단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

Summary

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

Abstract

이 프로토콜은 방법은 정량적 수행하기 위해 제공, 현장에서 단일 셀 혈통 사양을 연구하는 단백질 발현 분석 마우스 착상 전 배아에서. 배아 수집, 면역, 공 초점 현미경 영상 및 이미지 세분화 및 분석에 필요한 절차를 설명한다. 이 방법은 여러 핵 마커의 발현 및 공간 (XYZ)의 정량은 태아의 모든 셀의 좌표를 허용한다. 그것은 MINS, 특히 착상 전 배아 및 배아 줄기 세포 (ESC) 식민지의 공 초점 이미지의 분석을 위해 개발 한 이미지 분할 소프트웨어 툴을 활용합니다. 분 X, Y 및 Z 차원 걸쳐 자율 핵 세그멘테이션을 수행하고, 최소한의 사용자 입력을 모든 채널에 대해 3 차원 공간에서 셀의 위치에 대한 정보뿐만 아니라, 핵 형광 레벨을 생성한다. 이 프로토콜은 화상의 분석을 위해 최적화되어 있지만착상 전 단계의 마우스 배아, 그것은 쉽게 양호한 신호 대 잡음비 및 여기서 높은 핵 밀도 (이미지 분할에 장애물 포즈 등., 배아 줄기 세포의 발현 분석을 나타내는 임의의 다른 시료의 분석 (ESC에 적용 할 수있다 ) 식민지 문화의 셀, 다른 종 또는 단계 등)의 배아를 차별화.

Introduction

마우스 착상 전 배아 세포 운명 명세서 및 포유 동물에서 상피 새로이 연구 출현 생체 능성의 유지뿐만 아니라, 모델을 학습하는 패러다임이다. 두 배외 (extraembryonic) 계통, trophectoderm (TE)와 - 대부분의 체세포 조직 및 생식 세포에 상승을 제공 - 포유류 개발의 착상 전 단계는 배반포, 즉 만능 epiblast을 구성하는 세 가지 세포 계통의 확립에 최선을 다하고 있습니다 원시 내배엽 (예정) (그림 1A) ^1,2. 이 프로토콜은, (2), 관심의 단백질을 라벨 면역 형광을 수행 (3) Z-절편 기능과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 마운트 전체 수행 (1) 수확 및 수정 착상 전 단계 마우스 배아에 대한 절차를 설명 (4) 공 초점 이미지와 이후의 양적 이미지 분석의 핵 분할을 수행합니다. 이 파이프 라인은 t 수 있습니다그 자리에서 세포의 개체군을 특성화 셀 아이덴티티 할당을 위해 단백질 수준을 측정 바이어스. 데이터 분석 (도 1b)에 배아 컬렉션 (일반적으로 10 마우스 배아까지) 한 쓰레기 4 일 -이 프로토콜은 적은 3로 수행 될 수있다. 여러 리터의​​ 동시 분석에 따라서 프로토콜의 전체 길이를 연장하는, 촬상 데이터 분석 시간 부담을 증가시킨다.

착상 전 단계 마우스 배아는 작은 크기와 진부한 형태 ³ 제공, 단일 셀 해상도 세포 과정의 토토 영상에 적합하다, 실험적으로 다루기 쉬운 시스템입니다. 배아의 통계적으로 중요한 수의 편향, 시스템 레벨 분석을 수행하는, 자동화 된 정량 분석​​ 파이프 바람직하다. 그러나, 내부 세포괴 높은 핵 밀도의 배반포 (ICM)에 의한 ( 도 1a,도 2D), 종래의 이미지 분할 플랫폼은 자동화 또는 반 자동화 된 작업 흐름을 확립하기에 충분한 정확도를 제공하지 못한다. 한편, 수동 세분화 정확하면서 세포 및 배아 큰 집단의 처리를 허용하지 않으며, 셀 아이덴티티 재현성 편향 판에 적합 - 발달 단계를 연구 할 때 특히 중요 여기서 마커 패턴 표현은 완전히 (예를 들면, 인구에 걸쳐 진 분포를 나타내지 않는다)가 해결되지. 최소한의 사용자 입력 ^4-8을 필요로하는 동안 우리는 최근에, 마우스 착상 전 단계의 배아과 높은 정확도를 달성 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)에 맞춰 이미지 분할 방법을 개발하고 검증했다.

