마이크로 웨이브 조사를 사용하여 잠재적 인 기생충 치료제로 백본 순환 펩타이드 라이브러리 개발

Summary

마이크로파 조사를 사용하여 고리형 펩타이드를 합성하는 간단하고 일반적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 절차는 곁사슬과 약전 부분을 유지하면서 서로 다른 형태의 집합체를 가진 backbone cyclic peptides의 합성을 가능하게 하며, 따라서 생체 활성 형태를 스크리닝할 수 있습니다.

Abstract

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 ​​거의 모든 생물학적 과정에 밀접하게 관여하고 많은 인간의 질병에 연결됩니다. 따라서, 기초 연구 및 제약 산업에서 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 주요 노력이있다. 단백질 - 단백질 인터페이스 플랫 보통 대형이고, 종종 표적 부위 작은 분자의 발견을 복잡 포켓이 부족하다. 항체를 사용하여 대체 타겟팅 방식은 가난한 경구 생체 이용률, 낮은 세포 투과성 및 생산의 비 효율성으로 인해 제한이 있습니다.

PPI 인터페이스를 타겟팅 펩타이드를 사용하는 것은 몇 가지 장점을 갖는다. 펩티드는 높은 구조적 유연성 증가 선택성을 가지며, 일반적으로 저렴하다. 그러나, 펩티드는 가난한 안정성과 효율성 건너 세포막을 포함하여 자신의 한계를 가지고있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 펩티드 고리 화 반응이 수행 될 수있다. 환화 펩티드 선택성을 향상시키기 위해 설명되었다, 대사 안정성 및 생체 이용율. 그러나, 고리 형 펩티드의 생체 활성 입체 형태를 예측하는 것은 단순하지 않다. 이 문제를 극복하기 위해, 하나의 매력적인 접근 모든 백본 순환 펩티드가 동일한 기본 순서를 가지고 있지만, 이러한 링 크기와 위치 등 자신의 형태에 영향을 미치는 매개 변수에 차이가있는 화면에 초점을 맞춘 라이브러리를 화면으로 이동합니다.

우리는 특정 기생충 프로톤 펌프 억제제를 표적 백본 환상 펩티드 라이브러리를 합성하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 합리적인 설계 방식을 사용하여, 우리는 활성화 된 C-키나제 (LACK)의 골격 단백질 패 eishmania 수용체에서 유래 펩티드를 개발했다. 우리는하지만 포유류의 호스트 상 동체에, 기생충에 보존되어 부족 시퀀스, 기생충 '생존에 중요한 단백질 상호 작용 사이트를 나타낼 수 있다는 가설을 세웠다. 환형 펩티드는 반응 시간을 감소시키고 증가시키는 마이크로파 조사를 이용하여 합성했다능률. 다른 크기의 환 골격 환상 펩티드 라이브러리를 개발하는 것은 대부분의 생물학적 활성에 대한 체계적인 형태 화면을 용이하게한다. 이 방법은 고리 형 펩티드를 합성, 일반 신속하고 용이 한 방법을 제공한다.

Introduction

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 세포 내 신호 전달에서 세포사 ^1, 가장 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다. 따라서, 프로톤 펌프 억제제를 대상으로하는 기초 연구 및 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 중요하다. 프로톤 펌프 억제제는 구체적이고 안정적​​인 항체에 의해 규제하지만, 항체 제조 및 가난한 생체 이용률을 가지고 비싸고 어려운 할 수 있습니다. 또한, 프로톤 펌프 억제제는 작은 분자의 대상이 될 수있다. 소분자는 항체에 비해 합성 쉽고 저렴; 그러나, 이들은 상대적으로 유연성이 큰 단백질 - 단백질 인터페이스 ^2,3-보다 작은 공동에 잘 맞게. 다양한 연구는 간단하고 저렴 항체보다 작은 분자보다 더 유연 펩타이드, 단백질 인터페이스를 결합하고 프로톤 펌프 억제제 ^4,5 조절할 수 있음을 증명하고있다. 글로벌 치료 펩타이드 시장은 2013 년 백오십억 달러의 주위에 평가하고, 10.5 %의 annua 성장하고있다에서야 ^6. 또한, 50 개 이상의 판매 펩티드, 임상 시험의 다른 단계에서 약 270 펩티드, 고급 전임상 단계 ^7에서 약 400 펩티드가있다. 많은 펩타이드 약물로 사용되고 있지만, 펩티드가 여전히 불량한 생체 이용률 및 안정성 횡단 세포막에서 비효율과 구조적 유연성 ^8,9 포함한 광범위한 적용을 제한 여러 과제를 제기. 이러한 단점을 극복하기위한 하나의 대안은 로컬 (D- 아미노산 및 N- 알킬화) 및 글로벌 (고리) 제약 ^8,10-12로 다른 수정 사항을 적용하는 것입니다. 이러한 수정은 자연적으로 발생합니다. 예를 들어, 시클로 스포린 A는 면역 억제제 환상 천연 펩티드는 단일 D- 아미노산을 포함하고, N-알킬화 변형 ^13,14 겪는다.

