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방법 논문

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

10.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53637

⸱

2016년 2월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

이 논문에서

요약

알긴산 비드의 3차원 배양은 단순성과 재현성으로 인해 뇌하수체 선종 세포를 유지하기 위해 선택되었습니다. 이 절차에는 초기 효소 분해 및 종양 조직의 기계적 해리가 포함되었으며, 후속 세포 현탁액은 알긴산 비드로 캡슐화되었습니다.

초록

삼차원 배양 방법을 설명하는 기본 뇌하수체 샘종 세포 알긴산 비드에서 성장된다. 알긴산 갈색 해조류 유래의 중합체이다. 간략하게, 종양 조직은 작은 조각으로 절단하고 콜라겐와 트립신 효소 소화에 제출된다. 이어서, 세포 현탁액이 얻어진다. 종양 세포 현탁액을 1.2 %의 알긴산 나트륨과 혼합 CaCl2를 적하하고, 알긴산 / 세포 현탁액을 구형 비드를 형성하기 위해 염화칼슘 2 접촉 겔화된다. 알긴산 비드에 포함 된 세포를 20 % FBS가 풍부한 배지에서 제공 영양분 공급된다. 알긴산 비드의 삼차원 배양 4 개월까지 장시간 선종 세포의 생존력을 유지한다. 또한, 세포는 시트르산 나트륨과 함께 비드를 세척하여 알긴산으로부터 해방 또한 면역 세포 화학적 분석을위한 커버 글라스에 접종 할 수있다. CEL의 사용난 문화 모델은 최소한의 해체와 액틴 세포 골격의 고정 및 시각화 수 있습니다. 요약하면, 알긴산 비드 뇌하수체 샘종 세포의 유지를위한 안정적인 배양 시스템을 제공한다.

서론

들은 배양 된 세포에 대한 입체 구조적지지 및 세포 간 통신 (1)의 유지 보수를 제공하기 때문에 삼차원 지지체 광범위 세포 배양에 사용되어왔다. 천연 유래 고분자 물질은 I 형 콜라겐, 키토산, 알긴산 등 3 차원 지지체를 만들기 위해 사용되었다. 알긴산은 갈색 해조류의 Macrocystispyrifera (다시마)에서 파생 된 천연 중합체이다. 이러한 중합체는 β-D-만누 산 (M) 및 α-L-guluronic 산 (G), 예컨대 칼슘 및 바륨과 같은 특정 가의 양이온의 존재 하에서 2 형태 안정한 겔 반복 단위로 구성된다. 염화칼슘 (CaCl2를) 솔루션은 일반적 알긴산 비드를 형성하는 가교 결합 시약으로 사용된다. 알긴산 솔루션은 즉시 입체 구형 겔을 형성 염화칼슘 (2)로 떨어졌다. 알지네이트 용액을 세포와 혼합 될 때, 세포는 알긴 B로 캡슐화EADS 3.

알긴산은 그것을 활성화 특성 연골 4, 5 및 골격 근육 모세포 신경줄 기세포 6 포함한 세포의 다양한 밀봉 용 매트릭스로서 사용되어야한다. 불활성 물질이며, 영양분, 산소 및 세포의 생존과 기능을 유지 대사 산물의 확산을 허용한다; 또한, 다른 겔 기반 배양 시스템과 달리, 알긴산 비드 내 배양 세포는 소듐 시트 레이트, 칼슘 킬 레이터를 사용하여 지지체로부터 유리 될 수 있고, 세포를 추가로 조사 7 수확 할 수있다.

뇌하수체 선종은 일반적으로 낮은 확산 속도와 양성 종양이다. 쥐 뇌하수체 선종 세포주 이차원 시스템 (8)에서 성공적으로 배양되었다. 그러나, 인간의 뇌하수체 분비 세포 종양이 배양 효율적인 발전 아니다; 분산 뇌하수체 종양 세포 성장 저조한배양, 세포 부착 및 확산 제한을 나타내고, 상기 세포는 전형적으로 배양 접시 9,10 부동 응집체를 형성한다.

