모델링 화학 요법 내성 백혈병 체외

요약

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

초록

골수 미세환경이 이 지역에서 시작되고 진행되는 조혈 질환에 대한 독특한 성역 장소를 제공한다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 현재 보고서에 제시된 모델은 인간의 1차 골수 기질 세포와 조골세포를 종양 세포 표현형에 영향을 미치는 골수 틈새의 두 가지 대표 세포 유형으로 활용합니다. 이러한 주요 틈새 성분을 가진 인간 백혈병 세포에 대해 설명된 체외 공동 배양 조건은 다양한 기술에 의한 분석을 위해 배양에서 효율적으로 회수할 수 있는 종양 세포의 화학 저항성 하위 집단의 생성을 지원합니다. 영양 플럭스를 방지하기 위한 엄격한 섭식 일정에 이어 젤 유형 10 가교 덱스트란(G10) 입자 부착 골수 기질 세포(BMSC) 또는 조골세포(OB) 아래로 이동한 종양 세포 집단의 회수는 종양 세포의 "위상 딤"(PD) 집단을 생성함으로써 정제된 치료 저항성 백혈병 세포의 일관된 공급원을 제공합니다. 임상적으로 관련된 이 종양 세포 집단은 세포사멸, 대사 및 세포주기 조절 경로를 조사하기 위한 표준 방법으로 평가할 수 있을 뿐만 아니라 최소 잔류 질환을 대상으로 하는 전임상 조사 전에 새로운 치료 전략을 테스트할 수 있는 보다 엄격한 표적을 제공할 수 있습니다.

서론

설명된 방법의 전반적인 목표는 화학 요법에 노출되는 동안 백혈병 세포의 생존을 지원하는 골수 지원 메커니즘의 기초가 되는 메커니즘의 조사를 지원하는 효율적이고 비용 효율적인 체외 접근 방식을 제공하는 것입니다. 치료 후에도 잔존하는 잔여 종양 세포가 재발에 기여한다는 것은 잘 알려진 사실이며, 이러한 질환은 진단 당시보다 더 공격적이며 치료의 효과가 떨어지는 경우가 많다^1-8. 치료 접근법을 테스트하기 위해 배지 내 세포 배양에만 국한되는 것과 같이 백혈병 세포를 단독으로 포함하는 모델은 이러한 중요한 신호 또는 틈새 세포와 매우 특이적인 상호 작용을 하는 종양 세포 하위 집단이 향상된 보호를 유도하는 틈새 파생 단서의 가용성에 반응하여 발생하는 질병의 이질성을 고려하지 않습니다. 골수 유래 기질 세포와 백혈병 세포를 공동 배양하는 표준 2D 공동 배양 모델은 골수 틈새의 기여도를 어느 정도 다루었으며 골수 미세환경 세포와의 상호 작용이 화학 요법에 대한 저항력을 증가시키고 성장 특성을 변화시킨다는 것을 보여주었습니다^9-14. 그러나 이러한 모델은 종양 세포의 장기 생존을 요약하지 못하는 경우가 많으며 MRD에 기여하는 가장 내성이 강한 백혈병 세포 집단과 관련된 결과를 정확하게 알려주지 않습니다. 생체 내 모델은 여전히 중요하며 임상 시험 전에 혁신적인 치료법을 조사하기 위한 "황금 표준"을 정의하지만, 내성 종양 및 질병 재발과 관련된 가설을 테스트하는 데 필요한 시간과 비용으로 인해 종종 어려움을 겪습니다. 따라서 보다 유익한 2D 모델의 개발은 후속 쥐 기반 전임상 설계의 설계에 더 나은 정보를 제공하기 위한 파일럿 조사에 도움이 될 것입니다.

이 보고서에 제시된 2D 체외 모델은 실제 생체 내 미세환경의 복잡성은 부족하지만, 종양 세포의 화학내성 하위 집단을 풍부하게 하는 데 특히 적합한 미세환경과의 종양 상호 작용을 조사할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 수단을 제공합니다. 이러한 구분은 전체 종양 세포 집단에 대한 평가가 가장 중요한 표적을 구성하는 소그룹의 치료 저항성 종양 세포의 표현형을 가릴 수 있기 때문에 가치가 있습니다. 또 다른 장점은 관심 있는 분석에 맞게 모델을 확장할 수 있다는 것입니다. 종양 세포의 상당한 회수가 필요한 분석을 위해 벌크 배양을 설정할 수 있으며, PCR 기반 분석 또는 현미경 기반 평가에는 다중 웰 플레이트의 소규모 공동 배양을 활용할 수 있습니다.