천연 아미노산의 변형은 종종 영향을 펩티드, 예컨대 D- 및 N- 알킬화 같은 로컬 제약을 유도9;의 생물학적 활성. 그러나, 관심있는 서열이 동일하게 유지 될 수있는 고리 화 반응은 생물학적 활성을 유지하기 쉽다. 환화 다른 배좌 사이의 평형을 줄여 펩타이드 구조적 공간을 제한하는 매우 매력적인 방법이다. 그것은 일반적으로 하나의 기능을 매개 활성 형태에 펩타이드를 제한하여 생물학적 활성과 선택도를 증가시킨다. 환화는 덜 분해 효소에 의해 인식되는 펩티드의 형태를 유지함으로써 펩티드의 안정성을 향상시킨다. 실제로, 순환 펩티드들은 선형 대응 ^{15 ~ 17에} 비해 대사 안정성, 생체 이용률 및 선택성을 향상 것으로 나타났다.

그러나, 고리는 경우에 따라 제한을 달성 생체 활성 형태로 펩티드를 방지 할 수 있기 때문에 양날의 검이 될 수있다. 이 장애물을 극복하기 위해 초점을 맞춘 도서관은 모든 펩티드는 동일한 기본 sequenc이즉 결과적으로 일정한 약물 조제를 합성 할 수있다. 펩티드 라이브러리의 순서이어서 대부분 생리 활성 형태 ^9,18 스크리닝하는 이러한 링의 크기와 위치로서 그 구조에 영향을 미치는 매개 변수에서 다르다.

펩티드 용액 이제 더 널리 펩티드 합성 방법이며 더 논의 될 것이다 고상 펩티드 합성 (SPPS) 접근법에 의해 양으로 합성 할 수있다. SPPS 화학적 변형은 화합물의 합성 ^(19)의 넓은 범위를 준비하는 링커를 통해 고체 지지체에 의해 수행되는 프로세스이다. SPPS는 N 말단에, 고체 지지체에 부착 된 C 말단으로부터 단계적으로 아미노산의 연속 펩티드 결합에 의해 조립을 가능하게한다. N-α 아미노산 측쇄는 세인트 당 하나의 아미노산의 첨가를 위해 펩타이드 신장 동안 사용 된 반응 조건에 안정한 보호기로 마스킹되어야EP. 마지막 단계에서, 펩티드는 수지로부터 방출되고 보호기 측쇄는 병용 제거된다. 펩타이드를 합성하는 동안, 모든 수용성 시약을 여과에 의해 펩티드 - 고체 지지체 매트릭스로부터 제거하고 각각의 커플 링 단계의 끝에서 씻겨 수있다. 이러한 방식으로, 높은 농도에서 시약의 과량 완료 커플 링 반응을 구동 할 수 있으며 모든 합성 단계는 재료 ^(20)의 임의의 이동없이 동일한 용기 내에서 수행 될 수있다.

SPPS은 반응 ^{21 모니터링} 불완전 반응, 부반응, 불순한 시약뿐만 아니라 문제의 생산과 같은 어떤 한계가 있지만, SPPS의 장점은 펩티드 합성 "금 표준"만들었다. 이러한 장점에 기인하는 비 천연 아미노산, 자동화, 간편한 정제를 통합하는 옵션, 물리적 손실을 최소화하고, 과량의 시약의 사용을 포함높은 수율. SPPS는 곤란 서열 ^{21, 22, 23의} 형광 변형, 펩타이드 라이브러리 ^{(24, 25)의} 합성에 매우 유용한 것으로 밝혀졌다. SPPS 또한 올리고 뉴클레오티드 ^{(26, 27),} 올리고당 ^{28, 29,} 펩티드 핵산 ^{(30, 31)와} 같은 다른 폴리 체인 어셈블리를위한 매우 유용합니다. 흥미롭게도, 어떤 경우에는, SPPS 전통적 용액 ^32,33에서 만들어진 작은 분자를 합성하기위한 유리한 것으로 나타났다. SPPS 업계 ^36-38에서 연구 및 교육 ^{(34, 35)에} 대한 소규모뿐만 아니라 대규모에 모두 사용된다.

주로 펩티드 합성 SPPS 방법에 사용되는 두 개의 합성 전략 옥시 카르 보닐 (BOC) 9- 플루 오레 닐메 톡시 카보 닐 (Fmoc)이다. SPPS 도입 원래 전략은 R로부터 펩티드 보호기 측쇄를 제거하고 절단하는 강산성 조건이 필요 BOC이었다esin. FMOC 계 펩티드 합성은, 그러나, 적당한 염기 조건을 이용하고, 산 - 불안정성 BOC 프로토콜 ^39에 경한 대안이다. 및 Fmoc 전략은 산성 조건 하에서 수지로부터 펩티드를 절단하면서 합성의 마지막 단계에서 제거된다 직교 t- 부틸 (tBu 중에서) 측쇄 보호를 이용한다.

