 백혈구에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 계량 한 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 샘플.

2. 배열 CGH 프로토콜

  1. GDNA의 제한 소화
    1. 환자 및 2 h 37 ° c.에 대 한 상용 인간의 제어 RsaI와 AluI DNA에서 순화 gDNA의 두 배 다이제스트 500 ng 10 U/μ 효소의 0.5 μ를 사용 하 여 각 반응에 대 한. 효소를 비활성화 하 여 얼음 샘플 튜브를 이동 65 ° C에서 20 분 동안 품 어.
  2. 샘플 라벨
    1. 각 반응 관 (예: 5 1 팩, 2 팩, 4 팩 microarrays에 µ l)을 사용 하 고 있는 microarray 형식에 필요한 임의의 뇌관의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
    2. 열 cycler에 샘플 튜브를 전송. 그리고 5 분 동안 4 ° C에서 3 분 동안 95 ° C에 품 어.
    3. 준비 한 cyanine 3 및 한 cyanine 5 다음 볼륨을 혼합 하 여 얼음에 마스터 믹스 라벨: 10.0 µ l 5 배 반응 버퍼, 5.0 µ l 10 x dNTPs, 3.0 µ l Cyanine 3 dUTP 또는 Cyanine 5-dUTP 및 1.0 µ l 엑 소 (-) Klenow 효소, 2.0 µ l Nuclease 무료 물. Microarray 형식에 따라 각 시의 볼륨 사용을 선택 합니다.
    4. gDNA를 포함 하는 각 반응 관에 라벨 마스터 믹스를 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
    5. 샘플 튜브 열 cycler에 전송 하 고 2 시간, 10 분 동안 65 ° C에서 37 ° C에서 품 어 다음 4 ° c.에 샘플을 유지
  3. 이라는 gDNA의 정화
    1. 각 반응 관에 1 x 테 (pH 8.0)의 430 µ l를 추가 합니다.
    2. 2 mL 컬렉션 튜브로 정화 열을 배치 하 고 라벨 열을 적절 하 게. 정화 열에 각 이라는 gDNA를 로드 합니다.
    3. 실 온에서 microcentrifuge에 14000 x g에서 10 분 원심 분리기. 흐름을 통해 삭제 하 고 다시 2 ml 컬렉션 튜브에에서 열을 배치.
    4. 각 열에 1 x 테 (pH 8.0)의 480 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 microcentrifuge에 14000 x g에서 10 분 원심 분리기. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    5. 신선한 2 mL 컬렉션 튜브 및 순화 된 샘플 수집을 실 온에서 microcentrifuge에 1000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기로 열 반전.
    6. 집중 장치를 사용 하 여 또는 1 x 테 (pH 8.0) 추가 사용에 microarray 형식에 대 한 요청을 샘플 볼륨을가지고. 예를 들어 1 팩 microarray가지고 볼륨 80.5 대 한 µ L. 5 분 동안 얼음에 샘플을 품 어 그리고 10 번 위아래로 솔루션 플라스틱.
  4. 교 잡에 대 한 이라는 gDNA의 준비
    1. 테스트 및 참조 샘플 RNase 무료 신선한 1.5 mL 튜브에 적절 한 cyanine 5 표시 샘플 및 cyanine 3에 표시 된 샘플을 사용 하 여 결합 합니다. 예를 들어, 1-팩 microarray 있도록 최종 볼륨에 대 한 158 µ L. 사용에서 microarray 형식에 따라 각 샘플의 볼륨 선택입니다.
    2. 수율, A260 nm (DNA), a 550 nm (cyanine 3), 및 (cyanine 5) A650 nm에서 흡 광도 측정 하 여 라벨 또는 특정 활동의 정도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.
      1. 수식을 사용 하 여 수율 계산: [샘플 볼륨 (µ l) x DNA concentration(ng/µl)] / 1000 (ng / µ g). 계산 하는 수식을 사용 하 여 특정 활동: pmol gDNA의 µ l 당 염료 / µ g의 µ l 당.
        참고: 예를 들어 입력 DNA의 0.5 µ g에 대 한 수익률 8 ~ 11 µ g 고 Cyanine 3 표시 샘플 및 20 ~ 35 Cyanine 5 이라는 샘플에 대 한 특정 활동 (pmol / µ g) 25 ~ 40 이어야 한다.
    3. 교 잡 마스터 믹스 사용에서 microarray 형식에 필요한 금액, 혼합 준비 다음 시 약: 50 µ L 침대 1 DNA (1.0 mg/ml), aCGH 차단 에이전트 및 260 µ l 2 x 52 µ L 10이 RPM 교 잡 버퍼 x.
    4. 사용에서 microarray 형식에 필요한 총 볼륨 이라는 gDNA를 포함 RNase 무료 1.5 ml 튜브에 적절 한 양의 교 잡 마스터 믹스를 추가 합니다. 예를 들어 1 팩 microarray에 대 한 각 반응에 대 한 최종 볼륨 362 µ l 인지 확인 합니다.
    5. 아래로, pipetting으로 샘플을 혼합 후 신속 하 게 14000 x g에서 원심 고와 30 분 동안 37 ° C에서 95 ° C에서 3 분 동안 품 어.
  5. 챔버 및 교 잡
    1. 가스 켓 레이블이 위로 향하도록 하 고 챔버 기지의 직사각형 섹션 정렬 챔버 베이스에 깨끗 한 가스 켓 슬라이드를 로드 합니다. 가스 켓 슬라이드 챔버 기반 플러시 이며 열려 되지 않습니다 확인 하십시오.
    2. 가스 켓 음, 샘플 균일 하 게 분산 되어 있는지에 교 잡 견본 혼합물을 분배.
    3. 가스 켓 슬라이드 평가 샌드위치-쌍 올바르게 정렬에 microarray 슬라이드를 내려 놔. 그런 다음 샌드위치 슬라이드에 커버 하 고 손을 강화 클램프 반응 챔버 조립.
    4. 일로 조립된 챔버를 수직으로 회전 하 여 슬라이드를 확인 합니다. 거품이 챔버에 존재 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 필요한 경우, 하드 표면에 어셈블리 고정 거품 이동을 누릅니다.
    5. 20 rpm에 회전 설정 회전 랙에서 조립된 슬라이드 챔버를 넣어. 오븐에서 교 잡 챔버를 넣고 microarray 형식 사용에 따라 24 또는 40 h 65 ° C에서 교 잡 수행.
  6. Microarray 세척 및 스캔
    1. 오븐에서 교 잡 실 고 워시 버퍼 1에서에서 잠수함. 그것의 분해를 진행 합니다.
    2. Microarray 슬라이드를 제거 하 고 신속 하 게 슬라이드 랙 워시 버퍼 1 실내 온도에 그것을 넣어.
    3. 교 반 (사용 벼룩과 자기 활동가)와 5 분 동안 배열 슬라이드를 씻어. 너무 활발 한 혼합 하지만 좋은 4 (중간 속도), 설정 교 반기 속도 조정 됩니다.
    4. 워시 버퍼 2 90 s 감동에 대 한 배열 슬라이드를 씻어. (그것은 건조 등장 한다) 버퍼에서 슬라이드를 부드럽게 복구 슬라이드 홀더 슬라이드 보호자의 도움으로 그것을 로드.
    5. 배열 스캐너로 슬라이드를 로드 하 고 배열 제조업체의 지침에 따라 검색을 수행.
    6. 제조업체의 지침 (V.9.1.3.1)에 따라 사용 중인 스캐너와 함께 제공 되는 추출 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 합니다.

