우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
콜라겐의 당 단백질 패밀리는 현대 조직 공학에서 사용되는 생체 물질의 주요 성분은 인체의 주요 구조 단백질을 나타내고있다. 그것은 특히 피부 모델에서, 결합 조직 및 후속 조직 응집력 차선의 형성의 결과로 악명 느린으로하는 기술 병목 시험관 안의 콜라겐 침착이다. 여기서는 콜라겐 침착의 극적인 향상을 초래 고분자 크롤 (MMC)을 생성하는 피부 배양 물을 차등 적 규모 자당 공중 합체의 첨가를 포함하는 방법을 설명한다. 특히, 피부 섬유 아세포는 컨트롤과 비교하여 MMC하에 콜라겐 I / IV / VII 및 피브로넥틴 상당한 양의 증착.
프로토콜은 또한 immunocy 의해 입증 배양 표면에 유지 된 세포 외 기질 (ECM)의 상당량이 노출 혼잡 세포층을 decellularize하는 방법을 설명tochemistry. 전체 매트릭스 질량 분포 패턴은 반사 간섭 현미경을 사용하여 연구 하였다. 구성과 형태를 변화의 흥미롭게도, 섬유 아 세포, 각질 세포와 공동 배양 생산 세포 유래 매트릭스 (CDM). CDM 따라서 더 많은 임상 적 응용 프로그램으로 이동, 코팅 또는 비계의 현재 사용은 일반적으로 이종 동물 소스에서 피할 수 이차 전지의 파종을위한 "바이오 인공 지지체"로 사용할 수 있습니다.
또한,이 프로토콜은 특히 더모 - 표피 접합부 (DEJ)에 ECM 증착을 강화하기에 충분 하였다는 3D-의 Organotypic 피부 공동 배양 모델 콜라겐 VII, 주성분의 침지 단계 MMC의 적용을 설명 의 원 섬유를 고정. 전자 현미경 대조군에 비해, MMC 개발 문화 브릴 고정구의 존재를 확인했다. 고정 원 섬유가 표피에 진피를 밧줄로이, 따라서 중요하다미리 형성된 성숙한 DEJ가 이식 안정성과 전반적인 상처 치유의 관점에서 피부 이식받는 사람을 도움이 될 필요. 또한, 배양 시간은 비용 절감, MMC를 사용하는 경우, 성숙한 구조물을 구하는 3 주 5주에서 응축시켰다.
서론
피부는 수분 손실과 병원균 항목을 방지하여 보호 장벽을 형성한다. 그것은 세 가지 주요 구성 요소로 구성된다; 간질 풍부한 진피 (1), 층상 표피 그 위에 2,3,4와 5,6 사이의 더모 - 표피 접합부. 진피는 주로 콜라겐과 탄성 섬유로 구성되어 있으며 드문 드문 섬유 아세포 (7)로 채워집니다. 대조적으로, 세포가 풍부한 표피 각질 세포의 여러 층으로 구성된다. 가장 안쪽 층의 각질 세포는 증식하고 갱신 끊임없이 피부의 가장 바깥 쪽 층으로 이동 겪는 각질화 층 결과들은 핵 및 세포질 물질을 잃은 말기 분화 각화 세포를 대체 새로운 기저 세포를 제공한다 박리.
진피 - 표피 접합부 기저막의 특정 유형은 tethe 도통 매트릭스 분자로 이루어지는 복합 구조진피에 표피를 RS. 진피의 콜라겐 I 섬유는 콜라겐 VII는 콜라겐 IV 풍부한 라미 densa에 고정되어 미세 섬유를 고정으로 인터레이스. 차례로 정박 필라멘트 (라미닌 5, 콜라겐 XVII 및 인테그린)를 기초 각질 세포의 hemidesmosomes와 라미 densa를 연결합니다. 기저 각질 세포 (지층 basale)는 미분과 suprabasal 층을 형성 계층화뿐만 아니라, 증식 및 갱신 능력을 가지....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. Macromolecular의 크라우 딩 2D 피부 세포 배양에
- 종자 50,000 세포 (차 섬유 아세포 또는 기본 각질 세포 또는 기본 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화) 24 웰 플레이트의 웰 당. 대응하는 셀 타입 성장 배지 1 ㎖ 종자 세포.
- 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
- 오래된 미디어를 취소하고 1 ml의 신선한 미디어는 거대 분자 crowders 100 μM의 아스 코르 빈산을 함유 교체합니다. 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 항생제로 보충 37.5 밀리그램의 DMEM으로 구성된 / ml의 피콜 70, 25 ㎎ / ㎖ 피콜 (400)를 사용하여 섬유 아세포 미디어 (FM)를 구성된 크라우 칵테일을 사용합니다. 무 혈청 미디어, KSFM 또는 CNT-57에서 각질 세포를 성장. FM 50 % 및 50 %의 혈청이없는 배지의 혼합물에 공동 배양을 유지한다.
- 매 2 일 미디어 변화에, 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터 6 일 동안 문화를 품어.