이러한 필요에 따라 우리는 B-계통 급성 림프구 백혈병(ALL)의 특징인 질병의 이질성을 해결하기 위해 체외 모델을 개발했습니다. 우리는 건강한 세포와 많은 공통점을 공유하는 모든 세포가 BMSC 또는 OB 공동 배양의 별개의 구획에 국한되어 있음을 보여줍니다. 치료 반응 조사에 유용한 뚜렷한 표현형을 가진 3개의 종양 세포 집단이 생성됩니다. 구체적으로, 우리는 공동 배양의 "위상 딤"(PD) 집단에서 회복된 (모든) 세포가 세포독성 물질에 노출되지 않은 종양 세포와 유사한 생존 요법에 일관되게 불응성을 보인다는 것을 입증합니다. 확립된 세포주 또는 1차 환자 샘플에서 추출한 이러한 모든 세포는 부착 기질 세포 또는 조골세포층 아래로 이동하지만 배양물의 트립신화 및 겔 유형 10 가교 덱스트란(G10) 입자 컬럼¹⁵을 활용하여 세포 유형을 분리한 후 캡처할 수 있습니다.

여기에서는 골수 미세환경 기질 세포(BMSC/OB)와 백혈병 세포 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용할 수 있는 2D 공동 배양 설정을 제시합니다. 특히 중요한 것은 백혈병 세포가 기질 세포 단층에 비해 3개의 공간적 하위 집단을 형성한다는 관찰과 PD 집단이 BMSC 또는 OB와의 상호 작용으로 인해 화학 요법 내성 종양 집단을 나타낸다는 관찰입니다. 또한, G10 컬럼으로 백혈병 세포 집단을 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 주목할 점은 이러한 하위 집단을 분리하면 가장 내성이 강한 PD 집단의 다운스트림 분석을 통해 골수 미세환경 기질 세포 또는 조골세포와의 상호 작용으로 인해 이러한 세포에 부여되는 잠재적인 내성 모드를 결정할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이 공동 배양 및 분리 모델의 다운스트림에서 활용한 기술에는 유세포 분석 평가, 단백질체 분석 및 표적 단백질 발현 평가뿐만 아니라 최근에 개발된 레이저 절제 전기 분무 이온화(LAESI) 및 대사 프로파일을 평가하기 위한 Seahorse 분석이 포함됩니다. 위의 기술과 함께 이 모델을 사용함으로써 우리는 백혈병 세포의 PD 집단이 배지에서 단독으로 배양된 백혈병 세포 또는 동일한 공동 배양에서 다른 하위 집단에서 회수된 백혈병 세포와 비교할 때 고유한 화학 요법 내성 표현형을 가지고 있음을 발견했습니다. 따라서 이 모델은 골수 미세환경과의 상호 작용을 통해 내성 표현형을 도출하는 가장 화학요법 저항성이 높은 백혈병 세포를 대상으로 하는 테스트 전략을 보다 엄격하게 평가하는 데 적합합니다.

프로토콜

1. 고급 준비

1. 덱스 트란 G10 입자를 준비합니다.
   1. 10g의 G10 입자로 1X PBS 50 ㎖를 첨가하여 G10 슬러리를 준비한다. 반전에 의해 믹스와 G10가 4 ° CO / N에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 정착 할 수 있습니다.
   2. G10 컬럼 분리의 날, 정착 G10 입자에서 흡인 PBS 및 50 ml의 신선한 PBS를 추가합니다. 반전으로 섞는다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 정착 G10 입자와 저장소에 50 ml의 신선한 PBS를 추가, 두 번 반복합니다.
2. BMSC와 OB를 배양.
   1. 90 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 6 % CO ₂ 및 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장하고 37 ° C에서 BMSC 또는 OB를 모두 유지한다.
   2. 새로운 10cm 플레이트에 2를 Trypsinize BMSC 또는 OB 세포와 1 분할. 백혈병 공동 배양에 필요한 때까지 세포는 이러한 표준으로 성장하고 있습니다.

