방법 논문

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

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DOI:

10.3791/53624

⸱

2016년 3월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

이 논문에서

요약

조류 배아 발달 후기 단계에서 난황낭 막의 지질 활용 메커니즘을 연구하기 위해 1차 일본 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축했습니다.

초록

우리는 개발 과정에서 조류 배아에 의해 영양소 이용률을 매개하는 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는 내배엽 상피 세포 배양 모델 (EEC)를 설립했다. 수정 된 일본어 메추라기 계란 5 일 동안 37 ° C에서 배양 한 다음 골목 막 (YSM)는 EEC 문화 시스템을 구축하기 위해 수집 노른자 하였다. 우리 YSM에서 배아 내배엽 층을 단리하고, (2) 내에 막 분리 - MM 3 개의 부분적으로 24 웰 배양 플레이트에 파종 전에게나로 분해. EECS는 조직에서 증식 및 세포 배양 연구를위한 준비가되어 있습니다. 우리는 EECS 예를 들어 생체 내에서 YSM의 일반적인 특성, 지질 방울의 축적, 스테롤 O-아실 트란스 퍼과 지단백 리파제의 발현을 한 것으로 나타났습니다. 부분 소화 치료는 크게 EEC 문화의 성공적인 속도를 증가했다. EECS을 활용, 우리는 SOAT1의 발현이 캠프 D에 의해 규제 것을 증명ependent 단백질은 관련 경로를 키나아제. 이 차 일본어 메추라기 EEC 문화 시스템은 배아 지질 수송을 연구하고 조류 배아 개발하는 동안 YSM 영양소 이용률을 매개에 관여하는 유전자의 역할을 명확히하기 위해 유용한 도구입니다.

서론

조류 배아의 주요 영양 자원이 33 % 지질, 17 %의 단백질로 구성 노른자, 1 % 재. 1 배아 개발 중입니다, 난황 막 (YSM)는 배아 복강 내에서 성장하고 점차적으로 노른자를 커버 표면. 배아 2 일에 시작하여, 지질 대사 및 혈관 신생과 관련된 유전자의 발현이 점차 YSM 증가되고 YSM 천천히 융모와 같은 돌기를 발생한다. -8,9- 이러한 돌기는 배아 발달을 지원하기 노른자 영양소의 흡수를 증가시킨다. YSM 세 가지 배엽, 내배엽, 중배엽과 외배엽을 포함하는 배외 (extraembryonic) 조직이다. (14) 난황 외배엽 부드럽게 난황을 포함하는 난황 막과 알부민 및 링크에 직면 해있다. 내배엽 상피 세포는 shap로 나눌 수있다 달걀 노른자를 향해 직접 직면하고 영양 활용 포털의 역할을한다. 6 YSM이 확장하면서, 내배엽 상피 세포 (EECS)를하고 있습니다두 그룹, 지역 난황 및 지역 vasculosa에 전자 및 기능을 제공합니다. (7)

영역 난황는 내배엽 세포로 구성되며 배아로부터 떨어진되고 영역 vasculosa는 중배엽 세포로 구성되고, 혈관 결합 조직으로 분화 EECS을 덮는다. 배아 5 일까지, 노른자는 완전히 YSM의 외배엽과 내배엽이 적용되고, 혈관 영역은 빠른 속도로 성장하고있다. YSM은 배아 순환 시스템으로 (노른자 유래 매우 저밀도 지질 단백질 등)과 단백질. 9, 2 따라서, 우리는 지질의 메커니즘을 연구하기 위해, 기본 일본어 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축 recomposes 해제 지질 흡수 조류 배아 개발하는 동안 YSM에 활용.

