Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Optogenetic 방법이 널리 빛에 의해 빛 활성화 단백질과 신경 활동의 후속 조작의 대상으로 표현을 결합하여 신경 인구 및 회로의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Channelrhodopsins (CHRS)는 빛 문이 양이온 채널이며 형광 단백질에 융합 할 때 자신의 표현은 시각화 및 특정 세포 유형의 동시 활성화와 뇌의 정의 된 영역에서의 축삭 돌기 수 있습니다. 바이러스 벡터의 정위 주사 통해 CHR 융합 단백질을 구성 적 또는 조건 적으로 정의 된 뇌 영역의 특정 세포에서 발현 될 수 있고, 자신의 축삭 돌기이어서 뇌 조각의 생체 optogenetic 활성화를 통해 해부학 적 및 기능적으로 연구 될 수있다. 종래의 전기 자극 방법으로 해결 될 수없는 시냅스 연결의 특성을 이해하는 것을 목표로 할 때, 또는 새로운 원숭이를 식별하는데 특히 중요임대 및 이전에 제대로 이해하고 원심성 연결. 여기 몇 가지 예는이 기술이 편도체에 공포 관련 회로를 해명에 이러한 질문을 조사하기 위해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 증거의 많은 라인은 내측 전두엽 피질 (mPFC)이 두려움 수집 및 멸종의 다양한 측면에 참여하지만, 편도선과의 정확한 연결은 단지 이해되기 시작하는 것이 좋습니다. 생체 활성화 optogenetic 편도는 기저 (BLA)에 mPFC 구심과 목표 셀 간의 통신 시냅스의 양상을 연구하기 위해 사용하는 방법 먼저, 도시된다. 또한,이 생체 optogenetic 접근법 편도선에 GABA 성 뉴런의 그룹을 사용하여 신규 접속 패턴을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법을 도시하고, 예로서 paracapsular 인터 셀 클러스터 (mpITC).
서론
시각화 및 뇌 영역 및 신경 세포의 특정 유형과 특정 연결의 동시 활성화를위한 정확한 도구는 기능 연결 기본 건강한 뇌 기능과 질병 상태를 이해하는 데 더 중요 해지고있다. 이상적으로,이 신경 세포 통신 확인되는 정확한 시냅스 속성의 생리 학적 조사를 수반한다. 이는 단일 급성 뇌 조각에 보존 할 수없는 뇌 영역 간의 연결에 특히 사실이다. 과거에는 주로 별도 실험에서 달성되었다. 한편, 신경 추적자 주입 생체 후속 광 또는 사전 및 시냅스 파트너 전자 현미경 분석과 함께 사용되어왔다. 원래 영역에서 섬유 책자가 보존되고, 슬라이스 조제에서 액세스하는 경우 한편, 전기 자극은 대상 영역의 세포와 시냅스 통신 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어왔다.
자신의 시각화 및 사후 해부학 적 분석 1을 허용하면서 optogenetics의 출현으로, 같은 형광 단백질에 융합 Channelrhodopsins (CHRS)와 같은 빛 문이 양이온 채널의 대상으로 표현, 지금은 신경과 축삭 궤적의 활성화를 가능하게 4. 섬유 책자가 특정 궤도를 분리하지 않거나 때문에, 1) 기존의 전기 자극에 액세스 할 수 없다는 뇌 영역에서의 입력을 평가 : 부모 인 somata 5에서 절단 할 때 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 문 : 모든 실험 절차는 연구에 동물의 사용에 대한 EU 지침에 따라이었고, 지역 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (Regierungspräsidium 튀빙겐, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일의 상태) 튀빙겐 대학에 대한 책임.
1. 정위 주입 절차
- 멸균기를 사용하여 멸균 도구 (가위, 메스, 클램프, 드릴, 바늘, 봉합 재료)를 준비합니다. 이러한 무균 수술 드레이프에 멸균면 교환, 소독, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4), 및 H 2 O 2와 같은 살균 도구 및 기타 필요한 솔루션 및 수술 용품을 정리하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 수평 미세 전극 풀러에 3 mm 폭 상자 필라멘트를 사용하여 주사에 대한 유리 Micropipette과 (그림 1A, 삽입)을 당깁니다.
