방법 논문

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

DOI:

10.3791/53604

⸱

2016년 2월 5일

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

이 논문에서

요약

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우리는 GFP 형질전환 배경에서 생체 내 세포 추적을 위한 강력하고 간단하며 비용이 저렴한 도구로 광변환 가능한 PSmOrange 시스템을 구축했습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 모델 시스템에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

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세포와 조직의 형광 표지와 함께 투명한 제브라피시 배아(Danio rerio)의 급속한 발달은 살아있는 동물에서 일어나는 발달 과정을 시각화할 수 있게 해줍니다. 관심 세포는 형질전환 라인의 생성을 위한 형광 단백질(FP)의 발현을 유도하기 위해 조직 특이적 프로모터를 사용하여 라벨링할 수 있습니다. 이러한 목적으로 형광 광변환 단백질을 사용하면 발현 도메인 내에서 정의된 구조를 정확하게 따를 수 있습니다. 관심 영역의 단백질을 조명하면 방출 스펙트럼이 변경되고 특정 세포 또는 세포 클러스터가 강조 표시되어 다른 형질전환 세포를 원래 색상으로 남깁니다. 주요 한계는 제브라피쉬의 많은 조직에 대해 알려진 프로모터가 없다는 것입니다. 반대로, 유전자 및 인핸서 트랩 스크리닝은 문자 그대로 모든 배아 구조를 대부분 GFP로 표시하거나 적색 또는 노란색 FP로 확장되는 거대한 형질전환 자원을 생성했습니다. 이러한 형질전환 배경에서 정의된 구조를 따르는 접근 방식은 관심 세포에서 전환될 수 있는 유비쿼터스 광전환성 단백질을 추가로 도입하는 것입니다. 그러나, 이용 가능한 광전환성 단백질은 녹색 및/또는 덜 빈번하게 적색 방출 상태1를 포함하므로 기존 형질전환 계통의 FP-배경에서 세포를 추적하는 데 종종 사용할 수 없습니다. 이 문제를 피하기 위해 제브라피시2,3에 대한 PSmOrange 시스템을 구축했습니다. 이 단백질의 핵 형태를 암호화하는 합성 mRNA의 간단한 미량 주입은 모든 세포핵을 주황색/빨간색 형광으로 표시합니다. 단백질의 표적 광변환에 따라, 방출 스펙트럼을 근적색으로 전환합니다. 단백질의 양자 효율과 안정성으로 인해 PSmOrange는 제브라피시 및 기타 텔레오스트 종을 위한 탁월한 세포 추적 도구가 되었습니다.

서론

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기하급수적으로 개선되는 이미징 기술은 최대 약 4일 연속의 기간에 걸쳐 다음과 같은 발달 과정을 가능하게 합니다3. 제브라피시 및 기타 많은 동물 모델 시스템에서 특정 세포, 조직, 축삭 또는 혈관 구조는 시각화를 용이하게 하기 위해 형질전환 녹색 또는 때로는 빨간색 또는 노란색 형광 단백질로 표시됩니다. 그러나, 대부분의 형질전환 세포주에서 전이유전자는 관심 세포에서 특이적으로 발현되지 않을 뿐만 아니라 추가적인 구조도 발현되며, 이는 예를 들어 단일 세포 또는 세포 그룹의 정확한 추적을 방해합니다.

형광 광변환 단백질은 배아 발달 중 세포 추적에 매우 적합합니다. 이러한 단백질의 적용을 위한 전제 조건은 수명이 긴 특성, 변환 시 잘 분리된 방출 범위 및 밝은 형광입니다. 사용 가능한 광전환성 단백질은 Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 또는 Dendra27과 같이 변환 시 방출 범위를 변경하는 단백질과 광활성화될 때만 형광성인 기타 단백질(PAmCherry8, PAGFP9 또는 PATagRFP10)로 구성됩니다. 그러나 기존 FP-형질전환 동물의 세포를 추적하기 위한 응용 프로그램은 종종 녹색 형광 상태를 포함하거나 위의 모든 기준을 충족하지 않기 때문에 제한적입니다. 최근에야 Subach와 동료들은 광변환 시 방출이 주황색/빨간색에서 원적색으로 변경되는 PSmOrange 단백질을 보고했으며, 마우스2에 주입된 배양 및 배양 세포의 세포에 성공적으로 적용되었습니다.