고체 지지체상의 펩티드 합성을위한 일반적인 원리는도 1에 제시된다. N-α 말단의 임시 보호기에 의해 마스크 초기 아미노산은 C- 말단에서 수지 상에 로딩된다. (도 1, 단계 1) 필요에 따라 측쇄를 마스크하기 반영구 보호기 또한 사용된다. 대상 펩티드의 합성 N-α-임시 보호기의 탈 보호의 반복적 인 사이클의 다음 보호 된 아미노산 (도 1, 단계 2) 및 커플 링 (도 1의 N 말단에 C 말단으로부터 조립 옹> 단계 3). 마지막 아미노산 (도 1, 단계 4)을로드 한 후, 펩티드를 수지 지지체로부터 절단하고 반영구 보호기는 (도 1, 단계 5)을 제거한다.

고상 펩티드 합성의도 1은 일반적인 방식. N-α 보호 된 아미노산은 수지 (단계 1)에 링커를 통해 카르복실기를 사용하여 고정된다. 바람직한 펩티드는 N-α (단계 2) 및 아미노산 커플 링 (단계 3)로부터의 임시 보호기 (TPG)의 탈 보호의 반복 사이클에 의해 N 말단에 C 말단에서 선형 방식으로 조립된다. 합성 (공정 4)를 달성 한 후에, 반영구 보호기 (SPG)를 펩티드의 절단 (단계 5) 중 탈 보호된다.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 환화 (도 2A)에 대한 하나의 옵션, (B) 고리를 제공하기 때문에이 편리한 방법이지만 한정 - (A) 머리 - 꼬리 환화는 : 완전한 펩티드 사슬의 조립 후, 환화는 몇 가지 대안에 의해 달성 될 수있다 생활 성 관능기를 함유 관심 서열에서 아미노산을 사용하여 - 그러나, 이들 아미노산의 사용을 방해하지 않고 아미노산 (또는 다른 빌딩 블록)을 첨가하여 생물학적 활성 (도 2B), 및 (C) 고리 화에 영향을 미칠 수있다 생리 활성 순서. 그것이 관심 서열 (도 2C)를 수정하지 않고 집중 라이브러리의 제조를 허용하는 이들 분자를 도입하여 광범위하다.

에프2. 대안 igure 펩티드 고리 화 전략 C- 말단 및 N- 말단 사이의 펩티드 결합을 통해 꼬리 환화에 (A) 헤드.; 관능기 사이의 (B) 고리 등 / 글루탐산 (2), 또는 측쇄을 N- 또는 C- 말단 (3 아스파르트하는 시스테인 잔기 (1), 또는 라이신 측쇄 사이의 아미드 결합 사이의 이황화 결합로서 -4); (R0) 전 (R7) 생리 활성 순서 후에 예를 들어, 여분의 아미노산 또는 아미노산 유도체 또는 작은 분자를 추가하여 (C) 고리 화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

따라서 마이크로파를 이용한 유기 화학 촉진, 합성 반응을 가열하는 마이크로파 조사 사용은 ^{40, 41을} 변형. 마이크로파 화학은 흡수 용매 시약 능력 /에 기초전자 레인지 에너지 변환 ^(42)를 가열한다. 기술이 널리되기 전에, 주요 단점은, 제어 및 합성 프로토콜의 재현성과 충분한 온도 및 압력 제어 시스템 ^{(43, 44)로} 사용할 수의 부족을 포함 극복되어야했다. 마이크로파를 이용한 펩티드 합성의 첫 번째보고는 커플 링 효율 및 순도 ^(45)의 현저한 개선과 함께 여러 짧은 펩티드를 합성 주방 마이크로파 (7-10 아미노산)를 사용하여 수행 하였다. 또한, 마이크로파 에너지는, 연쇄 응집을 감소 부반응을 감소, 라세 미화를 제한하고, 모든 어렵고 긴 시퀀스 ^{46에서 53 사이에} 중요한 결합 율을 개선하기 위해 도시 하였다.

현재 고체 지지체상의 펩티드 또는 관련 화합물의 합성을위한 마이크로파 조사를 사용하는 유기 용매 ^(54)의 대신에 물 (A)의 합성을 포함하여 광범위하다; (B)의 합성 펩티드와이러한 합성에 의한 입체 장애 아미노산 유도체의 낮은 커플 링 효율로 일반적으로 곤란 또는 포스 포 글리코 펩티드 ^{55-58 59-61,} 일반적인 번역 후 변형; (C) 그 측쇄에 연결되어 질소 원자 ^(62), 또는 펩 토이 드와 아미노산 잔기의 C (α)의 대체에 의해 형성 될 수 azapeptides 같은 백본 변형 펩타이드의 합성 오히려 Cα 원자 ^{63, 64보다} 아미드 질소; (D) 순환 펩티드 ^65-71을 합성; 조합 라이브러리 ^51,72의 및 (E) 합성. 수많은 경우에서, 저자는 높은 효율을 종래보고 된 프로토콜에 비하여 마이크로파를 이용하는 제조 시간을 감소시켰다.