예컨대 중성 지방, 레시틴, 인지질 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)와 같은 지질 조류 배아의 주 에너지 원이다. 개발의 초기 단계에서, 난황 지질 C는1.3 %의 CE의 omposed하고 조류 배아 발달 (3)의 중간 10-15 %로 상승, 11. 콜레스테롤 에스테르 조류 배아 YSM에 스테롤 O-아실 트랜스퍼 라제 1 (SOAT1)에 의해 콜레스테롤로부터 합성된다. (4)

콜레스테롤의 저장 형태는 CE, CE는 지질 단백질에 실시하고, 지질 단백질은 조직에 혈액 순환에 의해 수송된다. 13 주 해치 전에 조류 배아의 급속한 성장이있다. 약 노른자의 나머지 지질 함량의 68 %는이 단계에서 흡수된다. 10 지질 EEC 연구 모델로 정화 할 수있다 이용된다 노른자하는 메커니즘. 닭 EEC 배양 프로토콜은 본 연구의 목표를 ​​달성하기 위해 설립되었다. 2, 9, 그러나, 향상된 EEC 세포 배양 방법에 의해 영양분 활용도를 매개 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는데 필요한 조직 이식편의 낮은 성공률로 개발하는 동안 조류 배아.

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프로토콜

참고 :..이 절차는 등 바우어 등 2013 나카자와 등, 2011 년 2,9에 의해 개발 된 치킨 모델 문화 프로토콜의 수정입니다

1. 건강한 배아 5 일 태아 일본어 메추라기에서 준비

  1. 같은 케이지에서 함께 한 남자와 세 여성의 성적으로 성숙한 일본어 메추라기를 놓습니다. 전원 공급 및 임의 량의 물. 빛의 14 시간과 어둠의 10 시간에 동물 방에 빛을 조정합니다.
  2. 오후에 매일 비닐 봉지에 수정 된 알을 수집하고 태아의 성장 속도를 지연하기 위해 16 ° C 냉장고에 보관하십시오.
  3. 2 주 기간 내에 계란의 충분한 수를 수집 한 후, 5 일 동안 통풍이 잘되는 37 ° C 배양기에서 수정 된 알을 품어.

2. 기초 배지 및 세척 솔루션을 준비

  1. 성장 배지로 (pH를 7.2로 조정) DMEM / F-12 배지를 사용하고, 그것을 보충10 % 새로 태어난 송아지 혈청 (NBCS), 1 % 펜 연쇄상 구균 Ampho와. 솔루션 (PSA; 페니실린, 105 단위 / L, 스트렙토 마이신, 100 ㎎ / ℓ, 암포 테리 신 B, 0.25 ㎎ / ℓ).
  2. 저장을위한 10 배 농도의 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 제조; 씻어 (pH를 7.2로 조정;의 KCl, 2.667 밀리미터, KH 2 PO 4, 1.471 밀리미터; 나 2 HPO 4 -7H- 피 2 O, 8.06 mM의 NaCl을, 137.93 밀리미터 포함)과 난황 막 동안 축축하게 1X PBS 솔루션을 사용 계란 노른자와 알부민에서 내배엽을 분리.
  3. 내배엽 펠렛을 다시 중단 (pH를 7.2로 조정) DMEM 배지를 사용합니다.

일본어 메추라기 YSMs에서 차 EECS 3. 컬렉션

  1. 오일 (단계 1.3)에 대한 수집 한 알을 품어. 정상 배아 발달을 확인 달걀 ​​캔 들러에 의해 계란을 검사합니다.
    참고 : 배아 일 5 일 YSM의 중배엽의 경계는 매우 명확하고 3 배아 층은 덜 함께 밀접하게 연결되어있다, 그래서 OB하기 쉬운주석 박의 내배엽. 만 YSM 컬렉션 정상적인 모세 혈관 순환 개발을 보여주는 계란을 사용합니다.
  2. 주의 깊게 신선한 물과 75 % 에탄올을 사용하여 껍질을 청소합니다. 부드럽게, 가위로 공기 셀 위치에서 달걀 껍질을 열고 밖으로 껍질, 37 ° C 1X PBS로 가득 10cm 배양 접시에 집게와 장소에 의해 전체 YSM를 수집합니다.
  3. 가위는 배아, 난황과 난백을 분리하고 부드럽게 1X PBS로 세척 YSM 세 번 및 10cm 배양 접시에 PBS 용액 YSM 배치하여.
  4. YSM에서 외배엽을 제거하기 위해 집게와 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 2 번 단단히 내배엽 세포 층을 보유하고, 다른 하나는 모세관 중배엽을 잡아.
  5. 해부 현미경에서 떨어져 당겨 배아를 향한 방향으로 중배엽의 가장자리에서 내배엽를 구분합니다. 37 ° C 와트 성장 배지 15 ㎖ 중의 적기 장소를 이용하여, 50 ml 원심 분리 튜브 내에서 담황색 내배엽 모아서어 목욕 모든 조직 모음이 완료 될 때까지.