몇몇 시도가 효소 및 기계적 분산 방식 (11)만으로 기계식 분산 방식 (12) 및 암 (10)의 이식편 배양 포함한 뇌하수체 종양 세포 현탁액을 수득되었습니다. 이러한 방식으로, 다른 저자는 시간의 다른 기간 동안 가능한 자기편 문화를 얻었다. 종양 분비 세포의 용량은 종양 유형 및 확산 속도에 의존하는 이들 9 이차원 시스템에서 생존한다. 그러나, 장기간 배양 섬유 아세포 표현형을 가진 세포를 11,13은 우세. 이 논문은 상기의 상세한 분석이 가능 알긴산 지지체 그들을 해방 알긴산 비드 캡슐화 뇌하수체 선종 세포 초대 배양을 얻는 방법을 설명자신의 세포 생물학, 예를 들어, 자신의 세포 골격 준비의 측면.

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프로토콜

본 연구는 의료 기관 및 국립 폴리 테크닉 대학의 연구 및 고급 연구 센터의 로컬 윤리위원회에 의해 인간의 물질의 사용이 승인되었다.

1. 종양 샘플 획득

  1. 트랜스 접형골 수술 14 환자에서 뇌하수체 선종 조직 생검을 얻습니다.
  2. 뇌하수체 샘종 샘플을 수집하고 신선한 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 풍부한 199 배지 (M199), 0.6 ㎎ / ㎖, 중탄산 나트륨, 2.4 ㎎ / ㎖ HEPES, 1 % 50 ㎖를 함유하는 멸균 된 유리 병에 배치 pH가 7.4에서 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신). 얼음에 유리 병에 샘플을 유지한다.
    주 : 종양 조직은 수술 후 몇 시간을 처리 할 수​​있다.
  3. 얼음에 유리 병 실험실에 종양 샘플을 전송.

효소 조직 해리 솔루션 2. 준비,트립신 억제제 용액 및 알긴산 솔루션

참고 : 세포 배양 과정에 앞서 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 모든 솔루션 필터.

  1. M199-혈청 5 ml의 콜라겐 (유형 I) 5 ㎎을 용해시켜 1 % 콜라게나 제 용액을 제조 하였다.
  2. PBS-0.3 % EDTA 10 ml의 트립신 0.01 g을 용해하여 0.01 % 트립신 용액을 준비한다.
  3. M199-혈청 20ml에 대두 트립신 억제제 2 ㎎을 용해시켜, 0.1 % 트립신 억제제 용액을 제조한다.
  4. 트립신 저해제 용액 4 ㎖에의 DNase I 134 U / ml의 20 ㎕의 용해 DNase의 용액을 준비한다.
  5. 155 mM의 NaCl을 40 mL의 EGTA 22.8 mg을 용해시켜 EGTA 용액 (1.2 M)를 준비한다. 7.4 pH를 조정합니다. 50 ㎖의 최종 부피를 계속합니다.
  6. 155 mM의 NaCl을 50 mL에 238 mg을 용해시켜 HEPES HEPES 용액 (20 mm)를 준비한다.
  7. 1.2에 용해시켜 1.2 % 알지네이트 용액을 준비HEPES 용액 100ml에 g 알긴산 나트륨. 알긴산 솔루션을 압력솥.
  8. pH는 7.4로 조정 한 50 ㎖ HEPES 용액에 CaCl2를 750 mg을 용해시켜 칼슘 용액 (102 mm)를 준비