합리적인 디자인 ^73-75을 사용하여, 우리는 fo를 발판 패 eishmania의 수용체에서 파생 된 구충제 펩티드 개발R은 C-키나제 (부족) 활성화. 부족 슈만 편모충 감염 ^(76)의 초기 단계에서 중요한 역할을한다. 부족 낮은 수준을 표현하는 기생충이 부족하니이 필수 기생충 신호 프로세스와 단백질 합성 ^(78)에 관여으로도 면역 손상 쥐에게 ⁷⁷ 기생하지 못한다. 따라서 부족은 키 비계 단백질 ⁷⁹ 귀중한 약물 표적입니다. 하지만 호스트 포유류의 동체 랙에, 기생충에 보존되어 부족 시퀀스를 중심으로, 우리는 8 아미노산 펩타이드 문화 슈만 편모충 SP. 가능성을 감소 (RNGQCQRK)를 확인했다.

여기서는 상술 LACK 단백질 서열로부터 유래 된 골격 환상 펩티드 합성을위한 프로토콜을 기술한다. 펩티드의 Fmoc / tBu 중에서 프로토콜 SPPS 방법론에 의해 마이크로 웨이브 가열을 사용하여 고체 지지체 상에 합성했다. 펩티드는 아미드 결합 등을 통해 TAT _47-57 (YGRKKRRQRRR) 담체 펩티드에 접합 된SPPS의 일부입니다. 세포 내로화물의 다양한 TAT 기반 전송은 15 년 이상 사용되어왔다 및 세포 내 소기관으로 전달화물 ^80을 확인 하였다. 네 개의 다른 링커, 숙신산 및 글루 타르 산 무수물뿐만 아니라 디프 및 피 멜산는 4시 58분 탄소수 카르복시산 링커를 생성하는 고리 화 반응을 수행하는 데 사용 하였다. 고리 화 반응은 마이크로파 에너지를 사용하여 수행하고, 최종 절단 및 측쇄 탈 보호 단계는 마이크로파 에너지없이 수동으로 수행되었다. 자동화 된 마이크로파 합성기를 사용하면, 제품 순도를 향상 생성물 수율을 증가하고, 합성의 지속 기간을 감소시켰다. 이러한 일반적인 프로토콜은 시험 관내 및 생체 내에서 중요한 분자 메커니즘을 이해하고 상기 인간의 질병에 대한 잠재적 인 약물을 개발하는 펩티드를 이용하는 다른 연구에 적용될 수있다.

Protocol

1. 장비 및 시약 준비

1. 준비 장비
   1. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다.
   2. 화학적 (유리 프릿 30 ㎖) 테프론 반응 용기에서 마이크로파 전력 공급을 제어하기위한 광섬유 온도 프로브가 장착 저가의 부가 모듈과 마이크로 웨이브 펩티드 합성기를 사용하여 고체 지지체 상에 또는 일회용 폴리 프로필렌의 펩티드를 합성 카트리지 (거친 프릿 12 ml의).
   3. 적절한 혼합을 위해, 반응 용기에 질소의 공급을 연결하거나, 대안 적으로, 폴리 프로필렌 카트리지의 양단을 밀봉하고, 로터리 셰이커에 배치했다.
   4. 반응 혼합물 또는 세척을 배출, 폐기물 트랩을 통해 집 진공에 연결합니다.
   5. 반응 용기에 광섬유 프로브를 놓습니다.
2. 시약 준비
   1. 링크 (Rink) 아미드 AM 수지 100-200 메시를 계량하여 수지를 제조 (0.204 mg)을제대로 팽창 2-4 시간 동안 흔들어 아래로 수지를 세척 및 배수에 대한 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지에 N의 1 혼합물, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF) / 디클로로 메탄 (DCM), 1 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
   2. DMF에 대응의 Fmoc- 아미노산을 용해시켜 산성 용액 0.2 M 아미노 -9- 플루 오레 (의 Fmoc)을 제조하고, 아미노산이 (표 1)에 용해 될 때까지 혼합물을 소용돌이.
   3. (벤조 트리아 졸 -1- 일) - - N, N, N ', N'테트라 메틸 유로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU) 100 ㎖의 DMF 및 고체까지 혼합물을 텍싱 용해 (표 18.96 g O 용해시켜 0.45 M 활성제 용액 혼합물을 제조 1).
   4. 65.2 ml의 1- 메틸 -2- 피 롤리 디논 (NMP) (표 1)과 34.8 ml의 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA)을 조합하여 2 M 활성제 염기 용액 혼합물을 준비한다.
   5. 3.37 g 1- 히드 록시 벤조 트리아 졸 수화물을 용해시켜 0.1 M 탈 혼합 용액을 제조 벤조 트리아 졸 (HOBt)20 % v / v의 피 페리 딘의 DMF 용액과 고체까지 혼합물을 텍싱 250 ㎖의 (표 1)에 용해된다.