2. 구축 및 공동 문화를 유지

1. 5 ~ 20 × 10 ⁽⁶⁾ 백혈병 세포를 추가하기 전n은 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판 상에 종양 특이 적 배양 배지 10 ㎖.
   참고 : 우리의 실험실 더 나은 1 %에서 7 % ^{16 ~ 18의} 범위 것으로 나타났다 골수 미세 환경을 요점을 되풀이하는 5 % O _2에서 37 ° C에서 공동 문화를 유지한다. 그러나,이 산소 장력 공동 배양을 유지하는 세 백혈병 개체군의 확립에 중요하지 않으며 실의 재량이다.
2. 매 4 ^번째 날 (정지에서 백혈병 세포를 포함) 미디어의 1ml를 제외하고 모두 제거하고 9 ml의 신선한 백혈병 배양 배지로 교체. 판에서 미디어의 9 ml의를 제거 할 때, BMSC 또는 OB 접착층을 방해하지 않도록주의.
   1. 플레이트의 모서리에있는 측과 대기음 미디어에 판을 기울여 용지를 제거합니다. 신선한 매체를 추가 할 때 또한, BMSC 또는 OB 접착 층의 중단을 최소화 할 수 있도록 측벽에 대한 플레이트의 모서리에 적가를 추가해야합니다.
3. 공동 문화의 12 ^일 하루를 보낸 후, 약 5 ~ 10 배를 요리부터 문화 미디어를 피펫 팅 아래로 부드럽게 접시 위에 의해 BMSC 또는 OB 층에서 백혈병 세포를 씻어 다음 15 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. 단계 2.1에 설명 된대로 새 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판에 시드.
   참고 : BMSC 또는 OB 단층을 방해하지 않고 S 및 PB 백혈병 세포를 제거 단계 2.3에 설명 된대로 공동 문화의 부드러운 세정. 이것은 종양 세포는 다음 공동 배양 플레이트로 전달 될 수있다. 시간 12 일주기는 사용자의 필요에 따라 필요한만큼 여러 번 반복 될 수있다.

3. 준비 G10 구슬 열

주 : 멸균 하류 분석 또는 배양이 G10 컬럼 분리 한 다음 필요한 경우 다음 단계 멸균 기법을 이용하여 수행되어야하고, G10 컬럼 멸균 생물학적 후드에 설치되어야한다.

1. 사전 WARM은 세포 배양 미디어 수조에서 37 ° C까지 (~ 30 ml의 컬럼 당). 10 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 제거하고 플런저를 폐기합니다. 주사기에 유리 섬유를 추가합니다.
2. 핀셋을 사용하여, 얇은 느슨한 가닥에 유리 섬유를 따로 빼냅니다. 주사기의 2/3이 유리 털실로 가득 채운 때까지 주사기로 가볍게 포장 유리 섬유의 여러 레이어를 추가합니다.
   주 : 유리솜은 백혈병 세포 콜렉션을 오염시키는 이른바 G10 입자를 방지하는 것이 중요하다. 확실히 유리 섬유는 G10 입자를 지원하기에 충분 포장,하지만 너무 조밀하게 열을 통해 미디어의 흐름을 차단하는 포장되지되어 있는지 확인합니다.
3. 폐쇄 위치에서 주사기의 끝 부분에 1 방향 스톱 콕을 부착합니다.
4. 링 클램프 주사기 열 때문에 50 ML 원뿔 튜브 (포집 관)는 꼭지 아래에 배치 할 수 있습니다 충분 서있다. 주사기 열에서 수집 튜브를 놓습니다.
5. 10 ML의 피펫의 상단에 열을 PBS에 재현 탁, G10 입자를 추가 드롭 현명한 사용유리솜. 유리면 위에 G10 입자 형태 (주사기 눈금으로 측정) ~ 2 mL의 펠렛까지 G10 입자를 계속 추가.
6. 미리 예열 미디어와 G10의 열 평형.
   1. 열을 미리 예열 미디어 2 ML을 추가합니다. 그래서 오픈 스톱 콕 밸브는 천천히 미디어 드롭 현명한 열 밖으로 흐른다.
   2. 미리 예열 미디어 10 ㎖의 총 때까지 단계를 반복 3.6.1은 열 가로 질러왔다.
      참고 : G10 입자 포집 관에서를 통해 흐름에서 볼, 중 1)보다 G10 입자를 추가하는 경우 추가 G10 입자가 열에서 탈출하지 확인한 ~ 2 ml의 펠렛을 유지하거나 2)하지 않는 한 반복과 열을 교체 3.4-3.6.1 단계를 반복합니다.
   3. 열에서 미리 예열 미디어 빼낸 후, 꼭지를 닫고 통해 흐름을 수집 튜브를 폐기합니다. 열에서 새 컬렉션 튜브를 추가합니다. 열 매체 + 세포 혼합액로드 될 준비가되어있다.
      참고 : 열즉시 사용 및 건조 허용되지해야합니다.