3. 주요 세포 배양 및 알긴산 캡슐

  1. 층류 캐비닛 내부, 약 20 ml의 PBS 자유 칼슘 및 마그네슘 2+의 pH 7.4 (PBS *)를 함유하는 35mm 페트리 접시에서 종양 조직을 배치했다.
  2. 부드럽게 조직을 씻어 외과 트위터와 조직을 가지고 신선한 PBS * 포함 된 다른 배양 접시에 넣습니다. 적혈구 나 이물질이 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다.
  3. 수술 집게를 사용하여, 뇌하수체 선종 조직을 보유하고 작은 수술 용 가위로 작은 조각으로 잘랐다. 둥근 모서리 파스퇴르 피펫, RT에서 10 분 동안 68 XG에, 15 mL의 원심 분리 튜브에가 조직 단편 PBS * 옮긴다.
    참고 : 파스퇴르의 가장자리를 둥글게하기피펫은, 약간 분젠 버너에 피펫의 끝을 불꽃.
  4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS *를 제거하고 (약 조직의 65mm 3 5 ml)을, 반전에 의해 2 ~ 3 배를 혼합 콜라겐 솔루션의 3-5 ml를 추가합니다. 일정한 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 콜라게나 제의 조직을 인큐베이션.
  5. 실온에서 10 분 동안 68 XG에 튜브를 원심 분리기와 파스퇴르 피펫으로 콜라게나 제를 제거합니다.
  6. 다음, RT에서 10 분 동안 68 XG에서 튜브를 원심 분리하여, DNase를 5 mL를 첨가하고, 반전하여 2 ~ 3 배를 섞는다.
    주 : 조직이 완전히 해리되지 않는 경우 37 ° C에서 3 분간 트립신 제 효소 소화를 수행한다. 트립신 저해제 용액이 양의 첨가에 의해 분해를 정지.
  7. 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 대기음 및 폐기합니다. EGTA 용액 1 볼륨의 펠렛을 다시 중단하고 알긴산 용액의 2 권과 혼합.
  8. 조심스럽게 세포 현탁액과 알긴산 염을 혼합파스퇴르 피펫과 피펫 팅에 의해. , 21 G 바늘 멸균 주사기를 가지고 플런저를 제거; 알긴산 및 세포 용액으로 주사기를로드 피펫을 사용합니다.
  9. 부드럽게 주사기에 플런저를 삽입하고 신중 알긴산 세포 용액을 드롭하여 드롭 칼슘이 풍부한 용액 약 30 ㎖를 함유하는 유리 비커에 분배.
  10. 약 5cm까지 염화칼슘 2 용액을 주사기의 바늘을 놓습니다. CaCl2를 접촉에 알긴산 세포 현탁액 겔 구형 비드를 형성한다. 5 분 동안 용액에 칼슘 알기 네이트 비드 유지.
    참고 : 구슬이 삭제되는 유리 비커를 저어. 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해, 원형 운동에서 손으로 천천히 이동합니다.
  11. 조심스럽게 파스퇴르 피펫과 칼슘 용액을 제거하고, FBS의 20 %로 농축 M199의 3 ~ 5 ㎖로 두 번 구슬을 씻는다.
  12. 일반 T25 조직 배양에 알긴산 비드 전송멸균 플라스크 주걱을 사용하여 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 M199 4-5 ml를 20 % FBS가 풍부한 배양 추가한다. 모든 셋째 날 문화 매체를 변경합니다.

4. 알긴산에서 세포를 해방

주 : 앞서가 알긴산 비드로부터 세포를 해방하는 폴리 D 리신 코트 13mm 직경을 커버 슬립.

주의 : 황산은 부식성이 강한 산성이며, APTS는 눈과 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 이러한 시약을 처리하기 위해 라텍스 장갑을 사용합니다.