3. 웨스 프로토콜

  1. 대상 농축
    1. DsDNA BR 분석 결과 사용 하 여 악기 프로토콜에 따라 gDNA 샘플의 농도 결정.
    2. 1 x 1.5 mL 낮은 바인딩 튜브 50 µ L의 전체 볼륨에 낮은 테 버퍼와 높은-품질 이중 가닥 DNA의 5 µ g을 희석.
    3. sonicator를 설정 하 고 제조업체의 지시에 따라 로드 및 언로드 역에는 microtube를 넣어. 관에 뚜껑을 유지.
    4. 천천히 거품 소개 없이 미리 분할된 septa 통해 50 µ l DNA 샘플을 전송.
    5. Sonicator의 제조 업체에서 권장 하는 설정에 따라 DNA를 전단 하 고 제조업체의 지시에 따라 Bioanalyzer을 사용 하 여 품질 평가. 대상 DNA 조각 크기는 150 ~ 200 bp.
  2. DNA의 복구 끝
    1. 10 µ L 최종 수리 올리고 혼합의와 최종 수리 효소 혼합의 40 µ L를 혼합 하 여 최종 수리 반응 혼합을 준비 합니다. 와 동 믹서에 잘 섞는다.
    2. 열 cycler에서 30 분 동안 20 ° C에서 샘플을 품 어와 다음 4 ° c.에서 그들을 잡아합니다 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
    3. 50 µ L 단계 3.2.1 각 50 µ L에서에서 준비 끝 복구 반응 혼합의 전단 DNA 샘플 잘 추가 합니다. 믹스 잘 아래로 pipetting 또는 부드러운 vortexing.
    4. 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
  3. 3'의 Polyadenylation 끝납니다.
    1. 각 엔드 수리, 순화 된 DNA 샘플 (약 20 µ L)를 다 미행 마스터 믹스 20 µ l를 추가 합니다.
    2. 믹스 잘 아래로 pipetting 또는 부드러운 vortexing.
    3. 37 ° c 열 cycler에서 샘플을 품 어 누르고 4 ° c.에 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
  4. 캡처 전 인덱싱 어댑터 결 찰이 고
    1. 각 A 꼬리 DNA 샘플을 결 찰 마스터 믹스의 5 µ L를 추가 합니다.
    2. 각 샘플에 적절 한 사전 캡처 인덱스 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.
    3. 우물을 밀봉 하 고 5 s. 짧게 원심 분리기 샘플에 대 한 vortexing에 의해 철저 하 게 혼합.
    4. 열 cycler에서 15 분 동안 20 ° C에서 샘플을 품 어와 다음 4 ° c.에서 개최 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
    5. 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
  5. 인덱싱된 라이브러리 증폭
    1. 뇌관 믹스의 1 µ L PCR 주인 혼합의 25 µ L를 혼합 하 여 캡처 전 PCR 반응 혼합의 적절 한 볼륨을 준비 합니다. 와 동 믹서에 잘 섞는다.
    2. 26 µ L PCR 접시의 별도 우물에 증폭 혼합물의 각 인덱싱된 gDNA 라이브러리 샘플의 24 µ L을 결합.
    3. PCR 프로그램을 실행 하는 다음 단계: 30 98 ° C에서 2 분 동안 98 ° C, 5 사이클 s, 60 ° C 30 s 및 1 min과 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 위한 72 ° C 샘플 4 ° c.에서 개최
    4. 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
    5. Bioanalyzer 제조 업체 프로토콜에 따라 품질을 평가 합니다.
  6. 교 잡에 대 한 인덱싱된 DNA 샘플의 풀링
    1. 각 캡처 반응 풀에 PCR 접시의 한 잘 각 인덱싱된 gDNA 라이브러리 샘플의 적절 한 볼륨을 결합 한다. 예를 들어 인간 또는 마우스 모든 Exon 캡처 라이브러리, 187.5를 사용 하 여 풀 당 8 라이브러리 결합 각 인덱싱된 라이브러리의 ng. 각 최종 캡처 반응 풀 1500 포함 되어 있는지 확인의 인덱싱된 gDNA ng.
    2. 잘 각 볼륨을 줄이기 위해 < 7 µ L 진공 집중 장치를 사용 하 여. 샘플을 완전히 건조 하지 마십시오.
    3. 각 집중된 gDNA 풀 려 마지막 잘 볼륨 7 µ L 그리고 소용돌이 격판덮개 우물의 바닥에 액체를 수집 하는 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자 30 s. 원심 분리기에 대 한 적극적으로 gDNA를 포함 된 충분 한 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
  7. 캡처 라이브러리를 gDNA 도서관 풀의 교 잡
    1. 각 인덱스 7 µ L gDNA 풀 믹스 차단의 9 µ l를 추가 합니다. 아래로 혼합 플라스틱.
    2. 우물 뚜껑 봉인된 플레이트 열 cycler에 gDNA를 포함 전송 그리고 5 분 동안 95 ° C에서 품 어, 65 ° c.에서 개최 접시 적어도 5 분 동안 65 ° C에서 개최 됩니다 있는지 확인 합니다.
    3. 캡처 라이브러리의 크기에 근거 하 여 RNase 블록의 적절 한 희석을 준비 (< 3.0 Mb와 25% 희석 라이브러리 > 라이브러리에 대 한 10% 희석 3.0 Mb).
    4. 캡처 라이브러리 크기에 따라 적절 한 양의 캡처 라이브러리를 결합 하 고 얼음에 보관 하는 PCR 접시에서 RNase 블록 솔루션을 희석. Pipetting으로 잘 섞는다. 캡처 라이브러리에 대 한 < 3.0 Mb, 라이브러리의 사용 2 µ l와 10% 희석에서 RNase 블록의 5 µ L. 캡처 라이브러리 > 라이브러리의 사용 5 µ l 및 25% 희석에서 RNase 블록의 2 µ l 3.0 Mb.
    5. 각 잘 캡처 라이브러리/RNase 블록 믹스의 7 µ L을 포함 하 게 교 잡 버퍼의 37 µ L를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 혼합을 포함 하는 접시를 간단히 원심.