피부 세포 배양 2. 형광 면역 염색
- 1X PBS로 두....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
고분자 쇄도 특히, ECM 증착을 향상시킬 수 있었다 섬유 아세포 배양 제어 비해 더 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴 증착 (도 1, 세포층을도 1a, 콜라겐 I, 1B, 콜라겐 IV, 1C, 피브로넥틴). 탈세 포화되면, 각질 세포 (그림 1, 매트릭스)에 비해 섬유 아세포는 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴의 주요 예금자가 있다고 분명했다.
도 2에서, 섬유 아세포보다 각질 콜라겐 VII의 주요 생산자 있다고 관찰되었다. 이것은 (베니 등, 2015) 시험 관내에서 성공적으로 증착 된 콜라겐 VII의 첫 번째 보고서입니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
강화된 세포외 기질은 단백질분해제에 의한 프로펩타이드 절단을 증가시키는 배제된 부피 효과로 인해 세포 배양에 거대분자 크라우더를 도입할 때 얻어집니다. 그 결과 세포외 기질, 특히 콜라겐이 더 빨리 처리되어 배양 표면에 침착됩니다. 다른 그룹은 두꺼운 섬유아세포 세포층을 얻었지만 몇 주20의 배양 시간이 필요했습니다. 대조적으로, 이 프로토콜에 설명된 MMC는 ECM의 양을 증가시키면서 배양 시간을 획기적으로 단축합니다. 밀집된 세포 배양에서 반응 속도의 증가는 연골 세포 기질 침착21, 세포외 기질 조직22,23 및 지방 형성24에서도 보고되었습니다.
밀집된 세포층의 탈세포화 후, 세포 유래 매트릭스를 수확하여 다양한 조직 공학 응용에 사용하며, 그 중 하나는 세포 유래 매트릭스25,26 위에 2차 세포 배양을 파종하는 것입니다. 매트릭스는 세포 유래 및 천연 산물이기 때문에 이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 상충되는 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작업은 의학 생물학 연구소(Institute of Medical Biology)에 대한 핵심 지원을 통해 싱가포르 생물의학 연구 위원회(Biomedical Research Council)의 지원을 받았으며 SPF2013/005 보조금을 받았습니다. M.R.은 NUS 교수 연구 위원회 보조금(의학 공학)(M.R.)의 지원을 받았습니다. R-397-000-081-112 및 NUS 조직 공학 프로그램(NUSTEP). 저자는 콜라겐 VII 항체를 제공한 Irene Leigh 교수에게 감사를 표합니다. 전자 현미경 작업은 싱가포르 국립대학교 전자현미경 유닛(National University of Singapore Electron Microscopy Unit)에서 수행되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아스코르브산 | Wako | 013-12061 | 세포 배양 매체 첨가제 |
| 세포 배양 삽입물 (6웰 형식) | Greiner Bio-One | 657610 | 유기형 배양 |
| 구연산염 용액 | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution 구연산염, pH 6 (x10) |
| 콜라겐(쥐 꼬리) | Corning | 354236 | 유기형 배양 |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | 세포 배양 배지 |
| DAB 기판 + 발색 키트 | Dako | K3468 | 조직학 |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL 검출 시약 | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection |
| Reagent Electron microscope (TEM) | 절 | JEM-1010 (100kV) | 투과 전자 현미경 |
| 섬유아세포 매체 (FM) | 고 포도당 -DMEM + 10 % 소 태아 혈청 + 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | 세포 배양 배지 |
| 용해 완충액 | ThermoFisher Scientific | 89900 | 단백질 추출을 위한 용해 완충액. 이 용해 완충액에 프로테아제 억제제(Roche, #11836170001)가 추가되었습니다. |
| 현미경 | Zeiss | LSM510 | AF594, AF488 및 DAPI 형광 면역 염색(40X mag)을 시각화하기 위한 빨간색, 녹색 및 파란색 채널. |
| 마운팅 미디어 (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| 마운팅 미디어 (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I 항체 | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (집 내) | ||
| 항 피브로넥틴 항체 | Abcam | #ab2413 | |
| 환원제 | ThermoFisher Scientific | NP0009 | 웨스턴 블롯 |
| 샘플 버퍼 | ThermoFisher Scientific | NP0008 | 웨스턴 블롯 |
| 2차 항체(Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher 사이언티픽 | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 염소-안티-마우스 | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 닭-안티-토끼 | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 염소-안티-마우스 | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| 2차 항체(HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | 희석되지 않은 |
| 나트륨 데옥시콜레이트 | Prodotti Chimicie Alimentari | 탈세포화 | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 햄' s F12 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 10% 소 태아 혈청 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 100 U/ml 페니실린 및 100 U/ml 스트렙토마이신 | 은 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 0.4 mg/ml 하이드로코르티손 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 5 mg/ml 인슐린 | 은 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 1.8&미드닷; 10-4 M 아데닌 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 5 mg/ml 트랜스페린 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| 2&미드닷; 10- 11 M 트리요오드티로닌 | 유기형 배양의 공기-액체 계면 중에 사용됩니다. 이 배지는 세포 배양 삽입물의 외부에 추가됩니다. | ||
| Trypsin | Biopolis 공유 시설 | 0.125% Trypsin/Versene 산도 7.0 + 0.3 | 세포를 트립신화하는 데 사용 |
참고문헌
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
