은 C-FOS 단백질 면역 조직 검색 : 특정 생리적 반응에 관여 중앙 진학의 마커로서 유용한 도구<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 전의 VIVO</em

요약

여기에서는 생체 내 및 생체 외 특정 생리학적 반응에 관여하는 신경 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 고전적인 기술인 c-FOS 단백질 면역조직학적 검출을 기반으로 하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

많은 연구는 특정 생리 규정과 관련된 뇌 영역을 식별 매핑 구한다. 프로토-종양 유전자 C-FOS, 즉시 초기 유전자는 다양한 자극에 반응하여 신경 세포로 표현된다. 단백질 생성물을 용이하게 그 활성의 변화를 표시 뉴런의 그룹을 매핑하는 C-FOS 검출의 사용에 이르는 면역 기술로 검출 할 수있다. 이 글에서, 우리는 저산소증 또는 탄산 혈증에 환기 적응에 관여하는 뇌간 신경 인구의 식별에 초점을 맞추었다. 두 가지 방법은 동물의 생체 내에서 관련 신경 세포 인구를 식별하기 위해 설명하고, 생체 deafferented 뇌간 준비한다. 생체 내, 동물. hypercapnic 또는 저산소 가스 혼합물에 노출 된 예 생체 내, deafferented 준비가 저산소 또는 hypercapnic 인공 뇌척수액으로 superfused했다. 두 경우 모두, 하나 제어 생체 내 동물 또는 전자에X 생체 준비가 정상 산소와 normocapnic 조건에서 유지 하였다. 이 두 가지 방법의 비교는 신경 세포의 활성화, 즉의 기원의 결정을 할 수 있습니다 주변 및 / 또는 중앙. 생체 내 및 생체 외, brainstems가 수집, 고정 및 섹션으로 분리되었다. 섹션 제조 하였다되면, C-FOS 단백질의 면역 검출을 저산소 또는 hypercapnic 자극에 의​​해 활성화 된 세포의 뇌간 그룹을 식별하기 위해 만들어졌다. 레이블이 세포는 뇌간 호흡 구조에서 계산되었다. 상기 제어 조건, 저산소증 또는 고탄 산혈증에 비해 따라서 중앙 호흡 드라이브의 적응에 관여하는 신경 전달 경로의 여러 가지 구조적 뇌간 특정 부위에서 C-FOS 표지화 된 세포의 수가 증가 하였다.

서론

C- FOS 유전자 1980 ^1,2 초에 처음 동정 및 유전자 생성물 활성제 ^특성을 갖는 ^3,4- 핵 단백질로서 1984 년에 나타내었다. 그것은 신경 자극과 관련된 장기 메커니즘에 참여하고 있습니다. 사실, 신경 활동의 변화는 전사 인자 C-FOS의 생산을 유도 즉시 초기 유전자 C-FOS의 발현을 유도 두 번째 메신저 신호 폭포로 이어집니다. 후자는 늦은 유전자의 발현을 개시함으로써 자극 ^(4)의 여러 유형의 신경 시스템의 적응 반응에 참여한다. 따라서, 1980 ^5,6- 말부터, C-FOS 단백질 검출 자주 신경 경로를 매핑하기위한 일반 ⁴ 및 중추 신경계 (CNS)의 활성을 유전자 전사에 외생 적 요인의 영향을 연구하기 위해 사용되어왔다 다른 생리에 관여알 조건.

기초 C-FOS 표현은 쥐, 쥐, 고양이, 원숭이, 인간 ⁴ 등 다양한 종에서 연구되어왔다. 이로써, 그 표현의 역학은 비교적 잘 알려져있다. 전사 활성화 (5~20 분) ^7,8 급이며 mRNA의 축적은 자극 ^(9)의 발병 후 30 및....

프로토콜

참고 : C-FOS 검출 여러 단계 (그림 1)을 포함하는 표준화 된 절차입니다. 모든 실험은 쥐 또는 쥐에서 수행되었다. 실험 프로토콜은 동물 보호에 대한 2010년 9월 22일 (63분의 2,010 / EU)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행, 동물 실험 찰스 다윈 (Charles Darwin) (/ 05 / 2011 CE5)의 윤리위원회의 승인에 따라 실시 하였다 동물 보호를위한 프랑스 법.

솔루션 1. 준비

1. 0.2 M 인산 나트륨 완충액을 준비 : 교반하면서 6.24 g의의 NaH ₂ PO ₄ * 2H ₂ O 및 22.56 g 나 ₂ HPO ₄ *의 H ₂ O 1 L의 증류수를 추가합니다.
2. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비 : 증류수 150 ml의 PFA의 20g을 추가합니다. 교반하면서 80 ℃로 용액을 가열한다. 솔루션을 지우려면 열을 감소시키고 파라 포름 알데히드가 분해하기 위해 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 추가합니다. 250 mL의 완전한증류수 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.4) 250 mL로 추가한다. 4 ℃에서 보....

결과

은 C-FOS 검출은 생체 내 (그림 2A)에서 저산소증과 탄산 혈증이나 이러한 조건 생체 외 (그림 2B)를 모방 상황에서 특정 조건에서 활성화 된 세포의 식별 그룹을 할 수있는 유용한 도구입니다. 생체 내, 신생아, 젊은 또는 성인 설치류는 기상 환경이 지속적 정확하게 30 내지 180 분 ^13,25,26 (도 2A)에 대해 정의 된 조성의 기체 혼합물에 의해 갱신되는 밀폐 상자에 넣었다. 몸 전체에 자극 작용으로, C-FOS의 관련 변화는 중추 및 말초 활성화 경로를 모두 반영 할 수있다. 예 생체 내에서,있는 연수와 척수를 포함 deafferented 준비가 지속적으로 다른 수준을 가진 ACSF로 superfused 챔버에 넣고, 저산소 또는 hypercapnic 조건을 모.......

토론

C-FOS 즉각적인 초기 유전자와 그 산물의 검출은 상기 C-FOS 단백질, 고전 생체 ^11,13,25,28 특정 호흡기 반응에 관여하는 신경 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 생체 ^{16-18 27,32,33.}

프로토콜 내에서 중요한 단계

재관류 단계에서주의해야합니다. 4 % PFA 솔루션은 잘 준비되어야하며 고정 및 사후 고정 단계는 최적의 슬라이싱과 염색을 얻을만큼 충분히 길어야한다. 또한, 계시 과정에서 가장 중요한 단계이다; 염색의 강도는 배경 잡음을 방지하도록 제어되어야한다.

기존 방법에 대하여 기술 및 의미의 장점

일.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 플레이트 12-웰	코스타	35/3
15mm 넷웰 인서트와 메쉬 폴리에스테르 멤브레인	Corning	3477	15mm 직경의 웰 인서트는 74&마이크로; 폴리스티렌 삽입물에 부착된 폴리에스터 메시 바닥
기본 항체 (토끼 다클론 항체, c-Fos 단백질에 대항	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH 2 < / sub> PO < > 4 < / sub> * 2H 2< / sub>O	시그마	71505
Na 2 < / sub>HPO4< / sub>	Sigma	S7907
파라 포름 알데히드	시그마	P6148
NaOH 0.1N	시그마	43617
폴리 비닐 - 피 롤리 돈	시그마	PVP-360
설탕	시그마	S7903
NaCl	시그마	S7653
에틸렌 글리콜	시그마	33068
트리톤 X100	시그마	T8787
트리즈마 HCl	시그마	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드	Rockland	DAB50
니켈 암모늄 황산염	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
슬라이드	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
커버 유리	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153

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