    6. 단계의 3.7.5 gDNA 풀 플레이트의 각 샘플 캡처 라이브러리 혼합물의 전체 44 µ L를 전송 하는 멀티 채널 피 펫을 사용 하는 동안 65 ° C에서 gDNA 풀 플레이트를 유지 합니다. 천천히 10 번에 8 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
    7. 돔형된 스트립 모자 우물을 봉인. 모든 우물은 완전히 봉인 되어 다는 것을 확인 하십시오. 압축 매트 열 cycler에서 PCR 접시를 놓습니다.
    8. 65 ° c.에 24 h에 대 한 교 잡 혼합물을 품 어 참고: 샘플 최대 72 h에 대 한 때 교배 될 수 있지만 확장된 교 잡 샘플 우물에서 광범위 한 증발을 발생 하지 않습니다 확인 해야 합니다.
  8. 마그네틱 구슬 streptavidin 입히는의 준비
    1. 워시 버퍼 2 물 목욕 또는 열 블록에서 65 ° C에서 prewarm
    2. 적극적으로 소용돌이 믹서에 Streptavidin 자석 구슬 resuspend. 마그네틱 구슬 보관 시 정착.
    3. 각 교 잡 샘플을 PCR 격판덮개의 우물에 resuspended 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
    4. 비즈를 세척 하 고 바인딩 버퍼의 200 µ L에 그들을 resuspend.
  9. Streptavidin 비즈를 사용 하 여 교배 DNA의 캡처.
    1. 예상 하 고 24 시간 배양 후 남아 있는 교 잡 솔루션의 볼륨을 기록 합니다.
    2. 65 ° C에서 교 잡 플레이트를 유지 하 고 전체 볼륨 (약 60 µ L) 전송 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 씻어 streptavidin 구슬의 200 µ L을 포함 하는 접시 우물에 각 교 잡 혼합물의. 3 5 번 위아래로 천천히 pipetting으로 잘 섞는다.
    3. 우물 뚜껑 하 고 캡처 접시 Nutator 믹서 또는 상응 하는 실 온에서 30 분 동안에 품 어. 샘플 제대로 우물에 혼합 하는 다는 것을 확인 하십시오.
    4. 짧게 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자에 캡처 접시.
    5. 현 탁 액에서 구슬 수집 하 자석 분리기에 캡처 접시를 넣어. 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
    6. 워시 버퍼 1의 200 µ L에 구슬 resuspend. 비즈는 완전히 resuspended 때까지 아래로 pipetting으로 혼합.
    7. 짧게 원심 분리기는 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자에.
    8. 자석 분리기에 접시를 넣어.
    9. 취소, 다음 제거 하 고 삭제는 상쾌한 솔루션에 대 한 기다립니다.
  10. 후 샘플 다중화 시퀀싱에 대 한 처리를 캡처합니다
    1. 다음 혼합 하 여 PCR 반응 혼합물의 적절 한 볼륨을 준비: 9 µ L Nuclease 무료 물, 25 µ L 뇌관 확대의 수에 따라 믹스 마스터 믹스와 1 µ L. 와 동 믹서를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 얼음에 계속.
    2. 각 증폭 반응, PCR 격판덮개의 우물에서 35 µ L 단계 3.10.1에서에서 PCR 반응 혼합물의 장소.
    3. 각 구슬 서 스 펜 션은 균질 되도록 아래로 구슬 바인딩된 캡처된 도서관 풀 샘플 플라스틱.
    4. 적절 한 PCR 반응 혼합물에 잘 각 캡처된 도서관 풀 비드 서 스 펜 션의 15 µ L를 추가 합니다. 구슬 서 스 펜 션은 균질까지 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
    5. 포인트 열 cycler에서 3.10.2 준비 접시를 놓고 다음 PCR 증폭 프로그램 실행: 2 분, 30 대 98 ° C에서 8 ~ 11 사이클 동안 98 ° C s, 60 ° C 30 s, 1 분에 72 ° C에 대 한 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. 샘플 4 ° c.에서 개최
    6. 샘플 제조 업체 프로토콜에 따라 구슬 기반으로 정화와 정화.
    7. Bioanalyzer 제조 업체 프로토콜에 따라 품질을 평가 합니다.
  11. 시퀀싱 다중화 샘플 준비
    참고: 최종 농축된 샘플 포함 8 또는 16 인덱싱된 라이브러리, 캡처 라이브러리 크기에 따라 전략을 풀링 캡처 전 결과의 풀. 인덱싱된 라이브러리를 단일 연속 차선에 멀티플렉스 수의 총 수는 시퀀싱 데이터 캡처 라이브러리에 필요한 금액을 함께 사용 하는 플랫폼의 출력 사양에 의해 결정 됩니다.
    1. 플랫폼의 용량에 따라 레인, 당 결합 될 수 있는 인덱스 수를 계산 합니다. 인덱싱된 라이브러리를 단일 연속 차선에 멀티플렉스 수의 총 수는 시퀀싱 데이터 캡처 라이브러리에 필요한 금액을 함께 사용 하는 플랫폼의 출력 사양에 의해 결정 됩니다. 예를 들어 인간의 모든 Exon v5 라이브러리에 대 한 인덱스 라이브러리 당 권장 시퀀싱 데이터는 4gb 이며 캡처 전 풀 당 권장 시퀀싱 데이터 32 기가바이트 (8-인덱스 풀).
  12. 라이브러리를 시퀀스.
    1. 선택의 차세대 시퀀싱 플랫폼에 라이브러리를 로드 하 고 시퀀싱 장비 사양에 따라 실행을 수행 합니다.
  13. Exome 시퀀싱 데이터를 분석 합니다.
    1. 파이프라인 및 기본 통화에 대 한 선택의 소프트웨어를 실행 합니다. 예를 들어 읽기20지도, 피 (http://broadinstitute.github.io/picard/)와 중복을 제거 하 고 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 및 삽입 또는 삭제 오리너구리21(indels)의 식별에 Stampy를 사용 합니다. 동의어 이체와는 대립 유전자 주파수에 관찰을 필터링 < 5%와 비교 데이터 드 노 보 이체를 식별 하기 위해 부모의 exomes에서.