살아있는 배아에서 세포 추적에 대한 단백질의 적합성을 조사하기 위해 핵 태그가 지정된 H2B-PSmOrange를 제브라피시 배아에 미세주입하기 위한 발현 구조를 생성했습니다. 우리는 단백질이 제브라피시 배아 발달의 처음 4일(그리고 아마도 그 이상) 동안 GFP 형질전환 배경에서 성공적인 세포 추적을 위한 모든 전제 조건을 충족한다는 것을 발견했습니다. 이 기간 동안 대부분의 세포 이동 이벤트는 어류에서 완료되므로 PSmOrange 시스템은 제브라피시 툴킷에 훌륭한 추가 기능이 됩니다.

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프로토콜

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1. H2B-PSmOrange mRNA의 시험 관내 전사 및 mRNA의 정제

  1. 제조업체의 지시에 따라를 NotI 제한 효소를 사용 PCS2 + 플라스미드를 함유-H2B PSmOrange 선형화.
    참고 : mRNA의 오염 및 열화를 방지하기 위해 같은 장갑, 실험실 코트 등의 적절한 보호를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
  2. 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 페놀 - 클로로포름 계 방법을 사용하여 선형화 된 DNA를 정제.
  3. 제조업체의 지침에 따라 SP6-mRNA의 전사를위한 선형화 템플릿 DNA 1 μg의를 사용합니다.
  4. 37 ° C에서 10 ~ 20 분 동안 1.0 U의 RNase 무료 DNaseI을 추가하여 DNA를 제거합니다.
  5. RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 키트를 정리하여 mRNA의 정리.
  6. mRNA의 순도 및 농도를 증가 6 μL 아세트산 나트륨 (3.0 M, pH를 5.2), 150 ㎕의 96 % 에탄올을 첨가하여 mRNA의 석출. m을 품어최소 30 분에서 24 시간까지 -20 ° C에서 ixed 솔루션입니다.
  7. 4 ° C에서 45 분 18.407 XG에 솔루션을 회전시켜 mRNA를 수집합니다. 액체를 버리고, 150 μL의 70 % 에탄올의 mRNA를 재현 탁. 믹스와 4 ℃에서 추가로 15 분 동안 솔루션을 원심 분리기. 액체를 폐기 얼음에 5 분 동안 펠렛을 건조하고 20 μl를 초순수의 RNase 무료 물에의 mRNA를 재현 탁.
  8. (100) mRNA의 희석 (99 μL의 초순수의 RNase없는 물 1 μl의 mRNA의) : 1 광도 측정에 의해 mRNA의 농도와 순도를 평가합니다.
  9. 단기 저장을 위해, -20 ° C에서의 mRNA 용액을 유지한다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에서의 mRNA를 유지한다.