2. 아미노산 커플 링의 Fmoc 보호

1. 아미노산 커플
   1. 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지에 아미노산 (2.5 ㎖) / 활성화 제 (1 ㎖) / 활성제 염기 (0.5 ml)에 첨가하고, 반응이 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2)에 대해 수행하자. 솔루션을 배출합니다.
   2. DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다.
2. FMOC 탈 보호
   1. 0.1 M의 HOBt에 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지로 DMF의 20 % 피 페리 딘의 7 ML을 추가하고 30 초 (45 W, 75 ° C, 표 2) 동안 품어.
   2. 반응 혼합물을 배출.
   3. 에 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지 0.1 M의 HOBt와 DMF의 20 % 피 페리 딘의 7 ML을 추가하고 180 초 동안 품어 (45 W75 ° C, 표 2).
   4. 반응 혼합물을 배출.
   5. DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 (7 ㎖의 0 W, RT) 용 수지에 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다.
      참고 : 선택적으로, 여기에 절차를 일시 중지하고 나중에 다시 시작합니다.
3. 아미노산의 커플 링 단계 후에, (- 20 ° C에서 장기간 저장 용 수지)를 4 ℃에서 적어도 수 일간 저장 DCM으로 수지를 세척 하였다.
   1. 프로필렌 카트리지 반응 용기에서 수지를 이동.
   2. DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.
   3. 상단 캡과 스톱 콕이 단단히 폴리 프로필렌 카트리지를 밀봉합니다.
   4. 새로운 합성을 시작하기 전에 DMF에서 3-4 시간 (7 mL)을위한 수지를 팽윤.
4. 합성 모니터링
   1. 신속의 진행을 결정하기 위해 카이저 (닌히 드린) 시험 또는 클로 라닐 테스트를 사용합성. 선택적으로, 상기 합성 펩타이드의 순도 및 질량을 결정하기 위해 소규모의 절단 반응을 수행한다. 제 9 절을 참조하십시오.
      주 : 추가 문제 해결은 표 3을 참조하십시오.
5. 표적 펩티드를 합성하기 위해 필요에 따라 반복하여 2.1과 2.2 단계 : Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. 무수 / 산 커플 링

1. 무수 커플 링
   1. NMP와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)를 NMP를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.
   2. , NMP (5 ㎖)에 상응하는 무수물을 용해 10 당량 1 당량의 4- 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP) 및 10 당량의 용액에 DIEA (표 1)을 추가한다.
   3. (25 / DIEA 수지에 무수 / DMAP 10 혼합물 300 초 동안 품어 : 1 : 10 추가W, 75 ° C, 표 2). 솔루션을 배출합니다.
   4. NMP와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)를 NMP를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.
2. 산 커플 링
   1. DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ㎖의 0 승, RT)을 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.
   2. DMF에 대응하는 디카 르 복실 산의 10 당량 (5 ㎖)에 녹인다. 1 당량의 DMAP 및 10 당량의 N, 솔루션 N '이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC) (표 1)를 추가합니다.
   3. 30 분간 혼합하여 혼합물을 중고 활성화.
   4. 수지 혼합물을 추가하고 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2) 부화 및 솔루션을 드레인.
   5. DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT) 및 드레인 솔루션을 DMF를 추가합니다. 단계를 반복하여 세 번.

4. N-methyltrityl (MTT) 그룹 탈 보호를 보호이온

주 : 라이신 측쇄가 N-methyltrityl (MTT) ^(81), 산에 불안정한 조건 하에서 ^82,83 선택적으로 탈 보호 될 수있는 보호기로 보호 하였다. 탈 보호는 MTT 마이크로파 에너지없이 진탕 수동 보호기.

1. 캡 플러그와 스톱 콕이 구비 된 폴리 프로필렌 수지 카트리지에 옮긴다.
2. DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.
3. 수지 1 그램 당 폴리 프로필렌 카트리지 1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 5 % 트리 이소 프로필 실란 (TIS) 및 94 % DCM의 혼합물의 15-25를 가하여.
   주 : TFA는 강산이고 부식성 및 피부, 눈, 및 폐 조직에 매우 자극적이다.
   1. 항상 후드에서 TFA의 집중 솔루션을 유지합니다.
   2. 환기가 잘되는 후드에서 적절한 개인 보호 장비 (보안경, 실험실 코트와 장갑) 작업을 사용합니다. 즉시 변경 장갑그들은 TFA 즉시 청소 어떤 유출과 접촉합니다. 피부 나 눈이 산에 접촉하는 경우, 즉시 물로 환부를 세척하고 추가로 15 분 동안 세척한다.
4. 쉐이커에 폴리 프로필렌 카트리지를 넣고 실온에서 5 분간 흔들어.
5. 진공을 적용하여 프로필렌 카트리지로부터 용액을 배출.
6. 반복 4.3-4.5, 세 번 단계를 반복합니다.
7. DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다.