여기에 제시된 분석 파이프 라인은 MATLAB 기반의 영상 분할 도구 모듈 형 인터랙티브 핵 분할 (분) ^(4)를 중심으로 돌아 가지. MINS 피사용자는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) (표 1) ^(4)를 이용하여, 이미지 속성의 최소 수를 설정 한 후 촛점 Z-스택 대규모 배치에서 자율 핵 분할 erforms. 이 파이프 라인은 모두 야생형 단백질의 발현 및 세포 국산화 높은 처리량 데이터의 생성 효율이 입증 된 실험적 치료 및 유전자 배아는 ESC ^5-7 변성. 본 프로토콜에서, 우리는 착상 전 단계의 배아 이미지의 분할에 MINS의 응용 프로그램을 설명합니다. 는 ESC에 MINS 성능의 예를 들어 ^4,7 참조하십시오. 자동화 핵 분할 단계는 크게 공간 형광 세기 측정은 배아 세포 아이덴티티 바이어스 결정 및 유전자 발현 도메인 및 셀 위치의 3 차원지도를 생성 할 수있는 반면 (도를 셀 구분 처리시의 부담을 줄일 1C ). 또한,이 워크 플로의 확장 성을 실험적으로 처리 된 배아, 또는 다른 유전 적 배경 ^5,6의 배아의 큰 집단을 통해 개별 새끼의 분석은 적용한다. 분 (소프트웨어 MATLAB 라이센스가 필요합니다) http://katlab-tools.org에서 자유롭게 사용할 수 있습니다.

현재까지 개발 된 어떤 접근 방식은 마우스 착상 전 배아의 단백질 발현 및 세포 현지화에 같은 깊이있는 데이터의 생성을 허용하지 않습니다. 모든 시도는 지금까지 이러한 유형의 데이터를 정량화 수동 판정 다른 집단에 대한 세포 수를 정량 배아 (전체가 수동으로, 또는 소프트웨어 보조 식) ^9-19로 제한되어왔다. (MINS 소프트웨어를 포함)이 접근 방식에 맞춰 마우스 착상 전 배아와는 ESC에서 테스트되었습니다; 그럼에도 불구하고 높은 핵 밀도가 다른 시스템의 성능은 아직 검증되지 않은 있지만, 상당 할 것으로 예상된다.

Protocol

윤리 문 : 모든 동물의 작업, 사육, 번식과 희생을 포함하여이 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 프로토콜 번호 03-12-017에 의해 승인되었다.

1. 배아 컬렉션

모든 동물의 작업은 기관 및 지방 자치 단체의 승인을 받아야합니다, 지역 및 기관 규칙을 준수 :합니다.