Zebrafish의 배아에 2 H2B-PSmOrange mRNA의 미세 주입

  1. TG 사용하여 주입하기 전에 쌍에게 밤에 짝짓기 설정 (foxD3 : GFP)를; TG (FLH : GFP)을 두 번 형질 전환 어류 (또는 다른 GFP 형질 전환 어류). 스페이서를 배치하여 분리 물고기를 남겨주세요그들 사이의 상대 시간을 제어한다.
  2. 주입 아침에 스페이서를 제거하고 20 분 동안 물고기 짝을 할 수 있습니다.
  3. 짝짓기 시간 동안, 130 페이지의 최종 농도-H2B PSmOrange mRNA의 희석 / NL 및 microloader 팁을 사용하여, 마이크로 인젝션 모세관에 전사 6 μL 주입 용액 (물에의 RNase 무료). 보정 된 유리 슬라이드와 주입량을 확인합니다. NL이 mRNA의 용액 (260 페이지)를 주입하는 주입 압력을 조정한다.
  4. 1 배 배아 (E3​​) 매체를 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 계란을 수집합니다.
  5. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입 접시에 20 ~ 30 배아를 전송합니다.
  6. 한 세포 단계 (11)에서 노른자로 전지 셀에 또는 아래 사항 솔루션을 포함하는 2 NL의 mRNA를 주입한다.
  7. 1 배 E3 매체를 포함하는 페트리 접시에 전송 주입 된 배아는, 미 수정 여부를 일반적으로 개발 배아를 제거하고 28 ° C에서 그들을 성장.
    참고 : 가벼운 보호 O를배아 f를 실험을하는 동안 필요하지 않습니다.
  8. 1 배 E3 매체에 제브라 피쉬의 배아를 올리고 색소 침착을 억제하는 낭 배기 후 0.2 mM의 PTU (1- 페닐 -2- 티오)를 추가합니다. 세균 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루에 두 번 배지를 변경합니다.

3. 배아 퍼가기

  1. GFP (녹색) 및 PSmOrange 형광 램프와 적절한 방출 필터가 장착 쌍안 현미경을 사용하여 (레드 / 오렌지)의 공동 발현 배아를 선택합니다. 1 배 E3 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 긍정적 인 배아를 전송합니다.
  2. 겸자 (12)를 사용하여 실체 현미경 Dechorionate 배아.
  3. 1.0 ml를 포함하는 1.5 ML 튜브에 전송 한 배아 컷 팁 피펫 (P200)를 사용하여 초순수 제조 1.0 % 낮은 용융 아가로 오스 (LMA)를 미리은 예열. 참고 : 80 ° C에 LMA를 따뜻하게하고 배아를 삽입하기 전에 실온에서 3 ~ 5 분 동안 냉각.
  4. 에 150 ㎕의 LMA에서 배아를 이동커브 글라스를 챔버 및 미세 플라스틱 팁을 사용, 아래로 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 A1R + (또는 다른 적절한 현미경)에 기술 된 실험에서 배아의 방향, 예를 들어 지느러미 측면을 조정합니다. LMA가 중합되면, 마취 0.2 mM의 PTU 0.02 % 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 methansulfonate (Tricaine)를 함유하는 생선 물 챔버를 채운다.
  5. 샘플을 이미징하기 전에 Tricaine의 효과를 확인하기 위해 15 분을 기다립니다. 마취는 브라이트 조명이 장착 된 실체 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있는 배아의 움직임을 방지 할 수 있습니다.
    주 : 챔버 회 재사용 될 수있다.