주 : 깊은 주사제, 전극 테이퍼가 충분히 있어야복부 대부분의 좌표에 도달 할 길이 (약 5mm;. 좌표를 들면, 1.10 참조). - 프리믹스 바이러스 솔루션의 1 μL 멸균 PBS에서 0.1 % 빠른 그린 솔루션의 0.2 μL (유리 피펫의 솔루션의 더 나은 가시성). 좋은 팁 (그림 1A, 삽입)와 마이크로 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 섹션에서는 감각과 조절 성 BLA에 대한 장기 계획과 mpITC 신경 세포뿐만 아니라 mpITC와 BLA 사이의 로컬 연결의 속성의 생리 학적 특성을 조사하기 위해 체외 optogenetic 접근 방법과 다른 실험적인 전략에서 대표적인 결과의 워크 플로우를 보여줍니다.
마우스의 뇌에 원하는 좌표 선택된 바이러스 벡터의 정위 주사 후 (도 1A-C 바이러스 발현 시간 2~6주은 실험에 따라), 편도의 주사 부위와 투영 영역의 급성 뇌 조각은 제조 패치 클램프 실험 및 주사 부위 (그림 1D)의 혹 사후 분석을 위해 주입 된 뇌 영역에서 적절한 각도로. 녹음 및 optogenetic 자극, 형광 표지 된 세포 또는 축삭 프로를 시작하기 전에대상 영역 (편도선)에서 용 돌기가 부착 된 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 모든 경우 쉽게, 가장에 구현 될 수있는 신경 회로와 지역 연결의 생체 optogenetic 조사하는 방법을 설명은 표면 형광 빛 포트에서 LED가 ~ 470 nm의 그들을 무장하여 수직 조각 패치 클램프 기록 설정. 조각의 축삭 돌기의 optogenetic 자극의 가장 큰 장점은 해당 섬유 책자는 알려져 있지 명확하게 정의되지 않은, 또는에서 보존되지 않은 있기 때문에, 특정 활성화 및 기존의 전기 자극에 접근하지 않았다 연결의 특성 조사를 위해 수 있다는 것입니다 하나의 뇌 조각. 공포 회로에 대한 중요한 열쇠 예로서,이가 편도선에 mPFC 입력의 특성을 해부에 적용 할 수있는 방법이 도시되어있다.
비록 전기 섬유 요로 자극 광범위 이전 연구에 사용 된 경우, 이러한 책자가 종종 원래 상이한 영역으로부터의 섬유를 운반. 예를 들어, 학습을 두려워 관련 회로에서, 시상 핵 또는 대뇌 피질의 영역을 서로 다른 감각의 돌기는 각각 내부 및 외부 캡.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
대표 결과를 얻을 수 있도록 도와준 Cora Hübner와 Andrea Gall에게 감사드립니다. 이 연구는 튀빙겐 대학교(University of Tuebingen)의 Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience(CIN)의 지원을 받았으며, 이는 Excellence Initiative(EXC 307)의 프레임워크 내에서 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)가 자금을 지원하는 Excellence Initiative와 Charitable Hertie Foundation의 기금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | 마우스용 다른 정위 프레임으로 교체 가능 |
| Steretoxic 프레임 마우스 어댑터 | Stoelting, USA | 51625 | 마우스용 다른 정위 프레임으로 교체 가능 |
| Stoelting, USA | 50264 | 더 이상 사용할 수 없으며 항목 번호로 대체되었습니다. 51609M | |
| 압력 주입 장치, Toohey Spritzer | Toohey Company, 미국 | T25-2-900 | 기타 압력 주입 장치(예: Picospritzer)를 사용할 수 있습니다 |
| Kwik Fill 유리 모세관 | World Precision Instruments, 독일 | 1B150F-4 | |
| 마취기, IsoFlo | Eickemeyer, 독일 | 213261 | |
| DC 온도 조절기 및 가열 패드 | FHC, 미국 | 40-90-8D | |
| 수평 마이크로피펫 풀러 모델 P-1000 | Sutter Instruments, 미국 | P-1000 | |
| 수술 도구 살균기, 살균기 75 | Melag, 독일 | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP(serotype 2/9) | Penn Vector Core, 미국 | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (혈청형 2/9) | 펜 벡터 코어, 미국 | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (혈청형 2/1) | Penn Vector Core, 미국 | AV-1-20298P | |
| 패스트 그린 | Roth, 독일 | 0301.1 | |
| 이소플루란 마취제, 이소푸란 CP(1ml/ml) | CP 제약, 독일 | ||
| 방부제, 베타딘(프로비돈-요오드) | Purdure Products, 미국 | BSOL32 | 는 다른 소독제로 대체 가능 |
| 진통제, 메타캠 솔루션(5mg/ml 멜록시캠) | 베링거인겔하임, 독일 | 은 다른 진통제로 대체 할 수 | |
| Bepanthen 눈 연고 | Bayer, 독일 | 0191 | 다른 눈 연고 |
| 드릴 NM3000 (SNKG1341 및 SNIH1681) | Nouvag, 스위스 | ||
| Sutranox 봉합사 바늘 | 미세 과학 도구, 독일 | 12050-01 | |
| 꼰 실크 봉합사 | 미세 과학 도구, 독일 | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | ) 구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23 | ||