1. 원하는 유전자형의 비옥 한 스터드 남성과 처녀 암컷 마우스 메이트.
   참고 : estral주기의 발정 단계에서 여성을 선택, 자연 교배를 설정 원하는 날짜에 교미의 기회를 증가합니다. 과배란을 유도하는 경우, ^(20)에 기술 된 프로토콜을 참조하십시오.
2. 무딘 프로브를 사용하여 아침에 질 플러그의 존재를 확인합니다. 교미 플러그가 하루 종일 손실로 이상적으로, 정오 (오후 12시) 전에이 작업을 수행. NOO 고려질 플러그 배아 일 (E) 0.5 N의 검출.
3. 원하는 날짜와 배아 발달의 시간에, M2 또는 RT로 세척 들고 매체 (FHM) 또는, 바람직하게는, 37 ºC을 따뜻하게. 참고 : 어느 M2 또는 FHM이 세척 및 취급 배아를 사용할 수 있습니다. 때 사용, 4 ºC에서 이러한 미디어를 저장할 수 없습니다. 자궁 각에 대한 매체의 1 ~ 2 mL의 사용을 추정한다.
4. 냉동 해동 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 일부 신규 용액을 준비한다. 4 웰 플레이트의 웰 당 4 % PFA 용액 500 μl를 추정한다. 4 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 쓰레기를 수정합니다. 참고 : 또는 96 웰 플레이트의 수정 및 배아 저장하는데 사용될 수있다. 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 100 PFA 용액 웰 당 μL를 사용한다.
5. 끝에서 모세관 끝을 그리는 불꽃을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫을 당깁니다.
6. 지역 및 기관 규정에, 또는 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ 흡입에 의해 여성을 희생. 그것은 종종 desirabl입니다전자는 자궁 전위에 의해 동물의 안락사를 확인합니다.
7. 헤어 발산을 최소화하고 내장이 노출되도록 제 피부를 통해 연속적 체벽 (복막)을 통하여 복부 절개를 수행하기 위해 70 % 에탄올로 동물의 배를 분무.
   참고 : 다음 단계는 E3.25 및 E4.5 (그림 1A) 사이의 모든 단계에서 임신 여성 마우스의 자궁에서 포배를 수집하는 절차를 설명합니다. 이전 E3.25보다 착상 전 배아의 컬렉션 프로토콜의 경우, ^20을 참조하십시오.
8. 자궁를 찾아 동물에서 분리합니다. 포셉 한 쌍의 자궁의 자궁 끝을 잡고, 자궁 경부의 실수로 모두 자궁 뿔을 스트레칭 부드럽게 잡아 당깁니다.
9. 자궁 벽을 관통하지 않도록주의하면서 자궁에서 지방 낸다. 여전히 동물의 신체에 부착하면서 자궁 뻗어 수 이것은, 제거시에 용이하게 수행 될 수있다. 대안 적으로, 그것을RT PBS에서 해부 현미경 하에서 나중에 수행 될 수있다. 자궁의 해부에 대한 자세한 프로토콜을 참조 프로토콜 5 8 ²⁰
10. 난관 위에 잘라, 난소 아래 페트리 접시에 전체 자궁, 장소를 해제하고 PBS로 커버.
    참고 :이 단계는 후속 배반포 수확을 용이하게 자궁에서 여분의 혈액이나 기타 이물질의 세척을 할 수 있습니다.
11. 자궁 경부의 양측에 기단을 절단 경부 폐기로 구분 양쪽 자궁 뿔. 그들 (그림 1A)를 연결하는 지협 아래 절단하여 자궁 각 난관을 분리합니다. 배아 수집 및 조작을위한 조작 매체 (M2 또는 FHM 중 하나)의 하락에 두 뿔을 전송합니다.
12. 해부 현미경, 자궁 밖으로 0.5 강제로 매체에 플러시 배반포 - 자궁 경부 오프닝에서 각각의 자궁을 통해 M2 또는 FHM 1 ㎖를. (1)을 사용하여피하 바늘 ML의 주사기. 참고 :이 중요하지 않지만 바늘, 자궁 찢어지지 않도록 제출 돌을 사용하여 무디게 할 수 있습니다. 자궁 세척에 대한 상세도 ^(21)에서 찾을 수 있습니다.
13. 매체의 드롭에 흩어져되는 배반포를 찾아, 해부 현미경을 사용. 배반포는 세척 후에는 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 2 분 - 최대 1 허용합니다. 모세관 끝으로 입 제어, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 모든 배반포를 수집하고 미디어의 새로운 드롭으로 전송합니다.
14. 신선한 M2 또는 FHM의 3 방울 - (2)를 통해 이동하여 배반포를 씻어. 한 번에 10 포배 - 5 그룹으로 배아를 이동합니다.
    참고 : 프로세스 속도 것이다 한번에 큰 그룹 이동뿐만 아니라 실수 많은 배아 손실의 가능성을 증가시킬 것이다. 배아 조작 및 전송을 연습, 입 제어 피펫의 사용에 훈련받지 않은 경우 나 이전에 고려되어야한다실험 eginning.
15. 간단히 산성 타이로드의 솔루션을 세척하여 부화 배반포로부터 투명대 (ZP) (일반적으로
16. 무 결함 배반포를 처리 할 때 유리 및 플라스틱 표면에 쉽게 부착으로,주의하십시오. 조작 매체 부착 방지 소 혈청 알부민 (BSA)의 4 ㎎ / ㎖를 포함하지만, 산 타이로드 나 PBS 할 따라서, 손상 또는 배아 손실의 위험을 감소시키는 것은 2 개 이상의 픽업하지 아니 - 5 무 결함 포배를 한번에 BSA없는 또는 무 혈청 PBS 또는 산의 타이로드대로 조작 할 때.
    주 : 대안 적으로, 코팅은 사용하기 전에, 1 % BSA로 유리 피펫을 유리 표면에 부착 된 배아의 감소.

코트 각 웰의 바닥1 % 아가의 얇은 층으로 4- 웰 조직 배양 접시에, 0.9 %의 NaCl이 플라스틱에 부착 배아를 방지 할 수있다. 또한, 4 밀리그램 / PBS (PBS-BSA)에 BSA ml의를 추가합니다.

RT PBS (또는 PBS-BSA)의 500 μL로 코팅 된 4-잘 조직 배양 접시 하나 잘 PBS에서 4 % PFA의 또 다른 잘 500 μl를 입력합니다.

RT PBS에서 배반포를 씻어 RT에서 10 분 동안 PBS에 4 % PFA에 고정합니다. 고정 후 PBS (또는 PBS-BSA)에 전송합니다.