4. PSmOrange 광

  1. 공 초점 현미경으로 시료를 넣고 488 nm의 각각 GFP 및 PSmOrange 촬상 561 nm의 레이저에 의한 photoconvert하는 영역을 식별하기 위해 표본을 검사한다.
    주 : 반전 STA에 반전 촛점 레이저 주사 현미경을 사용 A1R +GE의 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 TiEcontrolled 및 488 nm의, 561 nm의 광 및 이미징 640 nm의 레이저를 장착. 그러나, 애플리케이션이 확실히만큼 변환 이미징 레이저 라인이 가능한 현미경으로 한정되지 않는다.
    1. 제자리에 20X 공기 목적을 넣어 (NA : 0.75, WD를 : 1.0 mm, FOV : 0.64 X 0.64 mm)를.
    2. 광 전에 PSmOrange 단백질을 검출하기 위해 다음과 같은 현미경 설정을 사용하여 561 nm의 레이저, 목적 위의 초점면에서 측정 된 0.74 mW의합니다.
      주 :이 시스템이 40 %에 해당한다 (초점 평면에서 측정하는 유효 전력을 결정하기위한 유일한 방법이다). 변할 수-H2B PSmOrange 주사의 효율성 실험 필요에 따라 레이저 전력을 조정한다.
    3. 관심 영역을 강조하기 위해 줌 요소를 추가합니다. 높은 배율 이미지 획득 시간 때문에 광독성을 감소시킨다.
  2. 구조를 포함하는 Z 스택 획득488 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 561 nm의 레이저를 사용하여 관심의. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
  3. 샘플을 스캔하고 photoconvert 할 영역을 강조하기 위해 관심 (ROI) 도구의 지역을 선택합니다. 자극 곳은 투자 수익 (ROI)을 수정합니다. 사진 활성화 / 표백 모듈을 선택, 각 박스를 선택하여 488 nm의 레이저를 활성화하고 80 % (목적에서 측정 한 mW의 레이저 파워)로 488 nm의 레이저를 설정합니다. 0.5 초 / 프레임의 스캔 속도를 설정합니다.
  4. 광 변환 유틸리티 (ND 자극)을 열고 광 설정을 지정합니다.
    1. 광 프로토콜을 지정하려면 "추가"명령을 클릭합니다.
    2. "취득 / 자극"메뉴의 "취득"에서 "단계"한 설정과 이미지의 개수는 "루프"메뉴의 광 전에 취득 할 나타냅니다.
    3. 세인트 "로 설정"단계 "2imulation "자극 이벤트의 수를 입력을 수행한다.
    4. 조정 "단계"3 "상"1 선택적으로 기술 한 바와 같이, 이미지 수집의 마지막 라운드 전에 대기하는 시간을 입력하여 "상"이 후 대기 "단계"를 삽입합니다.
    5. 모든 매개 변수가 설정되면, 자극 설정을 적용하고 광을 실행합니다.
      레이저 전원 다를 수 있습니다 광 각 라운드에 대한 검사 및 반복 수의 주파수 및 배아로 배아 다릅니다 있습니다. 설정은 표 1에 나타내었다 시작합니다.
  5. 488 내지 561 nm이고, 상기와 같이 설정을 적용 640 nm의 레이저를 이용하여 마지막 Z 스택 획득. (mW의 4.5까지) 고 레이저 전력을 사용하여 변환 PSmOrange 시각화 640 nm의 레이저를 설정한다.

LMA 5. 마운트 해제 배아

  1. 현미경에서 챔버를 포함하는 배아를 제거합니다. 조심스럽게 아가로 오스 유에서 배아를 제거집게를 노래.
  2. 새로운 멸균 플라스틱 페트리 접시로 또는 1 배 E3 0.2 mM의 PTU를 포함하는 멸균 6 웰 플레이트에 배아를 전송합니다. 개발의 원하는 단계까지 28 ° C에서 배아를 품어.

6. Photoconverted PSmOrange 단백질 발현하는 세포의 운명을 분석

  1. 점 3.3 3.4에 기재된 바와 같이 배아를 다시 삽입.
  2. 공 초점 현미경으로 시료를 놓고 관심 (488 ㎚)의 GFP 유전자 변형 구조 photoconverted 세포 (640 나노 미터)을 식별하기 위해 표본을 검사합니다.
  3. 488 nm의, 561 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 640 nm의 레이저를 사용하여 관심의 구조를 다루는 Z 스택 획득. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
  4. 어느 공동 특급 GFP와 photoconverted 단백질을 세포를 식별하기 위해 다음 방법 중 하나를 사용하십시오.
    1. 사용자 정의 만든 자동 피지 이미지J 매크로 3
      1. 에서 Convolve "GaussianBlur"플러그인을 사용하여 원래 스택 (→ 과정 → GaussianBlur → 필터) 및 "이미지 계산기"플러그인 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)를 사용하여 원래의 부드러운 스택을 뺍니다. 관심있는 구조를 시각화하고 분석 연산 시간을 줄이기 위해이 공정을 사용한다.
      2. photoconverted 세포를 강조하기 위해 녹색과 원적외선 채널에 특정 임계 값을 적용 (→ 이미지 → → 임계 값을 조정합니다). 적절한 설정으로 임계 영역을 검출하기 위해 "입자를 분석"도구를 사용하여 (→ 입자를 분석 → 분석).
      3. "이미지 계산기"플러그인을 열고 노란색 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)에 녹색과 원적외선 채널의 중복의 ROI를 표시됩니다.
    2. 3D 데이터 평가 현미경 이미징 소프트웨어
      1. 의 스택을 표시(3D 시각화 메뉴 →보기 볼륨보기 →) 쇼 볼륨보기 옵션을 사용하여 3D. , 녹색, 빨간색과 원적외선 채널을 선택 밝기와 대비를 조정하고 photoconverted 영역 (그림 1)을 강조 3D 스택을자를 그래픽 인터페이스를 사용합니다.
        참고 : 데이터가 이미지 분석을위한 일반적인 대부분의 소프트웨어에서 사용할 수있는 분석 비슷한 방법.