선형 펩타이드 5. 고리 화

1. DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다.
2. 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브, 5 당량 트리아 졸 -1- LY 옥시 트리스 pyrrolidinophosphonium의 hexafluorphosphate 다이브 로모의 (에 PyBOP) (DBM, 5 ㎖) 용액에 10 당량 DIEA 추가 (표 1)을 녹인다.
수지 혼합물을 추가하고 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2) 동안 품어. 솔루션을 배출합니다.
3. DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다.

측쇄 기의 제를 이용하여 절단 및 탈 보호 한

1. DCM 및 디 에틸 에테르로 수지를 씻으십시오.
   1. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 두 번 반복합니다.
   2. 120 초에 수지 (7 ㎖, 0 W, RT)를 디 에틸 에테르를 첨가하고 용액을 배수. 두 번 반복합니다.
2. 수산화 칼륨 (KOH 1-10 G)에서 적어도 3 시간 동안 실온에서 진공 데시 케이 터에서 건조 수지.
3. 건조 된 수지를 달아 프로필렌 카트리지로 전송.
4. 미리 냉각 된 트라이 플루오로 아세트산 (TFA) 절단 칵테일 10 ㎖를 추가 (예를 들면, 90 % TFA, 2.5 % 물, 2.5 % TIS, 5 % 페놀) 수지 각자 그램.
5. 3 시간 동안 흔들어실온에서.
6. 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 수지를 여과에 의해 TFA 절단 용액을 수집한다. 여과를 들어, 12 ml의 폴리 프로필렌 카트리지에 프릿을 사용한다.
7. 튜브 냉 디 에틸 에테르 (35 ml)에 추가한다.
8. 4 ° C에서 1,207 XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
9. 에테르 층을 가만히 따르다.
10. 단계를 반복 6.7-6.9 5 회.

7. 백본 순환 펩타이드 건조

1. 동일한 튜브 내에 석출 펩티드를 유지하고, 30 분간 후드에서 건조시킨다.
2. 물과 아세토 니트릴 (ACN)의 1 : 1 혼합물 1 펩​​티드를 녹인다.
3. 액체 질소에서 최종 생성물 용액을 동결.
4. 최종 생성물을 동결 건조.

8. 백본 순환 펩타이드 특성화

1. 물 (400 μL)의 생성물의 소량의 샘플 (1 mg)을 녹인다.
2. 역상 고속 액체 chromatograp에 용해 펩티드 (10-200 μL)을 주입HY (RP-HPLC) 시스템은 펩타이드 순도 ^(34)을 테스트합니다.
3. 질량 분석 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI-MS) ^(84)를 사용하여 펩티드의 질량을 확인한다.
   1. 아세토 니트릴 1 (v / v)의 혼합물 : 1에서 1 μL (100 μM) 펩티드 믹스 물 매트릭스의 1 μL (5 ㎎ / ㎖, α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산)으로 1 : 1 (V 아세토 니트릴 / v)의 혼합물 : TFA (0.1 %)와 물.
   2. 스팟 MS-MALDI 접시에 1 μL.
   3. 샘플을 건조하고 질량 분석기에 넣습니다.
4. 펩타이드를 달아 %의 수율을 계산한다.
5. -20 ℃에서 보관하십시오.