배아 즉시 처리하지 않을 경우 (샘플의 탈수 선도) 증발을 방지 4 ºC에서 플레이트를 저장 미네랄 오일 층과 배아를 함유 PBS 커버.
주의 : 다른 정착 방법 및 시간은 실험에 따라 사용될 수 있으며, 관심의 항원 및 항체를 사용한다. 실험은 동등한 결과 염색 후의 비교를 용이하게하기 위해 전체에 원하는 어느 방법은 일관성.
참고 : 일시 정지포인트 : 배아는 다음 단계로 진행하기 전에 몇 주까지를 위해 PBS에 4 ºC에 저장 될 수있다. PBS는 멸균 확인 및 / 또는 100 U / ㎖를 추가 페니실린 + 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) (PBS-BSA를 사용하여 특히) 세균 오염을 방지 스토리지를 연장 기대하는 경우.

2. 면역 형광

1. 이전 테스트 및 전체 마운트 면역에 대한 강력한 것으로 입증 된 어떤 프로토콜을 사용하여 면역을 수행합니다. 참고 : 우리는 ^{22와 11에} 기술을 사용하는 것이 좋습니다. 본 기사에서는 전자는 설명한다. 등가 실험 염색 결과의 비교를 용이하게 걸쳐 원하는 어느 방법은 일관성.
2. 면역 프로토콜의 일련의 단계를 수행하기 위해 융통성 비닐, 분명, U 바닥 96 웰 플레이트를 사용한다. 50도 각을 채우기 - 용액 100 ㎕를 하나의 솔루션에서 배아를 이동L 모양의 입 피펫을 사용하여 다른. 이 방법은 시약의 사용을 최소화하는 단계 및 추적뿐만 아니라 여러 실험군의 병렬 염색 용이 참고.
   1. 선택적 : 코트 1 % 한천의 얇은 층과 웰의 바닥 0.9 %의 NaCl이 플라스틱으로 태아의 밀착성을 방지 할 수있다. 면역 형광 솔루션에 BSA를 추가하지 마십시오.
3. PBX (PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100)을 준비한다. 여러 면역 형광 실험의 성능을 기대하는 경우, 실험 사이에 4 ºC에서 PBX 및 저장 50 ㎖를 준비합니다.
4. permeabilization 용액 (0.5 % 트리톤 X-100의 PBS 100MM 글리신)을 준비한다. 1 ㎖ (또는 중 량 필요) 각 실험에 대한 신선한 permeabilization 솔루션을합니다.
5. 차단 솔루션 (2 % 말 혈청 (HS) 또는 20 % 소 태아 혈청 PBS에서 펜 연쇄상 구균과 (FBS))를 준비합니다. 실험 사이에 4 ºC에서 10 ml의 저장을 준비합니다.
   1. 차이는 사이에 관찰되지 않았다 중혈청 형 그러나 동등한 실험에 사용 용액을 차단의 선택에 일관성.
6. PBX에서 RT에서 5 분 (~ 100 μL) 고정 배아를 씻어.
7. permeabilization 용액에 실온에서 5 분 (~ 100 μL)에 대한 배아를 Permeabilize 하시려면.
8. PBX에서 RT에서 5 분 (~ 100 μL)에 대한 배아를 씻어.
9. 차단 솔루션의 ~ 100 μL에 30 분 실온에서 시간 1에 대한 블록 배아. 증발을 방지 또는 가습 챔버 내에서 유지 미네랄 오일 층이 용액을 커버.
   참고 : 배아 O까지 / 눈에 띄는 개선 또는 손해없이 4 ºC에서 N 기간은 30 분 차단 단계에 비해 차단 될 수있다.
10. 차 항체 4 ºC에서 배아 O / N을 품어 / 항체 솔루션 (~ 100 μl를) 차단에 희석. 증발을 방지 또는 가습 챔버 내에서 유지 미네랄 오일 층이 용액을 커버.
    1. 사전에 각 차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다. D 참조항체의 숫자의 테스트를 희석에 대한 iscussion 및 재료 섹션을 참조하십시오.
11. O / N 배양 한 후, 배아는 PBX에서 RT에서 5 분 각 (~ 100 μL)에 대해 3 배 씻어.
12. 차단 솔루션의 ~ 100 μL에 30 분 실온에서 시간 1에 대한 블록 배아. 증발을 방지 또는 가습 챔버 내에서 유지 미네랄 오일 층이 용액을 커버.
13. 솔루션을 차단 ~ 100 ㎕를 4 μg의 / ㎖로 희석 차 항체 / 항체 4 ºC에서 1 시간 2에 대한 배아를 품어. 증발을 방지 또는 가습 챔버 내에서 유지 미네랄 오일 층이 용액을 커버.
14. 씻어 배아는 PBX에 실온에서 각각 5 분 동안 2 배.
15. 선호하는 DNA 얼룩에 배아를 이동합니다. 훽스트 33342를 사용하는 경우, PBS에서 5 μg의 / ㎖로 희석. 증발을 방지 또는 가습 챔버 내에서 유지 미네랄 오일 층이 용액을 커버.
    참고 점을 일시 정지 : 배아 즉시 묘화되지 않는 경우,이 U에 대해 유지 될 수있다핵 염색 액에서 몇 주에 페이지. 이 경우, PBS는 멸균 확인 및 / 또는 세균의 성장 및 오염을 방지하기 위해 펜 연쇄상 또는 아 지드 화 나트륨을 추가한다.