  1. 흄 후드에서 포인트 집게와 RT에서 1 시간 동안 20 % 수성 황산을 함유하는 유리 페트리 접시에 몰입 된 커버.
  2. 황산을 경사 분리하고, 5 분마다 증류수로 커버 슬립 다섯 번 세척 하였다. 포인트 트위터 장소 RT 15에서 5 분 동안 0.1 M 수산화 나트륨을 포함하는 배양 접시에서 깨끗한 커버 슬립을 사용.
  3. 수산화 나트륨을 가만히 따르다 및 증류하여 한 번에 씻어인도 물, 물을 기음과 커버 슬립을 건조.
  4. 4 분 APTS (아미노 프로필 - 트리에 톡시 실란)로 코팅 된 커버를 마이크로 피펫을 사용 증류수로 페트리 접시 홍수 (6 커버 슬립 500 μl를 사용). 빨리 물을 기음과 물이 아래에 침투 할 수 있도록 포인트 핀셋으로 된 커버를 이동, 증류수로 세척하는 것을 계속한다.
  5. 물을 기음과 커버 슬립을 건조, 깨끗한 페트리 접시에 포인트 트위터 장소를 커버 슬립을 사용하여 3 시간, 45 초 각시 전자 레인지 내부를 소독. 폴리 D 라이신 100 μg의 (0.1 ㎎ / ㎖)을 멸균 1,000 μl를 추가합니다.
  6. RT에서 5 분 동안 폴리 D 라이신 약 50 μL로 커버 슬립을 부화. 완전히 폴리 D 라이신 대기음.
    주 : 배지에 가용성 폴리 -D- 라이신 세포 증식을 억제 할 수 있기 때문에 중요하다.
  7. 5 분마다 커버 슬립을 멸균 수로 5 회 헹군다. 일을 기음erile 물과 허용 된 커버는 층류 캐비닛 내부 건조합니다.
  8. 액틴 세포 골격을 분석, 알긴산에서 뇌하수체 세포를 유리. 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 배양 플라스크에서 알지네이트 비드의 일부를 가지고 15 ML 튜브에 배치합니다.
  9. 55 mM의 시트르산 나트륨 5 ㎖ 추가 RT에서 10 분 동안 68 XG에 원심 분리기 (323.6 나 3 C 6 H 5 O 7 ㎎, 2 H 2 O 20 ML의 HEPES 용액을 용해). 뜨는을 대기음 및 폐기합니다.
  10. 20 % FSB 풍부 따뜻한 M199 1 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중지; 부드럽게 파스퇴르 피펫 세포 현탁액을 혼합한다.
    주의 : Phalloidin의 및 DAPI는 독성이. 이러한 시약을 처리하기 위해 장갑을 사용합니다.
  11. 세포를 계산 1.5 ML 튜브에 0.4 % 트리 판 블루 용액 125 μl를 전송합니다. M199 75 μL와 마지막 단계 (희석 배수 = 5)에서 수득 된 세포 현탁액 50 μL를 추가한다. 철저하게 섞는다.
  12. PLAC하는 마이크로 피펫 팁을 사용하여혈구 챔버의 트립 판 블루 세포 현탁액 즉 약 10 μL.
  13. 위상차 조명 도립 현미경을 이용하여 혈구 계수기의 셀 개수. 1mm 센터 광장과 네 1mm 코너 사각형의 모든 세포를 계산합니다. 희석 인자에 의해 단위 면적당 평균 개수를 곱하여 밀리리터 당 세포 밀도를 얻기 -. 10 (4), 예를 들어 단위 면적당 평균 개수는 45 셀 × 5 × 104 = 2.25 × 106 세포 / ml 인 경우.
    참고 : 혈구 챔버의 열 사각형의 셀을 계산합니다. 아래쪽과 오른쪽에 중간 선을 터치 세포를 계산하지 마십시오.
  14. 시드 폴리 D 라이신으로 피복 13mm 직경 커버 글라스에 35,000 세포.

5. 액틴 세포 뼈대 배열

  1. 문화 48 시간 후, 파스퇴르 피펫으로 배양액을 제거하고 신속 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가, 즉시 PBS를 제거합니다.
  2. t 수정하고 Permeabilize 하시려면37 °에서 10 분 동안 고정 완충액 (0.1 M PIPES, pH가 6.75, 4 %의 PEG-6000, 1mM의 EGTA, 1mM의 황산, 0.5 % 트리톤 X-100, 2 % 포름 알데히드)의 커버 슬립 당 500 μL와 그 셀 기음
  3. 고정 버퍼를 제거하고 실온에서 30 분 동안 PBS에서 3.5 % 파라 포름 알데히드의 coverslip에 500 μl를 추가합니다. 파라 포름 알데히드 용액을 제거합니다.
  4. 5 분마다 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가하여 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 일정한 교반에, RT에서 커버 슬립을 씻어.
  5. 10 분 동안 50 mM의 염화 암모늄으로 세포를 인큐베이션 염화 암모늄 용액을 흡인하고, 단계 5.4를 반복한다.
  6. 30 분 동안 PBS에 1 % BSA (IgG의 프리 프로테아제 무)로 세포를 인큐베이션 BSA 용액을 제거하고, 단계 5.4를 반복한다.
  7. 실온에서 7 분, 단계를 반복 5.4 로다 민 - 복합 팔로이 딘의 50 μM과 세포를 품어.
  8. RT에서 5 분, 단계를 반복 5.4 PBS에 희석 DAPI의 255 μM와 세포를 품어. 마지막으로 t 마운트그는 장착 매체로 된 커버와 매니큐어로 밀봉.
  9. 541 nm의 여기 파장 63X 대물 렌즈와 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용 액틴 세포 골격 배열의 이미지를 획득.