| 참조 내부 패치 용액 | 구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | 정제된 상태에서 2M 원액 준비 물 |
| 슬라이서, Microm HM650V | Fisher Scientific, 독일 | 920120 | |
| 조직 슬라이서용 냉각 장치, CU65 | Fisher Scientific, 독일 | 770180 | |
| 사파이어 블레이드 | 델라웨어 다이아몬드 나이프 | 맞춤 주문, 회사에 문의 | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, 일본 | ||
| Xcite 형광등(XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, 캐나다 | 2012-12699 | |
| 패치 현미경, BX51WI | Olympus, 일본 | ||
| Multiclamp 700B 패치 증폭기 | 분자 장치, 미국 | ||
| Digitdata 1440A | 분자 장치, 미국 | ||
| PClamp 소프트웨어, 버전 10 | 분자 장치, 미국 | 데이터 수집 및 자극을 제어하는 데 사용 | |
| 목욕 온도 조절기, TC05 | Luigs & 독일 노이만 | 200-100 500 0145 | |
| 3축 마이크로매니퓰레이터 Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator 컨트롤러 SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| 패치 피펫용 유리 모세관 | World Precision Instruments, 독일 | GB150F-8P | |
| 인터페이스 챔버용 셀룰로오스 질산염 여과지 | Satorius Stedim Biotech, 독일 | 13006--50----ACN | |
| LED 장치, CoolLED pE | CoolLED, 영국 | 244-1400 | CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택인 |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, 영국 | pE-ADAPTOR-50E | CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극 |
| LED 장치, USL 70/470 | Rapp을 위한 두 가지 대안입니다. 광전자 | L70-000 | CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택입니다. |
| 듀얼 포트 어댑터 | Rapp 광전자 회사는 | CoolLED 또는 USL 70/470에 문의하고 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택입니다. | |
| 필터 세트 빨간색(여기) | AHF, 독일 | F49-560 | 필터는 F46-008 |
| 세트로 구입할 수 있습니다. (빔스플리터) | AHF, 독일 | F48-585 | 필터는 F46-008 세트로 구매할 수 있습니다 |
| (배출) | AHF, 독일 | F47-630 | 필터는 F46-008 |
| 필터 세트 녹색 (여기) | AHF, 독일 | F39-472 | 대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002 (대역통과 방출 포함) |
| (빔스플리터) | AHF, 독일 | F43-495W | 대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002(대역통과 방출 포함) |
| (배출) | AHF, 독일 | F76-490 | 대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002(대역통과 방출 포함) |
| LaserCheck, 휴대용 파워 미터 | Coherent, 미국 | 1098293 | |
| IgorPro Software, 버전 6 | Wavemetrics, 미국 | 전기생리학 데이터 분석, 기타 대체 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다 | |
| IgorPro용 신경학적 매크로 제품군 | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | 전기생리학 데이터 분석, 기타 대체 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다 | |
| 주사 및 투영의 사후 분석 | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm 페트리 접시 | SPL Life 과학 | 대안을 사용할 수 있습니다 | |
| 슬라이드, 슈퍼 프로스트 | R. Langenbrinck, 독일 | 61303802 | 대안을 사용할 수 있습니다 |
| 커버 슬립 | R. Langenbrinck, 독일 | 3000302 | 대안을 사용할 수 |
| Vecta Shield 장착 매체 | Vector Laboratories, 미국 | H-1000 | 대체 장착 매체를 사용할 수 있습니다 |
| 탄화를위한 셀룰로오스 질산염 필터를 사용할 수 있습니다 고정용 슬라이스 | Satorius Stedim Biotech, 독일 | 11406--25------N | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 LSM 710 | Zeiss, 독일 |
참고문헌
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