3. 공 촛점 이미징

참고 : 공 초점 현미경 개별 구성 대신에, 시스템 및 소프트웨어를 조정할 특정 획득 매개 변수를 필요로한다. 그러나, 다음 섹션은이 특정 설치에 적용되어야 따르는 일반적인 규칙의 세트를 제공한다.

1. 미세 입 피펫을 사용하여 PBS 또는 35mm 유리 바닥 접시의 유리 표면에 핵 얼룩 솔루션의 microdrops을하고 미네랄 오일 커버. 대안으로, 배아의 손상을 방지하고 유리 현미경 슬라이드와 커버 실리콘 분리기와 일반 커버 슬립을 사용합니다. 참고 : 일반 커버 슬립을 사용하는 경우, 태아가 이후에 다시 위치 또는 유전자형에 대한 복구 할 수 없습니다, 따라서 저희는 유리 바닥의 사용을 권장그릇.
2. 지역 microdrops 배아 바람직 유리면 ICM 캐비티 축에 평행으로 일관된 방식으로 배열. 현미경 홀더에 접시를 설정합니다. 참고 : 공 초점 레이저 주사 현미경 사진에서 얻어진 형광 강도의 Z 축과 연관된 손실을 겪는다. 따라서, 상기 구성의 일관성 다른 배아 등가 영역간 강도를 비교하는 것이 중요하다.
3. 유전자 발현을 변경할 수 치료의 모든 종류의 대상이되지 않은 야생형 배아를 사용하여 참조 매개 변수를 설정합니다.
   1. MINS 툴 ^(4)을 이용하여 정확한 분할을 용이하게 데이터를 얻기 위해서, 고배율 대물 렌즈 (즉, 40 배 이상)을 사용하여 이미지를 획득.
      참고 : 분 사용 분할에 적합한 해상도의 이미지를 얻을 수 없습니다 20X 목적에 디지털 줌을 사용. 그것이 있어야로 하나는, 목적의 작동 거리 (WD)을주의해야한다전체 배반포에 걸쳐 Z - 스택, 이렇게 긴 WD의 취득을 허용하기에 충분 (~ 130-150 μm의) 목적은 일반적으로 필요하다. 도 2에 도시 된 이미지 - (4) 210 ㎛의 작업 거리와 40X / 1.30 NA 오일 침지 목적을 이용한 획득 하였다.
   2. 형광 표백없이 강한 신호 대 잡음비를 제공하는 낮은 레이저 출력을 사용한다.
   3. 게인을 조정하고 시료의 과도한 노출을하지 않고 넓은 동적 범위를 얻기 위해 오프셋 (offset)입니다. 이미지를 노출시키는 대부분을 커버 또는 전체 그레이 스케일 범위가 이미지 사이의 세기의 작은 차이의 검출을 용이하게한다 걸쳐.
   4. Z 축 해상도 MINS와 정확한 분할에 중요하기 때문에, 작은 (1 ㎛) Z-단계를 사용합니다.
      주 : XY 치수 핵 세그멘테이션 프로세스 만 이미지 파일의 크기에 영향을주지 않는다. 일반적으로, 512 X 512 픽셀 compromi없이 출판 품질의 이미지에 대한 충분한 XY 해상도입니다하드 드라이브 공간을 노래.
   5. 중요한 단계 : 샘플을 비교할 수 있도록 내부와 동일한 실험 촬상 세션 일관된 파라미터 촬상 것.
4. 배아의 배치를 이미징 :
   1. 하나의 세션에서 이미지 일관성 그룹 (새끼, 실험) 가능하면.
   2. 같은 실험의 복제에 대한 내 및 이미징 세션에 걸쳐 일관성있는 매개 변수를 유지합니다.
   3. (전체 Z 축)을 통해 이미지 배아는 모든 세포를 촬영합니다.
      주 : 필요한 경우 ^23에 기재된 바와 같이, 배아 유전자형 이미징 후에 수행 될 수있다. 중첩 PCR에 대한 필요성은 경험적으로 결정되어야하고 분석하는 궤적과 사용 된 프라이머에 따라 달라질 것이다.
5. 소급 이미지에 배아를 일치시킬 수 있는지 확인하십시오.

