여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배우자의 감수분열 중 염색체 분리 오류는 이수성으로 이어질 수 있으며, 이는 나중에 수정 시 배아로 전달됩니다. 발달 중인 배아에서 발생하는 이수성은 임신 상실 및 다운 증후군과 같은 선천적 선천적 결함의 주요 원인으로 인식되고 있습니다. 정확한 염색체 분리는 미세소관 방추체 장치의 형성에 결정적으로 의존하지만, 이 과정은 포유류 난모세포에서 잘 이해되지 않고 있습니다. 흥미롭게도, 감수분열 방추체 조립은 유사분열과 다르며, 적어도 부분적으로는 독특한 미세소관 조직 센터(MTOC)에 의해 조절됩니다. MTOC 관련 단백질의 평가는 감수분열 방추체 형성 및 조직을 지배하는 조절 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 siRNA 매개 접근법을 사용하여 기능을 테스트하기 위해 마우스 난모세포를 분리하고 MTOC 관련 단백질을 고갈시키는 방법을 설명합니다. 또한 감수분열 방추체 형성 및 조직을 평가하기 위해 난모세포 고정 및 면역형광 분석 조건을 설명합니다.
서론
감수 분열은 생식 세포 (난자와 정자)에서 발생하고 감수 분열-I 및 감수 분열-II, 각각 1시 상동 염색체와 자매 염색 분체를 분리하는 DNA 합성을 개입하지 않고 두 개의 연속 부문을 포함하는 고유의 분할 과정이다. 난자의 감수 분열시 염색체 분리의 오류 수정시 배아 상속 이수성,이 발생할 수 있습니다. 특히, 개발 배아의 염색체의 발생률은 산모의 나이 발전과 함께 증가하고 여성 1,2 임신 손실뿐만 아니라 선천성 기형아 출산의 주요 원인이며, 따라서, 감수 분열시 염색체의 분자 기초를 이해하는 중요한 필요성을 강조 .
세포 분열시 염색체 분리 반대 스핀들에 올바른 부착에 대한 미세 소관 스핀들 장치 및 안정적인 염색체 미세 소관의 상호 작용의 설립의 조립에 결정적으로 의존극. 중요한 것은, 포유 동물 난자의 감수 스핀들 형성은 체세포에서 유사 분열과 다른, 독특한 미세 소관 조직 센터 중심 소체 3,4 부족 (MTOCs)에 의해 조절된다. 미세 소관의 핵 및 조직에 필요한 필수 단백질은 미세 소관의 조립을 촉매 γ-tubulin에 포함 난자 MTOCs에 지역화. 또한,도 5에 결합 MTOCs 필수적인 비계 단백질로서 기능하고 앵커 γ-tubulin에뿐만 ....
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프로토콜
이 프로토콜은 조지아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 준비
- 갓 난자 문화, 구매 또는를 들어 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하고 표 1에 설명 된대로 3 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)과 보완. (제로 용기)로드 밸런스에 폴리스티렌 병을 놓습니다. 위해, BSA를 제외한 모든 시약을 추가하고 250g의 총 중량 MQ-물에 최종 볼륨을 가지고. 그런 다음, BSA를 추가 용해 및 필터 소독 할 수 있습니다.
주 : 설명 MEM 배지, 5 % CO 2, 5 % O 2, N 2 90 %의 의료 가스 혼합물로 평형화 세포 배양을 필요로한다. 그러나, 다른 미디어 (예 CZB)은 대기압 조건에서 5 % CO 2에서 세포 배양을 허용하는 사용될 수있다. - 난자의 미세 주입의 경우, 구매 또는 M2 매체를 준비합니다.
- P 준비5 IU / 100 μL의 농도로 우세한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG).
- 구입 및 1 μM의 작업 농도의 siRNA 주식을 재구성.
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결과
된 siRNA의 미세 주입은 시험관 내에서 상이한 타겟 요인 효율적이고 고도로 특정 기능을 테스트 할 수 난자의 mRNA의 분해 및 후속 단백질 고갈을위한 효과적인 방법을 제공한다. 이어서, 특정 면역 표현형 분석에 사용 된 siRNA뿐만 아니라 주입 난 모세포에 단백질 고갈을 검증. 현재 예에서, 안티 - 튜 불린 및 안티 pericentrin 항체와 함께 DAPI 개별 난자의 형광 표지를 사용할 수 :뿐만 아니라 pericentrin 고갈 (I) 확인 (II) 제어 모두 염색질 및 감수 스핀들 구성의 종합적인 평가와 PCNT - 고갈 난 모세포.
비 특정 제어 또는 PCNT siRNA를 미세 주입 된 난자의 대표적인 면역 형광 이미지. 그림 2 (7)에 표시됩니다 17 시간 배양 후, 대부분의 제어 난자는 중기-II 사슴에 도달전자 스핀들 기둥 (그림 2A)에서.......
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토론
이러한 전기 천공과 같은 형질 체세포로 외인성 핵산 전달을위한 여러 가지 방법이 있지만, 마이크로 인젝션은 전사적으로 정지 된 난 모세포에 마우스 RNA 분자의 전달을위한 최적의 방법이다. 현재의 프로토콜은 서로 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 테스트를 가능하게 특정의 mRNA의 체외 고갈에 대한 효과적인 접근 방법을 제공합니다. 이러한 접근 방식은 효율적인 성적 증명서 고갈을 초래하고 높은 적응력이다. siRNA는 특별히 PCNT 사체를 대상으로 사용 되었더라도, 유사한 조건은 관심 거의 모든 유전자를 표적으로 사용될 수있다.
난자 수집, 문화 및 조작을 포함하여이 프로토콜의 여러 측면, 난자의 질을 유지하기 위해 기술 유물을 방지하기 위해 연습과 경험을 필요로한다. 배양 배지의 pH 및 / 또는 온도의 변동은 전자 작동함으로써 회피되어야xpediently 조심스럽게. 난자 소그룹의 마이크로 인젝션, 및 유해한 온도.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다
감사의 글
이 연구는 조지아 대학의 일부 지원을 받았으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 MMV에 대한 보조금(HD071330)으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *표 1에 명시된 레시피 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium 바이카보네이 | 시그마 | S-5761 | |
| 피루브산, 나트륨 염 | 시그마 | P-5280 | |
| 페니실린 G, 칼륨 염 | 시그마 | P-7794 | |
| 스트렙토마이신 설페이트 | 시그마 | S-9137 | |
| L-글루타민 | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, 디소듐 솔트 디하이드레이트 | Sigma | E-4884 | |
| 필수 아미노산 (50개) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM 비타민 혼합물 (100x) | Sigma | M-6895 | |
| 페놀 레드 용액 | Sigma | P-0290 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A1470 | |
| 밀리논 | Sigma | M4659 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 미디어 with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| 음성 대조군 siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| 파라포름알데히드(16% 용액) | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| 염소 안티 랍빗 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| 염소 안티 마우스 Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| 주요 장비 | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent 현미경 | Leica Microsystems | ||
| 도립 현미경 | Nikon | ||
| Femtojet 마이크로 주입 시스템 | , Eppenforf | ||
| 마이크로 매니퓰레이터 | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles(펨토팁) | Eppendorf | 930000035 | |
| 고정 피펫(VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm 배양 접시 | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4웰 플레이트 | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96웰 플레이트 | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA 필터 시스템 | Corning Life Sciences | 430768 |
참고문헌
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.
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