4. 플라스 미드 DNA 준비 Electroporation Utero에 대 한

  1. 디자인 코딩 시퀀스 또는 3' UTR 앞에서 설명한22후보 유전자의 대상으로 몇 가지 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs).
  2. 목표 방지 효과 폭발 검색 표준 방법을 사용 하 여 데이터베이스에 대해 shRNAs 특이성을 테스트. 다른 쥐 유전자 complementarity의 50% 이상 표시 하는 shRNAs를 제외 합니다.
  3. 로 mU6 프로 벡터에 클론 단련 oligonucleotides23이전 설명.
  4. 제조업체의 지침에 따라 맥시 준비와 함께 DNA 플라스 미드 정화 하 고 3 µ g / µ L의 최종 농도 확인.
  5. DNA (0.5 mg/ml pCAGGS-GFP 혼자 또는 1.5 mg/ml shRNA의 구성 중 하나)의 aliquot 20 µ l의 빠른 2 µ L을 추가 하 고 녹색 염료 (2 mg/mL) 주입의 비주얼 모니터링 허용.

5. Electroporation Utero에서

  1. 외과 절차
    1. E15.5 임신 여성 쥐 (E0 정자 긍정적인 질 플러그의 확인 당일으로 정의 되었다), 케 타 민/xylazine의 혼합물으로 결합을 사용 하 여 anesthetize (0.1과 0.01 mg 바디 당 무게, 각각),이 한 복을 통해 주어진 다 마 취 유도 주입
    2. 동물 발가락 핀치 반사의 실종을 관찰 하 여 완전히 마 취 다는 것을 확인 하십시오.
    3. 동물의 아랫 배 모피를 제거 하는 클리퍼를 사용 하 여 면도. Povidone-요오드와 70% 알코올의 스크럽을 사용 하 여 피부를 소독. 수 의사 연 고 마 취 상태에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
    4. 열원에는 동물을 배치 하 고 절 개 사이트에 (중간에 4-5 cm의 열린 창)와 살 균 드 레이프를 넣어. 검, 실험실 외 투, 모자, 그리고 무 균 수술 장갑을 착용 하십시오. 수술의 끝까지 불 임을 유지 합니다.
    5. 수직 절 개 (2-2.5 cm) 꼬리 복 부에서 정중 선 따라 피부에서 확인 하 고 다음 피부 아래 근육 벽의 절 개를 날카로운가 위를 사용 하 여-2.5 c m의도-중간 선 따라.
    6. 신중 하 게 복 부 구멍에서 한 자 궁 경적 노출. 37 ° C 배아 수 분을 미리 데워 정상적인 염 분 해결책을 드롭. 계속 자 궁 습 한 모든 시간.
  2. DNA와 electroporation의 주입
    1. 부드럽게 낀된 집게와 자 궁 뿔 중 하나를 보유 하 고 하나의 배아 자 궁 벽에 밀어. 태아 한 손으로 다른 손 삽입와 신중 하 게 유리 모 세관 1 m m는 중간에서 왼쪽된 측면 뇌 실 (2-3 밀리미터 깊은)으로 누른 주사 주사를 사용 하 여 시각적 모니터링 수 있도록 빠른 그린으로 DNA의 약 1 µ L를 microinjector입니다.
    2. 3 x 7 mm2 전극 표면에 정상적인 염 분 해결책을 드롭. 우 심 실에 삽입 된 측 (왼쪽된 측면 뇌 실)에 긍정적인 살 균 전극과 음수 살 균 전극을 놓습니다. 발 통제 페달 (4000 mF 커패시터 40 V는 electroporator 청구)와 950 ms 간격 5 전기 펄스를 제공 합니다.
  3. 게시물 electroporation 절차
    1. 다시 자 궁 뿔 복 부 구멍, 자가 유체 손실에 대 한 고려를 배아 더 자연스럽 게 배치 하 고 구멍에 정상적인 염 분 해결책의 방울을 추가 합니다.
    2. 다음 흡수 수술 봉합, 복 부 근육 벽 간단한 중단 스티치를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
    3. 쥐 감 금 소에 다시 넣어 고는 마 취에서 나온다 때까지 동물을 모니터링 합니다.
    4. 통증 관리에 대 한 관리 buprenorphine (0.03 mg/kg) 동물 피하 주입에 의해 매 8-12 h 48 h에 대 한.