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결과

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도 1은 PSmOrange 광 변환 시스템의 일례를 도시한다. 뇌의 복잡한은 척추 동물의 등쪽 간뇌의 보존 구조입니다. 많은 다른 척추 동물에서와 마찬가지로,이 단지는 간뇌 왼쪽 양면 parapineal 세포의 중앙에 뇌의 기관으로 구성되어 있습니다. 우아한하지만 시간이 많이 소요되는 uncaging 실험은 parapineal 세포가 뇌의 기관 (13)의 앞쪽 부분에 발생한 것으로 나타났다. TG에서 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아는, 뇌의 및 parapineal 모두 세포를 개발하는 동안 표시되어 있습니다. PSmOrange 시스템의 적합성을 평가하기 위해, 우리는보고 된 솔방울 복잡한 현상 재현이 배아를 사용 하였다. PSmOrange, H2B-PSmOrange의 핵 형태를 인코딩 260 페이지의 mRNA의 모든 세포의 핵에서 단백질을 발현 한 세포 단계 이중 유전자 변형 배아...

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토론

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형광 기자를 운반하는 형질 전환 배아는 배아 발달을 이해하는 것이 근본적으로 도왔다. 그러나, 특정 구조의 특정 시각화를 용이하게하기위한 촉진제 중요한 필요성은 여전히​​ 존재한다. 자신의 부재에서 연구자들은 관심의 그 구조의 기원과 발전에 대해 알고 형광 단백질의 광과 같은 기술에 의존하고 있습니다. 이것은 차례로 개발에 관련된 분자 메커니즘을 식별하는 중요한 조건이다. 제브라 피쉬 분야의 기술 진보는 지금 접근 14,15에 CRISPR-Cas9 매개 노크를 사용하여 예를 들어와 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질의 FP를 교체 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 비교적 시간 소모적 항상 성공적이지. 대조적으로, 보편적으로의 응용 프로그램이 GFP에 H2B-PSmOrange 및 가능한 다른 유전자 변형 배경 표현은 그들을 통해 세포를 수행하는 직선 앞으로 기술이다bryonic 개발.

예를 들어, 제브라 피쉬 복부 habenulae의 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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오리지널 H2B-PSmOrange 플라스미드를 제공해 주신 O. Subach와 물고기 관리를 위한 어류 시설 팀에 감사드립니다. 하이델베르크 대학의 Nikon Imaging Center에서 현미경 장비 및 분석 소프트웨어를 이용할 수 있게 해 준 것에 감사드립니다. CBTM(DFG INST 91027/10-1 FUGG)에서 Core Facility Live Cell Imaging Mannheim의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), 하이델베르크 대학과 C.A.B. 및 하이델베르크 대학 만하임 의과대학과 MDG(FOR 1036/2, 298/3-1 및 298/6-1)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PCR 정제 키트Qiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트AmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
플라스틱 파스퇴르알파 실험실LW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920논문에 기재된 플라스미드는 다음과 같습니다. Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II 챔버 #1.5 독일 커버글라스 시스템에서 사용 가능 Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH 독일번호
Nikon PLAN Apo λ 20X 공기 목표 Nikon GmbH 독일번호
NIS 요소 AR 소프트웨어 (v. 4.30.02)Nikon GmbH 독일/실험실 이미징번호
없음없음 없음

참고문헌

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