콜라게나 소화에 의해 내배엽 조각 4. 소화

  1. 갓 DMEM 10 ml의 유형 IV 콜라​​게나 6.5 단위를 녹인다.
  2. RT에서 3 분 동안 130 XG에 50 ㎖ 튜브 (3.4)을 원심 분리기. 매체를 기음과 피펫을 사용하여 6cm 배양 접시에 모든 내배엽을 배치합니다. 이 배양 접시에 1 ml의 콜라게나 솔루션을 추가합니다.
  3. 각 조각의 크기까지 곡선 가위 2 메추라기 배아에서 수집 내배엽 슬라이스 대략 2-3mm이다. , 적기를 사용하여 신선한 콜라게나 솔루션의 9​​ ml의와 함께 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 모든 조각을 수집합니다.
  4. 175 rpm에서 37 ° C 진탕 수조에서 30 분 동안 콜라게나 조직 다이제스트. 콜라겐이 부분 소화 이식편의 세포 증식을 향상시키는 데 사용된다.
  5. RT에서 3 분 동안 130 XG에 원심 분리기 부드럽게 피펫을 사용하여 상층 액의 일부를 제거. 20 ㎖ DMEM에 현탁하여 펠렛을 씻고 3 분 130 XG에 원심 분리 후 상층 부분을 제거합니다.
  6. 다시 중단 성장 매체 (10 % NBCS 1 %의 PSA와 DMEM / F12)의 12 ml의와 펠렛을, 24 웰 플레이트에 부드럽게와 동일 (각 웰에 500 ㎕의 세포 솔루션을) 시드.
  7. 세포 조직에서 증식 할 수 있도록 2 일 동안 공기 중에서 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 조직 이식편 부화.
  8. 추가 2 일 동안 세포를 인큐베이션하고 세포 생존 분석 프로토콜에 의해 세포 생존율에 대한 특성화. 15
    주 : 살아있는 세포는 세포질 내에서 환원 환경을 유지한다. 레사 주린, 활성 성분은 푸른 색과 거의 비 형광 비 독성 세포 투과성 화합물이다. 세포 배양에 첨가 될 때, 레사 주린은 미토콘드리아 효소에 의해 세포질로 레조 루핀 (resorufin)로 감소된다. 레조 루핀 (resorufin)는 붉은 색과 높은 형광입니다. 실행 가능한 세포가 지속적으로 레사 주린은 레조 루핀 (resorufin)로 변환, incre주변 세포 배양 배지의 전체 형광 색 asing.
  9. 한 바와 같이 전사 및 PCR 마커 유전자의 mRNA 발현의 정량적 실시간 역 내배엽 상피 세포의 총 RNA 분리를 수행한다. (16, 17)을
    1. SOAT1 mRNA를 검출하는 역전사 효소를 사용하여 PCR (센스 : 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '안티센스 : 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR 생성물을 B​​P = 168) EEC 세포 특이 마커로. 하우스 키핑 유전자 및 내부 통제로 β-굴지의 mRNA (PCR 제품 = 151 bp의 : '; 5' GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 안티센스'5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 감각)를 사용합니다.
    2. RT-qPCR에 제품의 크기를 검출하는 겔 전기 영동을 사용한다. 1 % 아가 로스 젤을 준비, 2 μL 로딩 염료 10 μl의 qPCR에 제품을 혼합한다. 로드 10 μL 웰을 1 % 아가 로스 겔에서 각 혼합물에, 30 분 동안 100V로 겔을 실행.