6. 두뇌 샘플 준비

  1. 고정 방법
    1. 가스 마 취 (isoflurane) 빠른 자 궁 경관 탈 구 다음을 사용 하 여 수술 후 5 일 임신 쥐를 희생.
    2. 다시 복 부 구멍을 열고 수직 절 개를 확인 합니다.
    3. 노출 자 궁 뿔, 자 궁에서 태아를 제거 하 고 그들을 침 살 할 날카로운가 위를 사용 하 여.
    4. 조직에 최소한의 손상으로 두뇌를 제거: 후부 (소 뇌)을 따라 작은 절 개 / 피어스는 피부와 두개골, 집게의 쌍을 사용 하 여 머리의 앞쪽 (후 근) 축 벗 겨 폭로 두개골 날카로운가 위를 사용 하는 뇌 고 작은 주걱을 사용 하 여 제거 합니다.
    5. 두뇌는 4%에 4 ° C에 하룻밤을 담가 Paraformaldehyde 인산 Buffered 식 염 수 (PBS) x 1에서.
  2. 뇌 단면
    1. 10 분의 1 x PBS에 머리를 씻어.
    2. 플라스틱 금형을 포함 한 천 4%에에서 두뇌를 포함 합니다.
      1. 5 미 발달 두뇌를 포함에 대 한 1 x PBS에 4 %agar 50 mL를 준비 합니다. 더 이상 50 ° c.에 그 녹은 agarose 확인
    3. 4 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 유해를 agarose에서 두뇌를 유지 뇌 주변의 초과 agarose를 제거 합니다.
    4. 두뇌를 뇌의 앞쪽/후부 축 블레이드에 수직 이므로 지향 vibratome 베이스 플레이트에 붙입니다. 건조 하 고 붙어 뇌와 플레이트 vibratome 챔버를 접착제에 대 일 분 정도 기다립니다.
    5. 1 x PBS로는 vibratome를 채우십시오. 100 µ m 두꺼운 부분을 슬라이스.
    6. 슬라이드에 뇌 조각을 옮기고 과잉 액체를 제거, 설치 매체의 몇 방울을 추가 하 고 머리 위에 coverslip 장소

7. confocal 영상 및 정량 분석

  1. 하룻밤 전에 이미징 장착 중간 건조 하자. 레이저 검사 confocal 현미경에 X 10에 이미지 섹션입니다.
  2. 양적 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 8 비트, 선택 한 대표적인 GFP 긍정적인 형광 셀에 이미지를 변환 하 고 그 모양을 수동으로 정의. 이렇게 하려면 "견적"에 클릭 하 고 자유형 선택 도구를 사용 하 여 셀의 테두리를 그립니다. 이 방법은 직경 및 셀의 강도 임계값 자동으로 유지 됩니다 소프트웨어.
  3. 클릭 "찾기 셀"에 transfected 세포 피 질을 통해 지역화를 소프트웨어 수 있도록. 그런 다음 필요한 경우 수동으로 가양성 제거 합니다.
  4. 8 관심 분야의 개별 섹션에 정규화에 외피의 전체 두께 나눕니다. 이 위해 "지역 도구"를 클릭, 선택 8 "지역 줄무늬"를 (1) 첫 번째 및 마지막 (8) 줄무늬는 각각 VZ 하 고 CP의 상단에 해당. 전체 피 질에서 GFP 페 셀의 상대 위치를 계산 하는 소프트웨어를 허용 하도록 "적용"을 클릭 하십시오. 마지막으로 분석을 위한 Excel 파일에서 데이터를 내보내려면 "정량화 저장"을 클릭 하십시오.