4. 이미지 분석 및 데이터 사전 처리

1. 다운로드 및 HTTP에서 MINS ^4를 설치 : // katlab-tools.org (MATLAB 라이센스 필요).
2. 이미지 분할을 수행합니다 :
   1. 공 촛점 이미지를로드 또는 하드 드라이브에서 쌓으 핵 세그먼트에게 화상을 검출하도록 MINS의 그래픽 유저 인터페이스 (GUI)를 따른다. 현미경 (.lsm, .lif, .oif 등)에 의해 생성 된 원시 데이터의 전체 Z - 스택을로드합니다. http://katlab-tools.org ^4에 발견 된 각 단계에 대한 자세한 내용과 지침은 표 2를 참조하십시오. 완료되면, 해당 '보기'버튼을 클릭하여 각 단계의 결과를 볼 수 있습니다. 버튼 위에 노란색 태그는 녹색 태그 작업 완료 표시, 공정 작업을 나타냅니다.
      참고 : 분 현재 시퀀스 또는 다중 위치 파일 .TIFF, .czi 파일을 지원하지 않습니다 - 각 Z-스택이 독립적 인 파​​일이어야합니다.
   2. 양호한 분할 결과, 다른 배아 또는 새끼에 직접 사용될 수 있도록 파이프 라인을 만들어 저장한다.
3. 배치 모드 분할 :
   참고 :시를ngle 파일들은 개별적으로 세그먼트 화 될 수있다. 그러나, 쓰레기 또는 실험에서 배아는 일반적으로 비교 단계의 것을 감안 분 감독없이 그룹에 하나의 이미지에 대해 만든 분할 파이프 라인을 적용 할 수 있습니다.
   1. 배치 모드 실행 메뉴에서 클릭 '파일 추가'모든 파일을 한 번에 처리 할 수​​로드합니다. 주의 : 다른 소스 파일 세그먼트 큐에 추가 될 수있다.
   2. '배치 모드 실행을 시작합니다'하고 파일을 처리 할 수​​있는 소프트웨어에 대한 시간을 허용 클릭합니다. 참고 : 분할 출력이 원래 파일이있는 동일한 디렉토리에 저장됩니다.
4. 분할 평가 및 수동 보정
   주 : 매우 높은 정확도 (> 85 %)로 MINS 세그먼트 이미지 그러나 염색 이미지 품질뿐만 아니라, 배아 단계는 MINS 성능에 영향을 미칠 수있다. 일반적으로, 배아 내의 높은 핵 밀도는 가능성 세그멘테이션 오류 PLAC 걸릴전자 (그림 2 차원, 3). 따라서, 분할 정밀도를 각 샘플에 대해 평가되어야하고 필요한 경우 수동으로 수정. 두 가지 유형의 오류가 일반적으로 발생 분할 오버 및 언더 분할.
   1. 지나치게 세분화 해결 :
      1. 오 탐지 식별 - 그대로 핵없는 세포 사멸 소포 (그림 3A의 A, B, D, 별표) 또는 다른 요소를하지만, 이는 MINS에 의해 같은 확인되었을 수 있습니다.
         주 : 일반적 가양 실제 핵보다 작은 크기를 가지며, 대부분의 경우에, 쉽게 식별 할 스프레드 시트에 정렬 할 수있다. 작은, 그러나 유효한 분할 된 볼륨 (그림 3A의 B, 화살촉)의 결과로, 핵은 부분적으로 만 분할 할 수있다 위해 흔히 그러나, 육안 검사가 강력하게 추천합니다.
      2. *의 statistics.csv 파일에서 오탐 (false positive)에 해당하는 기록을 삭제합니다. 원래 * 통계를 보존.CSV 나중에 참조 할 수 있도록 편집 그것의 사본을 제출.
      3. 분할 오버 2 이상의 핵 (도 3a의 C 화살표 화살촉)로 제시하거나 그 강도 레벨을 평균하여 기록을 병합하거나 유사한 경우, 그 셀에 대한 기록을 유지하고 폐기 핵 된 경우 휴식.
   2. 아래-분할 해결 :
      1. MINS 두 개 이상의 핵 사이의 경계를 검출하는 데 실패하고, 결과적으로 하나의 핵을 분할했다 식별 이벤트 (도 3a의 화살표 (D) 및도 3b). 주 : 측정 수치가 병합 잘못되었을 셀 평균 것이고, 다른 계통에있는 속할 수 이것은 단백질 수준을 정량화하기 위해, 정확한 세포 수에 대한 문제를 야기하지만 더 중요한.
      2. MINS이 완전히 핵을 감지하지 못한 이벤트를 식별합니다.
      3. 이러한 경우 (4.4.2.1 및 4.4.2.2)에서, F의 평균 회색 수준을 측정또는 이러한 각 ImageJ에 (http://imagej.nih.gov/ij/)와 같은 다른 도구를 사용하여 부족 또는 취소 분할 된 셀 (들)의 채널 및 올바른 수준 잘못된 기록을 교체합니다. 나중에 참조 할 수 있도록 원래 * statistics.csv 파일을 보존하고의 사본을 편집 할 수 있습니다. ImageJ에를 사용하여이 작업을 수행하려면 다음 단계를 수행하십시오 :
         1. 가상 스택 ( '파일'> '가져 오기'> 'TIFF 가상 스택 ...')로 MINS에 의해 생성 된 해당 * overlaid.tiff 파일을 ImageJ에의 관련 멀티 채널 스택을 열고 가져옵니다.
         2. 부족 또는 취소 세그먼트 핵의 중간 섹션을 찾습니다.