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결과

일관성 있고 유용한 셀 모델을 설정하는 목표를 달성하기 위해, 우리는 확장 증식 속도 및 조류 EECS의 성능을 안정화 할 필요가있다. 우리는 부분적 콜라겐 또는 콜라겐 플러스 디스 파제 0.6 U와 같은 단백질 분해 효소로 분해 내배엽 아니 효소 소화와 내배엽의 직접 배양을 비교 하​​였다. 디스 파제는 비극성 아미노산 잔기의 N 말단 펩티드 결합을 가수 분해 아미노 - 엔도 펩 티다 제이다. 단백질 분해 효소 소화 처리없이 소화 (그림 1)에 비해 세포 증식을 증가하는 반면, 세포 성장은 오일 배양 (그림 2) 이후 두 효소 처리와 현저하게 차이가 없었다. 그러나, 콜라게나 제 처리는 더 성장 곡선 귀착 EECS가 6~9일 (도 2)에 대해 안정적으로 증식 것으로 나타났다. 따라서, 부분 콜라게나 소화에서 EECS의 성장을 향상전 생체 내 외식과 충분한 및 기능 EEC를 획득...

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토론

전 배양 시스템은 제한된 성공을 갖기 때문에, 더 배양 시스템이 필요하다. 일본 메추라기 YSM의 내배엽은 전 생체 내 외식의 더 나은 성장 성능을 달성하기 위해 세포 - 세포 접합을 완화하기 위해 콜라겐 등의 단백질 분해 효소와 치료가 필요합니다. 우리의 데이터는 부분 소화 처리에서 세포 수는 이일 (그림 1)에 대한 시딩 후 소화되지 않은 조직 문화에서보다 더 컸다 것으로 나타났다. 따라서, 부분적인 단백질 분해 소화 YSM 셀에서의 수율을 향상시키는 중요한 단계이다.

현재 문화 프로토콜의 중요한 수정 부분 단백질 분해 소화합니다. 이 처리는 크게 셀 수율 라이브 EECS를 얻는 성공률을 향상. 오버 소화가 조직에서 세포를 분리하고 세포, 판에 부착되지 않기 때문에 아래 - 소화의 적은 세포 수율 결과 반면 소화 시간이 매우 중요하다조직 이식편. 우리는 위에서 설명한 조건을 사용하여 30 ~ 40 분 소화 최적 것으로 나타났습니다.

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공개 사항

경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다. 우리는 어떤 민간 기업으로부터 자금도 받지 못했습니다.

감사의 글

현재 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 특히 국립 대만 대학, 대만 (부여 ID-104R350144)뿐만 아니라 대만의 과학 기술부 (부여 ID "상위 대학 계획에 대한 목표"에 의해 지원됩니다 MOST (104) -2313-B-002-039-MY3). 우리는 특히 현재의 연구를위한 동물 실 및 실험실 공간을 제공하기 위해 국립 대만 대학의 생명 공학 센터 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 LEECs 펠릿
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 LEEC 배양의 기초 매체
NBCSGibco by Life technologies16010-159EEC 배양 시 공급 혈청
Pen-Strep Ampho. 솔루션BI (생물 산업)03-033-1B 100 ml감염 가능성을 약화시키기 위해 
Collagenase Type IVGibco17104-019 1 g  콜라겐분해효소(collagenase)는 Pro-XGly-Pro 서열에서 중성 아미노산(X)과 글리신 사이의 결합에 특이성을 가진 프로테아제입니다. 일차 조직에서 세포의 해리를 위한 프로테아제로.
24웰 플레이트FALCON® REF-353047EEC가 부착하고 확장하기 위해
50 ml PP 원심분리기 튜브Corning® CentriStarTM430829멤브레인 및 효소 분해 운반용
이 있는 50ml 원뿔형 바닥 튜브PRO TECHCT-50-PL-TW멤브레인 및 효소 분해 운반용
상호 진탕DEAGLESB302멤브레인의 더 나은 효소 분해를 위해
Life technologies의 를 캡

참고문헌

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  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
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