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결과

소설 상승할 원인 유전자를 식별 하도록 설계 된 실험 전략은 그림 1에서 지.

변함없이 PNH (그림 2A), 신체 callosum dysgenesis, colpocephaly, 소 뇌 hypoplasia 및 간 질와 관련 된 polymicrogyria를 결합 하는 발달 두뇌 이상으로 155 환자의 코 호트에서 배열 CGH를 수행 하 여 증 및 인지 장애, 우리는 12 환자 (그림 2B)21에 의해 공유 하는 6q27에 1.2 m b의 최소한의 중요 한 삭제를 확인. 게놈 지역 포함 4 개의 알려진된 유전자 (THBS2, PHF10, TCTE3 및 DLL1)와 2 유전...

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토론

MCDs는 지적 장애 및 약물 내성 유년기 간 질1,2의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. MCDs에 관심 두 가지 주요 요인으로 인해 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다. 첫 번째는 개선 의사와 과학자는 이전 인식 하지 많은 두뇌 기형의 시각화 하을 수 있는 이미징 (특히 MRI) 두뇌에서. 다른 많은 소설 상승할 원인이 유전자의 id 허용 유전 도구의 발전 이다. 이것은 크게 기초 두뇌 개발 및 기능, 그리고 더 정확한 유전 상담에 대 한 허용 하는 메커니즘의 우리의 지식을 향상.