         3. 자유 선택 도구를 사용하면 DNA 얼룩 채널의 부족 또는 취소 세그먼트 핵의 경계를 설명합니다.
         4. 를 눌러 CRL + M (Macintosh의 경우 Cmd + M) 또는 분석 메뉴로 이동하여 '측정'을 선택합니다. 이 작업은 설명 된 영역에 대한 평균 회색 값을 기록하고 새 창에 표시됩니다. > '분석'으로 이동9; 설정 측정 ... '하고 있는지 확인은'선택 '회색 값을 의미한다. 다른 매개 변수를 선택 측정 할 수 있습니다.
         5. 단계 4.4.2.3.3에 설명 된 같은 지역을 사용하여, 관심있는 형광 채널 각각에 대해 측정을 반복한다. 결과는 측정 '결과'창에서 이전에 추가됩니다.
         6. *의 statistics.csv 파일에 잘못된 기록을 대체 얻어진 측정치를 사용한다. 핵이 분할되지 않은 경우, 새로운 행을 삽입 그것에게 새로운 셀 ID를 할당하고 각 채널에 해당하는 열에서 ImageJ에에서 얻어진 값을 소개합니다. 이 셀은 공간 좌표 (X, Y 및 Z 값)가 없다. 핵이 undersegmented 된 경우, 해당 행을 복제 각각의 새로운 셀에 다른 셀 ID를 할당하고 해당 열에서 ImageJ에에서 얻어진 값을 소개합니다. 이 경우에, 두 셀 공간 좌표를 공유한다.
            주 : 공간 분포가 분석 될 경우, 우리는 r에그들이 중복되므로 ecommend XYZ를 제외하면,이 세포의 좌표. 새로운 레코드를 생성 할 때이를 위해 쉽게 (예, 비 - 정수 숫자) 원래의 것과 구별된다 그들 셀 ID를 할당한다.
   3. 셀을 분할 점수. 참고 : MINS은 유사 분열뿐만 아니라 간기 핵을 감지하지만, 그들 사이에 구별 할 수 없습니다.
      1. 핵 분열 분석 별도로 고려 될 경우, 수동 점수 및 데이터 파일이 정보를 추가한다. 유사 분열 세포를 기록하는, * statistics.csv 데이터 파일에 새로운 변수 (열)를 첨가하고, 핵 분열 및 상간 다른 값을 할당한다.
5. 데이터 전처리.
   참고 : 스프레드 시트 오버에 대한 수정되었습니다 및 아래-분할 그들이 분석 할 준비가되면. 분석 과정 및 데이터 프레젠테이션 특정 실험에 의존 할 것이다. 그러나, 아래의 몇 가지 일반적인 데이터 변환은우리는 분석하기 전에 수행하는 것이 좋습니다 :
   1. 데이터의 분산을 감소시키기 위해 자신의 대수 나 제곱근으로 형광 강도 값을 변화. 원시 데이터가 그래프의 축 근처에 집중하는 경향이있다 (그림 4B, C 참조) 이것은 또한, 시각화하는 데 도움이됩니다.
   2. 형광의 Z-관련 감쇠를 수정 :
      참고 : 슬라이스 (그림 4E, F)의 매력에 빠져 축 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 이미지에서 형광 강도가 Z에 깊은 감소합니다.
      1. 시료에서 검출 된 에피토프 중 하나가 유비쿼터스 균일 정돈 핵 발현 마커 인 경우, 하우스 키핑 마커의 대응하는 값에 의해 각 셀에 해당 값을 나눔으로써 다른 에피토프의 형광 강도를 정규화.
      2. 이러한 기준 마커가 없으면, 다음의 방법으로 형광 Z - 관련 손실을 보상 :
         1. (Y 각 마커의 값을 플롯플롯 모든 제어 야생형 배아 (도 4F) 함께 값 - Z 위치 위에 그래프) (그래프의 X 축)의 축 Z에 걸쳐 강도의 저하를 시각화한다.
         2. 각 마커 (그림 4 층)에 대한 (강도 Z를 통해 값) 이전 단계에서 얻어진 플롯에 선형 모델 (회귀 곡선)을 장착한다.
         3. 다음 식을 이용하여 각 마커에 대한 모든 값을 보정 :
            로그 (원래 값) + Z * 모델 (그림 4D, G)의 기울기.
            주 : (R, MATLAB, 등)을 사용하는 분석 소프트웨어에 달려이 보정을 수행 할 특정 단계. R을 이용하면 데이터의 선형 모델에 맞게 다음 식을 실행
            > 작품 (로그 (채널) ~ Z, 데이터 = dataframe)
            여기서, 채널은 보정 대상 형광 채널 Z는 Z 좌표된다 및 dataframe 원하는 배아 (들) (* 합계에 대한 모든 값을 포함하는 테이블분 또는 그것의 변형에 의해 생성 된 파일 istics.csv).
            참고 : 상기 식의 출력은 다음과 같은 형식을 갖습니다 :
            (차단) Z
            4.76373 -0.01947
            여기서, Z 값은 절대 값 (예를 들어,도 4G를 참조) 4.5.2.2.3의 식으로 원래의 값을 수정하기 위해 사용되어야한다는 세트에 대한 회귀 직선의 기울기이다.