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결과

이 프로토콜은 문화와 다양한 기간에 대한 알지네이트 비드의 선종 뇌하수체 세포의 유지 보수에 성공적으로 적용되었다 삼개월 후 1 쇼를 알지네이트 비드에 포함 된 셀을줍니다.; 이 세포는. 거꾸로 광학 현미경 (그림 1)에서 이중 굴절 둥근 모양을 나타내는 2 알긴산에 포함 된 쥐의 뇌하수체 선종 세포에서 N-cadherin의 국산화를 보여줍니다. N-cadherin의 세포 세포 연락처 (그림 2A와 2C)에서 지역화 및 핵 (그림 2B와 2C) 확장 염색질을 보였다.

알긴산 비드 종양 세포는...

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토론

이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 제는 세포 배양 물 모두에서 영양소와 가스 확산 동일한 조건을 유지하는 데 필요한 비드 크기의 균일 성이다. 우리의 경험에 의하면, 알긴산 비드를 만들기 위해 21 G 바늘의 사용은 균일 한 비드 크기의 효율적인 문화의 취득이 가능합니다. 두번째 중요한 요소는 바늘의 거리이고; 이 거리는 칼슘 용액을 5 센티미터 칼슘 용액의 표면에 알긴산 / 세포 용액의 흐름의 충돌에 의한 변형 진주 사균을 방지하는 것보다 더 없어야한다. 세 번째 중요한 단계는 비드가 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해 감소 된 유리 교반한다. 고르지 세포 캡슐화의 결과를 나와.

이 프로토콜의 일부 수정이 경험은, 예를 들면, 연구 문제의 와트 따라 혼합 될 수 알긴산 나트륨 용액을 수행 할 수있다기저막 IV 형 콜라겐 등의 단백질, 및 전술 한 프로토콜에 따라 i 번째, 입체 알긴산 지지체를 얻었다. 또 다른 가능성은 15mm 직경의 우물의 알긴산 쿠션을 부...

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공개 사항

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감사의 글

O. Rios씨의 기술 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>시약 
199 문화 매체 인비트로젠 31100-027문화를 위해, 37 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조 
태아 소 혈청 PAAA15-751
중탄산 나트륨 (NaHCO3)Merck106329
N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES)Sigma H-4034
페니실린/스트렙토마이신PAAP11-010
PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Invitrogen 21600-044
콜라겐 분해 효소 I 형Worthington4176
트립신 인비트로젠 27250-018
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)연구 유기물3002E
소르빈 트립신 억제제 인비트로젠 17075-029
DNAseWorthington2139
알긴산, Macrocystis pyrifera (다시마)시그마 A-2158
염화칼슘 (CaCl2)J.T. Baker1332
구연산나트륨 (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)Research Organics9624P
폴리에틸렌 글리콜 6000 (PEG 6000)Calbiochem528877
Ethylene 글리콜 테트라아세트산(EGTA)Research Organics9574E
마그네슘 설페이트(MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
포름알데히드J.T. Baker2106
파라포름알데히드SigmaP6148
염화암모늄(NH4Cl)J.T. Baker660
BSA 소 혈청 알부민 IgG-FreeJackson Immuno Research001-000-161
Phalloidin– 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트 시그마P1951독성. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오 
4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드 (DAPI)인비트로겐 D1306독성. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오 
황산 (H2SO4)J.T. Baker9681부식성이 높습니다. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오 
수산화나트륨(NAOH)Merck1.06498눈과 피부에 자극을 일으킬 수 있습니다. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오 
(3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTS)SigmaA-3648
폴리-D-라이신 하이드로브로마이드SigmaP7280
트리판 블루 솔루션SigmaT8154 
이름    회사  카탈로그 번호  코멘트
장비  독성: 암을 유발할 수 있음. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오 
로테이터 Boekel Scientific모델 230300
원심분리기DuPont Corporation 모델 sorvall TC6
쉐이커 랩라인 기기모델 314-820 

참고문헌

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