과거에는, 연구원은 나중 단계에 두뇌 개발에 그들의 역할을 명확 하 게 기능적인 분석 실험의 디자인을 떠나 원인 유전자 식별에 주로 그들의 노력을 집중. 이 메서드는 의무가 찾는 어떤 전통적인 유전자에 대 한 보다 일반적인 산발적 장애, 재발 성 유전 질환의 연구에서 진행으로 인해 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리 박사 G. McGillivray 감사 홍보 제이 클레이튼-스미스, 홍보 P. Striano, 홍보 즉 Scheffer, 홍보 S.P. Roberston, 홍보 W.B. Dobyns 상승할 환자를 제공 하기 위한 홍보 김포 Berkovic. 우리 기술 조언 및 도움에 대 한 박사 F. 미셸과 디 메이 감사합니다. 이 작품은 EU의 7 프레임 워크 프로그램에서 자금에 의해 지원 되었다 욕망 프로젝트, 계약 번호: 건강-F2-602531-2013 년 (V.C., 립에 아칸소, A.F. 및 참조), INSERM (아칸소를 참조), Fondation 제롬 Lejeune (A.F, E.P.P 및 많은 R13083AA)와 지구의 프로방스 알프 코트 다쥐르 (APO2014-DEMOTIC 참조 및 A.A.D) D.A.K EMBO 젊은 수 사관 이며 뒷받침 FWF 부여 (I914 및 P24367).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900세포 내 미세주입 디스펜스 시스템
패스트 그린 FCFSigma-AldrichF7252패스트 그린 주사의 시각적 모니터링 가능
BTX ECM 830 전기천공기BTX Harvard Apparatus45-0002ECM 830은 in vitro 및 in vivo 애플리케이션을
위해 설계된 구형파 펄스 발생기입니다.Microtome HM 650 VMicrom10076838Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz(진동 블레이드 포함
) FluoView 300OlympusOlympus FluoViewTM 300은 생물학 연구 응용 분야용으로 설계된 포인트 스캔, 포인트 감지, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경입니다
eCELLence 소프트웨어Glance Vision TechnologieseCELLence는 세포 이동의 정량 분석을 위해 설계된 소프트웨어입니다
1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K 또는 8 x 15K용질런
n G4900DA 또는 G2565CA
하이브리드화 챔버, 스테인리스애질런트질런트 p/n G2534A어레이 CGH 하이브리드화
혼성화 챔버 개스킷 슬라이드, 어레이용 5팩개스킷 1팩 마이크로어레이용 CGH 하이브리드화
또는2Agilent p/n G2534-60003
또는4Agilent p/n G2534-60002
또는8용 Agilent p/n G2534-60011
Agilent p/n G2534-60014
혼성화 오븐AgilentAgilent p/n G2545A
Agilent 마이크로어레이 혼성화 챔버용 하이브리드화 오븐 회전자AgilentAgilent p/n G2530-60029
가열식 뚜껑이 있는 열 순환기AgilentAgilent p/n G8800A 또는 동급의큐베이션용 Termal cycler
1.5mL RNase-free Microfuge TubeAmbionp/n AM12400 또는 동급의마이크로 원심분리기
마그네틱 교반 막대Corningp/n 401435 또는 동급Qubit
FluorometerLife Technologiesp/n Q32857DNA 정량화를 위한 기기
Qubit dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기Invitrogenp/n Q32850Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS 분광 광도계Thermo ScientificNanoDrop 8000 또는 2000 또는 동급기기 DNA 정량화용 기기
P10, P20, P200 및 P1000 피펫Pipetman 또는 동급DNA 분배기
진공 농축기Thermo Scientificp/n DNA120-115 또는
동급		DNA 농축 기기
SureTag Complete DNA Labeling KitAgilentp/n 5190-4240DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
정제 컬럼(50개)Agilentp/n 5190-3391DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
AutoScreen A, 96웰 플레이트GE Healthcarep/n 25-9005-98DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
GenElute PCR 클린업 키트Sigma-Aldrichp/n NA1020DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