4. 공동 문화 내에서 3 부분 집단을 분리

1. 서스펜션 (S) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
   1. 공동 배양 접시에서 대기음 미디어 피펫 부드럽게 플레이트를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 백혈병 세포를 포함하는 미디어를 수집하기 위해 같은 미디어를 신청 다시. 수집 백혈병 세포 S 아군이다.
2. 단계 밝은 (PB) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
   1. 공동 배양 접시에 다시 10 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 부착 백혈병 세포 만 부착 BMSC / OB 성분을 제거하기 어려운 충분하지를 제거하기 위해 위 아래로 약 5 시간을 추가 한 미디어를 피펫 팅에 의해 적극적으로 씻어.
   2. 피펫 기음과 15 ML 원뿔 튜브 미디어를 수집합니다. 수집 된 세포는 PB 아군이다.
3. 단계 어둡게 (PD) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
   1. 렘 1 ml의 PBS와 린스 판비켜 남은 용지. 5 분 동안 37 ° C 배양기에 3 ㎖ 트립신과 장소를 Trypsinize 공동 문화 판.
   2. 부착 BMSC / OB을 제거하기 위해 플레이트의 측면을 누릅니다 부드럽게 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
   3. 떨어져 큰 세포 집합체을 깰 1 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 및 피펫 위아래로 3-5 시간을 추가합니다.
   4. 15 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 수집합니다. 이러한 세포뿐만 BMSC / OB로 미정 PD 아군이다.
4. 원심 분리기 3 7 분 동안 400 XG에서 소집단을입니다. 기음과 폐기 뜨는는 개별적으로 1 ml의 사전 예열 매체에 펠렛을 재현 탁. 세포는 G10 컬럼에로드 할 준비가 된 것입니다.

G10 열 상 (5)로드 공동 배양 세포

참고 : 확인 꼭지를 확인 완전히 G10 컬럼 미디어 포함하는 셀을 추가하기 전에 폐쇄된다. 또한, 각각의 하위 집단은부터 소개하기 위해 그렇게하지 ​​별도의 G10 컬럼을 통해 실행해야합니다다운 스트림 분석 인구 사이의 바이어스를 전자.

1. 1,000 μL 피펫을 사용하여, 드롭 현명한 별도의 G10 컬럼에 미리 예열 미디어에서 각 셀의 모집단 1 ㎖를 추가합니다. 세포를 포함하는 미디어가 상단이나 G10 펠릿 내에 남아 있는지 확인합니다. 세포가 실온에서 20 분 동안 G10 펠릿에 품어 할 수 있습니다.
   참고 : 조절판은 배양 기간 동안 폐쇄 남아있다.

6. G10 열에서 백혈병 세포를 수집

1. 각 G10 컬럼에 1-3 ml의 사전 예열 매체를 추가합니다. 오픈 스톱 콕 밸브와 미디어 천천히 열을 적가 종료 할 수 있습니다.
   참고 : 열 또는 열에서 씻고 고립 된 백혈병 세포를 오염시킬 수 BMSC / OB를 포함하는 G10 펠릿에서 느린 유속을 유지하는 것이 중요하다.
2. 15 ~ 20 ML의 총까지 G10 컬럼 작은 단위 (1-2 ml)에 미리 예열 미디어를 계속 추가 칼럼을 통해 실행하고 수집하고 있습니다. 닫기 스톱 콕 버지니아LVE와 모자 포집 관.
   참고 : G10 입자 펠릿 수집 튜브의 하단에 볼 경우, 부드럽게 G10 입자 펠릿 그대로 새로운 튜브로 전송 떠나는 튜브에서 용지를 제거합니다.
3. 원심 분리기는 실온에서 7 분 동안 400 XG에 미디어를 모았다. 상층 액을 제거하고 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁.
4. 셀은 BMSC 또는 OB 오염없는 백혈병 세포의 순수 인구이며 사용자 재량 하류 어플리케이션에 적용 할 준비가되어있다.
   참고 : G10 컬럼을 통해 세포를 통과 할 때 백혈병 세포 생존 능력은 변경되지 않은 상태로 유지해야합니다.