9. 합성 모니터링

1. 카이저 (닌히 드린) 시험 ⁸⁵
   1. 시약 솔루션을 준비합니다.
      1. 증류수 25 ㎖에 시안화 칼륨 (KCN) 16.5 mg을 용해시켜 용액 A를 준비한다. 피리딘 49 ㎖의 상기 용액 1 ㎖를 희석.
      2. 용액 B를 준비에탄올 20ml에 닌히 드린의 1g를 용해.
      3. 20 ml의 에탄올 40g 페놀을 용해하여 용액 C를 준비합니다.
   2. 아미노산 결합의 완료 또는 보호기의 탈 보호를 확인할 카이저 테스트를 사용.
      1. 테스트 튜브에 수지에서 몇 구슬을 전송합니다.
      2. 세 방울 각 솔루션의 (~ 100 μL) (A, B 및 C)를 추가하고 혼합한다.
      3. 5 분 동안 110 ℃에서 가열 블럭에 테스트 튜브를 가열한다.
         참고 : 블루 컬러 구슬 (긍정적 인 결과) 불완전한 커플 링 반응 또는의 Fmoc 보호기의 탈 보호를 나타냅니다.
2. 클로 라닐 테스트 ⁽⁸⁶⁾
   1. 각 시험에 대한 신선한 다음과 같은 시약을 준비합니다.
      1. DMF 중의 2 % 클로 라닐의 용액을 제조 하였다, 용액 A.
      2. DMF 중의 2 % 아세트 알데하이드의 용액을 제조 하였다, 용액 B.
   2. 아미노산 결합 또는 t의 완료를 확인하는 클로 라닐 테스트를 수행그 보호기를 탈 보호.
      1. 1.5 ㎖의 튜브에 용액 B 100 ㎕를 가진 용액 100 ㎕를 혼합한다.
      2. 에 구슬을 삭제하고 부드럽게 5 분 동안 흔들어.
         주 : 다크 브라운 컬러 비드 (포지티브 결과)의 Fmoc 보호기 또는 불완전 커플 링 반응의 탈 보호를 나타낸다.
3. 작은 규모의 분열 반응
   1. 캡 플러그와 스톱 콕이 구비 된 3 ㎖ 폴리 프로필렌 카트리지에 소량의 수지를 제거한다.
   2. 95 % TFA 2 mL의 혼합물을, 2.5 %의 물과 2.5 % TIS로 처리.
   3. RT에서 30 분 동안 혼합물을 흔들어.
   4. 폴리 프로필렌 프릿 카트리지를 사용하여 여과하여 수지를 제거하고 질소 기류에 의해 용매를 증발시켰다.
   5. 잔류 물을 용해시키고, HPLC 및 / 또는 MS를 사용하여 생성물을 분석한다.

문화 분석 10. 슈만 편모충 donovani Promastigote 생존

<리> 슈만 편모충 donovani (L. donovani) 성장과 치료 조건
1. 문화 L. 26 ° C에서 4.5 G / L 포도당, L- 글루타민, 나트륨 피루 베이트와 이글의 중간 (DMEM)의 둘 베코의 수정에 donovani의 promastigotes.
2. L. 치료 donovani는 26 ° C에서 24 시간 동안 주기적 펩티드 (100 μM)로 promastigotes.
1. 슈만 편모충의 donovani (L. donovani) 생존 분석
   1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 알라 마르 블루 20 μL와 기생충 생존 능력을 평가합니다.
   2. (570 nm의 여기 및 590 nm의 방출에) 형광을 측정하여 알라 마르 블루 감소를 결정합니다. 높은 형광 값보다 큰 대사 활성 및 증가 된 기생 가능성을 나타낸다.

Results

여기에서 우리는 특히 슈만 편모충 기생충의 생명 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 (기생충 제 ⁸⁷ 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 펩타이드에 대한 검토를 위해) 항 기생충 제 역할을 백본 순환 펩티드의 초점을 맞춘 작은 도서관의 발전을 설명합니다. 새로운 백본 순환 펩타이드의 합성을 통해 약물 조제는 확장 크기의 골격에 보존되어있다. 여기에 제안 된 초점을 맞춘 도서관의 강도는 고리 화 반응을 통해 구조적인 자유의 제한 정도를 허​​용하면서 펩타이드 골격 크기를 변경하는 기능입니다. 환상 골격 펩티드의 전체 합성의 Fmoc / tBu 중에서 프로토콜 다음, 고체 지지체 상에 자동화 된 마이크로파 합성기를 사용하여 수행 하였다. 환화는 링커, 무수물 / 아세트산, 및 리신의 측쇄 아민과 아미드 결합을 생성함으로써 수행 하였다. 최종 절단 및 측쇄 탈 보호는 합성 방식과 F 위해 (수동 마이크로파 에너지없이 수행했다원고 판 제품 구조) 그림 3 참조. 생성물을 -20 ...

Discussion

완전 자동화 된 마이크로파 합성기를 사용하여 리 슈만 편모충 기생충의 부족 단백질로부터 유도 된 펩티드의 고리 골격 집중 라이브러리의 합성을 설명한다. 순환 펩티드의 초점을 맞춘 도서관은 보존 약물 조제와 다양한 링커로 개발되었다. 예컨대 글루 타르 산 무수물, 숙신산 무수물, 아 디프 산, 피 멜산, 리신, 오르니 틴, 및 다른 빌딩 블록과 같은 다양한 링커 첨가 환상 펩티드의 형태 적 공간의 다양성을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 집중 순환 펩타이드 라이브러리의 합성은 연구자들이 최적의 구조적 공간을 선별 할 수 있습니다. 사이 클릭 펩티드의 형태는 고리의 크기 및 위치와 같은 파라미터에 따라 변화하기 때문에, 서로 다른 입체 형태와 다양한 유사체는 생물학적 구조 - 활성 관계에 유용 할 수있는, 생성 된 ^(88)을 연구 할 수있다.