인간 게놈 DNAp/n G1521DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)
CGH 마이크로어레이용:Promega(여성) 또는 p/n G1471(남성)어레이 CGH 제어 DNA
CGH+SNP 마이크로어레이용:Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 또는 NA18579어레이 CGH 제어 DNA
올리고 aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 키트 또는애질런트p/n 5188-5226어레이 CGH 혼성화 및 세척
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 1 및Agilentp/n 5188-5221어레이 CGH 하이브리드화 및 워시
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 워시 버퍼 2Agilentp/n 5188-5222어레이 CGH 하이브리드화 및 세척
안정화 및 건조 솔루션Agilentp/n 5185-5979어레이 CGH 하이브리드화 및 워시
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 하이브리드화 키트애질런트p/n 5188-5220 (25) 또는 p/n 5188-5380 (100)어레이 CGH 혼성화 및 세척
Human Cot-1 DNAAgilentp/n 5190-3393어레이 CGH 혼성화 및 세척
Agilent C 스캐너어레이 CGH 슬라이드용애질런트
SureSelect XT2 시약 키트Kit for target enrichment
HiSeq 플랫폼(HSQ), 16개 시료애질런트p/n G9621A
HiSeq 플랫폼(HSQ), 96 샘플애질런트p/n G9621B
HiSeq 플랫폼(HSQ), 480 샘플애질런트p/n G9621C
MiSeq 플랫폼(MSQ), 16 샘플애질런트p/n G9622A
MiSeq 플랫폼(MSQ), 96 샘플애질런트p/n G9622B
MiSeq 플랫폼(MSQ), 480 샘플애질런트p/n G9622C
DNA 1000 KitAgilentp/n 5067-150425 - 1000 bp의 dsDNA 단편의 분리, 크기 조정 및 정량화를 위한 키트.
고감도 DNA 키트Agilentp/n 5067-4626키트: 단편화된 DNA 또는 DNA 라이브러리 분석용 키트.
자동 PCR 정제를 위한AMPure XP Kit
5 mLAgencourtp/n A63880
60 mLAgencourtp/n A63881
450 mLAgencourtp/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1비오틴화 핵산의 분리 및 취급
2 mLLife TechnologiesCat #65601
10 mLLife TechnologiesCat #65602
Quant-iT dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기DNA 정량
분석 100 어세이, 2-1000ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 어세이, 2-1000ngLife TechnologiesCat #Q32853
Qubit 어세이 튜브Life Technologiesp/n Q32856DNA 정량
SureSelec tXT2 캡처 라이브러리애질런트는실험에 따라라이브러리 캡처
키트, SureCycler 8800 Thermal Cycler, Agilentp/n G8800ADNA 증폭
96웰 플레이트 모듈, SureCycler 8800 Thermal Cycler,Agilentp/n G8810ADNA 증폭
, SureCycler 8800 호환 96웰 플레이트, Agilentp/n 410088DNA 증폭
광학 스트립 캡애질런트p/n 401425DNA 증폭
튜브 캡 스트립, 돔형애질런트p/n 410096DNA 증폭
압축 매트애질런트p/n 410187DNA 증폭
2100 바이오분석기 노트북 번들애질런트p/n G2943CADNA 증폭
2100 바이오분석기 전기영동 세트애질런트p/n G2947CADNA 증폭
Covaris 시료 전처리 시스템, E-시리즈 또는 S-시리즈CovarisDNA 전단
Covaris 시료 홀더p/n 520078DNA 전단
Nutator 플레이트 믹서BD Diagnosticsp/n 421105 또는 동급의플레이트 믹서
GaIIxIllumina차세대 염기서열분석 기계
. 애트 마이크로어레이 번들 어레이 슬라이드 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K 또는 8 x 60K용 애질런트 애질런트 p/G2565BA G2565CA G4900DA 애용 챔버 팩 마이크로어레이용 팩 마이크로어레이용 팩 마이크로어레이 인의 스캐너 Kit Kit.

참고문헌

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