결과

이 공동 문화 모델의 성공적인 설치 및 문화. 부착 BMSC 또는 OB 단층에 비해 백혈병 세포의 3 개체군의 설립 결과 1 BMSC 단일 층으로 시드 ALL 세포가 초기에 중단의 같은 단 하나의 인구를 표시하는 방법을 보여줍니다 것이다 백혈병 세포. 백혈병 세포는 백혈병 세포의 개체군 3 공간을 형성하도록 상호 작용 BMSC 사일의 과정 ((현탁 S) 상 밝은 (PB) 및 위상 딤 (PD)). 종양 세포의 3 소집단 일반적 BMSC 또는 OB와 공동 - 배양 후 24 시간 후에 볼 수 있지만, 우리는 백혈병 세포 및 BMSC / OB 셀 간의 전체 역학과 상호 작용이 일어날 수 있도록 4 일 동안 세포를 배양 된 공동 어떤 조작이나 실험을하기 전에 장소 (그림 1) 소요됩니다. 또한, 우리는 꿀벌이있는 골수 생리학 요점을 되풀이 5 %의 산소 장력에서 공동 배양을 유지 유의여기...

토론

질병의 재발에 기여 최소 잔존 질환 (MRD)는 모든 공격 내화물의 치료에서 주요 임상 과제이며, 또한, 다른 혈액 학적 악성 종양의 호스트로 계속된다. 골수 미세 환경 모두에서 재발 ^-3,8-의 일반적인 위치이다. 이와 같이, 골수 미세 환경을 모델링 모델 요법 노광 중에 백혈병 종양 세포 생존 및 MRD의 유지에 관한 가설을 테스트하기 위해 중요한 도구이다. 마우스 모델은 약물 효능에 관한 시험 질문에 대한 황금 표준을 정의하는 동안, 2D 공동 문화는 백혈병 세포 생존의 뼈 내일의 미세 환경 지원과 관련 테스트 가설 및 약물 전략에 대한 비용 효과적인 방법되고 있습니다. 많은 그룹은 BMSC와 백혈병 세포의 공동 문화를 보여 주었다 또는 화학 요법 제 ^{9,10,12-14,19-21에} 도전 할 때 OB는 생존 이점을 제공한다. 작업 모델링 일반 미숙 한 CD34 + HEMA중간 엽 줄기 세포 (MSC)와 공동으로 문화 topoietic 세포는 조혈 세포는 조혈 세포 ^{(22, ...}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
G10 세파 덱스 비즈	시그마	G10120	원고에서 젤 유형 10 가교 덱 스트란 입자
10ml 멸균 주사기	BD	309604
유리 양모	파이렉스	3950
1 방향 스톱 콕	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml 원뿔형 원심분리기 튜브	World Wide Medical Products	41021039	수집 튜브로 사용
15 ml 원뿔형 원심분리기 튜브	World Wide Medical Products	41021037	세포 수집에 사용
태아 소 혈청	시그마	F6178
0.05% Trypsin	미디어테크, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm 세포 배양 접시	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	인간 조골세포 배지용
RPMI 1640 미디어	Mediatech, Inc.	15-040	종양 매체 준비용
세포주
부착 세포:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast는 공급업체에 따라 배양되었습니다. s 권장 사항.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		비식별화된 원발성 인간 백혈병 및 골수 기질 세포(BMSC)는 Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC) Biospecimen Processing Core 및 West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank에서 제공했습니다. BMSC 배양은 앞서 기술한 바와 같이 확립되었다 (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 세포는 공급자에 따라 배양하였다. 의 권장 사항 및 권장 미디어.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1을 공급자에 따라 배양하였다. 의 권장 사항 및 권장 미디어.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. 에토포사이드에 의한 골수 기질 세포 기능의 붕괴. Biol 혈액 골수 이식 J am Soc 혈액 골수 이식. 1997년 8월; 3(3):122–32.