Results

데이터 해석 및 프리젠 테이션을 용이하게하기 위해주의가 모든 세포의 상대적인 위치를 분석 할 수 있도록, 수집 및 조작시 배아를 손상시키지 않도록주의해야한다도 2a를 -. D는 팽창 캐비티와 다른 단계에서 그대로 포배의 예를 나타낸다. 발생하는 손상 경우, 별도의주의를 분석하고 결과를 해석 할 때주의해야한다.

이 프로토콜을 이용하여 생성 된 데이터의 품질과 신뢰성이 정착 품질에 대한 관심의 단백질을 검출하기 위해 사용 된 항체의 신호 대 잡음 비에 의존한다. 항상 신선한 정착액을 사용하여 실험 세트를 시작하기 전에, 적절한 양성 및 음성 컨트롤, 새로운 항체를 테스트합니다. 그림 2a는 핵 단백질의 수에 대한 좋은 항체의 예를 보여줍니다. 그림 2b는 exampl를 보여...

Discussion

본 프로토콜은 착상 전 단계 마우스 배아에서 전체 마운트 면역의 정량 분석​​을 수행하는 방법을 설명합니다. 강력한 면역 프로토콜 ^(22)는 고해상도의 뒤에, ^(4)의 소프트웨어 맞춤 부재를 사용하는 공 초점 이미지 및 이미지 분할을하여 전체를 실장. 면역 프로토콜의 선택은 중요하지 않지만, 우리는 빠르고 안정적으로 우리는 시험 한 항체의 많은 강력한 신호를 제공하기 위해 여기 ²² 제시 한 검색. 다음 될 수있는 다른 프로토콜, 애플리케이션은 동일 실험에서 일관 제공된다. 여러 가지 요소가 반드시 할 수 없습니다 실험 사이의 각 개별 실험의 결과와 직접 비교에 영향을 미치는 동안, 우리는 반복 일관성을 위해 노력하고 충분한 기술적 복제를 수행하는 큰 변동성을 줄일 것으로 나타났습니다. 따라서, 한 번 최적화, 고정 및 immunolabeling 시약 및 프로토콜뿐만 아니라, 촬상 조건이 동등 실험 간의 일정하게 유지되어야한다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo collection
Blunt probe for plug check roboz		RS-9580
집게	roboz	RS-4978
수술 가위	roboz	rs-5910
유리 파스퇴르 피펫	Fisher	13-678-20C
사전 조립된 흡인기 튜브 & 마우스피스	Sigma	A5177
긴 고무 튜빙	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Acid Tyrode의 용액	Millipore	MR-004-D
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140
소 혈청 알부민	Sigma	A9647
4-웰 플레이트	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunofluorescence
96-well U-bottom plates	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Horse serum	Sigma	H0146
Primary antibodies			<강한>농도
CDX2	바이오제넥스	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	산타 크루즈	sc-9053	1:100, 10 분 고정
GATA4	산타 크루즈	sc-1237	1:100, O / N 고정
SOX17	R & D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, O/N 고정까지 10분
DAB2	BD	BD-610464	1:200
2차 항체	Life Technologies	Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
이미징
35mm 유리 바닥 접시	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS		n/a	http://katlab-tools.org 및 Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	에서 최소 시스템 요구 사항 확인Mathworks	해당 없음
MINS (소프트웨어)	무료	해당 없음	http://katlab-tools.org