SPPS의 주요 과제는 SYNT를 진단한다중간의 이후 hetic 진행 및 문제 해결은 격리됩니다. 따라...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약
고체 지지, 링크 아미드 AM 수지 ML	CBL	BR-1330	로딩: 0.49mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	고급 Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	고급 Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	고급 Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	고급 Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	고급 Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	고급 Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	고급 Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	고급 Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	고급 Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	고급 Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-메틸-2-피롤리디논(NMP)	시그마	328634	<강한>주의 독성/고인화성/자극성.
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	주의 Toxic. 고품질 DMF를 사용하여 DMF 분해로 인한 디메틸아민 흔적으로 인한 Fmoc 제거와 같은 부반응을 제거합니다.
디클로로메탄 (DCM)	Sigma	D65100	주의 유해
디브로모메탄 (DBM)	Sigma	D41868	주의 유해
트리플루오로아세트산 (TFA)	Sigma	T62200	주의 부식성/독성
트리플루오로아세트산, HPLC 등급 (TFA)	Sigma	91707	주의 부식성/독성
Diethylether	Sigma	31690	주의 고인화성/유해
트리이소프로필실란(TIS)	Sigma	233781	주의 자극성/인
화성 물, HPLC 등급	Sigma	270733
Acetonitroile, HPLC 등급 (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	주의 가연성/자극성/유해성
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA)	Sigma	3440	주의 부식성/고인화성
Piperidine	Sigma	W290807	주의 독성/고인화성
피리딘	Sigma	270970	주의 고인화성/유해
에탄올 (EtOH)	Sigma	459844	주의 고인화성/자극성
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)	Sigma	157260	주의 고인화성/자극성/유해
O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N′,N′ - 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)	시그마	12804	<강한>주의 자극성/유해한
벤조트리아졸-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	주의 자극성
닌히드린	시그마	454044	주의 유해
페놀	시그마	P3653	주의 부식성/독성
시안화칼륨(KCN)	Sigma	11813	주의 매우 독성이 강한
수산화칼륨(KOH)	Sigma	221473	주의 독성
N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)	Sigma	38370	주의 가연성/독성
4-Dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma	522805	주의 독성/자극성
글루타르산 무수물	Sigma	G3806	주의 가연성/자극성/유해한
숙신산 무수물	Sigma	239690	주의 자극성/유해한
아디프산	Sigma	A26357	주의 독성/자극성
Pimelic acid	Sigma	P45001	주의 독성/자극성
Chloranil	Sigma	23290	주의 독성/자극성
아세트알데히드	시그마	402788	주의 가연성/독성
EQUIPMENT
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R 원심분리기
Lyophilizer	Labconco	freezone 4.5
진공 펌프	Franklin Electric	모델 1101101416 with 3/4 HP	Alcatel 프랭클린 모터와 함께하는 펌프
폴리프로필렌 카트리지 12ml	적용 분리	2419
12ml 폴리프로필렌 카트리지용 캡 플러그	적용된 분리	8157
폴리프로필렌 카트리지 3ml	분리	2413
3ml 폴리프로필렌 카트리지용 캡 플러그	적용된 분리	8054
스톱 콕 PTFE	적용 분리	2406
튜브 플랫, 50 ml	VWR	21008-240
추출 매니폴드, 20 pos, 16 x 100 mm 튜브	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE 좁은 입 IP2 병, 125  ml	Fisher scientific	03-312-8
Erlenmeyer 플라스크	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
가열 블록	Thermolyne	1760 dri bath
일회용 붕규산 유리관, 일반 끝이 있는	Fisher Scientific	14-961-25
마이크로피펫 및 팁 Finnpipette	Thermo	20– 200 및 100– 1,000 &뮤; l
HPLC 바이알 - micro vl pp 400 µ 엘 PK100	VWR	69400-124
HPLC 바이알- 블루 스냅잇 캡	VWR	66030-600
분석 HPLC 컬럼	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µ m C18Q, 4.6mm ID 150mm
Prep HPLC 컬럼, XBridge	Waters	OBD C18 5 &마이크로; m 열	19 mm × 150 mm
질량 분석기	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
질소 실린더
데시케이터
분석 RP-HPLC 시스템 Shimadzu LC-20			장착: CBM-20A 시스템 컨트롤러, SPD-20A 검출기, CTO-20A 컬럼 오븐, 2 x LC-20AD 용매 전달 장치, SIL-20AC 자동 샘플러, DGU-20A5 탈기 장치(Shimadzu, MD, USA).
CBM-20A 시스템 컨트롤러, SPD-20A 검출기, CTO-20A 컬럼 오븐, 2 x LC-6AD 용매 전달 장치 및 FRC-10A 분획 수집기(Shimadzu, MD, USA)가 장착된	분취용 RP-HPLC 시스템 Shimadzu LC-20