방법 논문

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

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⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

2016년 3월 3일

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

이 논문에서

요약

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

초록

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포의 분화 능력은 세포 대체 요법에 대한 잠재적 인 치료 적 적용을 허용한다. 말단 분화 세포 유형. 각종 퇴행성 질환의 치료에 사용되는 폐, 간 및 췌장 조직을 향해 이러한 세포의 체외 분화는 첫 단계로 최종 내배엽 세포의 생성을 필요로 할 수있다. 이 단계는 속도 제한 인슐린 - 생산 베타 세포, 간세포 등 내배엽 유래의 세포 유형으로 말단 성숙 세포 유형 향해 더 분화된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 매우 같은 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족의 구성원, 표면 수용체 CXCR4 같은 전사 인자의 군중을 표현한다. 그러나, 분화 프로토콜은 거의 100 % 효율이 없습니다. 여기서는 분화 후 CXCR4 + 세포군의 정제 방법을 서술자기 마이크로 비드를 사용하여 DE에. 이 정제는 또한 원치 않는 계통의 세포를 제거합니다. 부드러운 정제 방법은 신속하고 신뢰성 및 하류 어플리케이션 및 분화를 개선하는 데 사용될 수있다.

서론

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포는 신체의 거의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 생체 외 분화 프로토콜은 심근 1 간세포 2, 3 베타 세포, 폐 상피 4 또는 5 신경 세포 등 다양한 성인 세포 유형을 생성하기 위해 사용될 수있다. 이는 ESC에게 다양한 퇴행성 질환 (3)의 잠재적 인 치료를위한 유용한 도구를 만든다.

폐, 간, 췌장의 성인 조직으로는 ESC의 체외 분화는 최종 내배엽 (DE) 6 연상 세포로 의사 낭 배기가 필요합니다. 상기 체세포 유형 하류쪽으로 분화 상당히 비효율적이기 때문에, 최적의 내배엽 분화는 7 레이트 제한으로 간주된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 차를 받다이들 유전자 발현 프로파일 racteristic 변한다. 능성 마스터 조절 유전자 다운 규제 예 9. CXCR4가 된 Smad2 의해 transactivated 것으로 알려져 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족 구성원과 CXCR4 높은 6

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프로토콜

확실한 내배엽으로 인간의 ESC 1. 차별화

  1. 37 ℃ 배양기에서 인간 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 배양하고, 5 % CO 2.
  2. 코트 기저막 매트릭스 1 ㎖와 새로운 6- 웰 세포 배양 접시에 RT에서 적어도 30 분 동안 배양 도자기 부화. 특정 자세한 내용은 각 제조업체의 지침을 켜십시오.
  3. 배양 된 인간는 ESC (예 : 4X) 낮은 배율을 사용하여 현미경으로 80 % -90 %의 포화 상태에 도달했는지 확인합니다. 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 매체를 흡입하여 공동의 매체를 기음. 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 한 번 세포를 씻으십시오. 이를 위해 부드럽게 각 웰에 2 ㎖의 PBS를 추가 플레이트를 흔들어 사균 및 세포 파편을 제거하는 용액을 빨아.
  4. 세포 클러스터의 부드러운 해리에 대한 효소가없는 계대 솔루션 시약의 1 ML을 추가합니다. 37 ° C 형의 세포를 품어D 5 % CO 2 세포가 작은 클러스터로 중단의 명확한 징후를 표시 할 때까지.
    주 : 배양 시간을 사용 시약에 따라 달라집니다. 자료 섹션에서 언급 된 효소가없는 계대 솔루션의 경우, 배양 시간은 약 7 분입니다.
  5. 1 ml....

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결과

분화시 는 ESC 유전자와 단백질 발현의 급격한 변화를 겪는다. 1 성공적인 내배엽 분화를 확인하는 데 사용할 수있는 일반적인 마커 유전자를 보여주고있다. 유전자 발현 분석을위한 주요 목표 GSC, FOXA2 및 SOX17있다. 미분화는 ESC에 비해 상대적 유전자 발현 분석에서 특히 FOXA2 및 SOX17는> 000 배 증가된다. GSC 이미 프리미티브 킬 형성시 초기 24 시간 이내 나타낸다 하지만 그럼에도 불구하고 하루 사에> 100 배 유도된다. 이러한 유전자의 발현은 결과적 CXCR4 표면 마커 6을 사용 정렬시 증가된다. 이들 유전자의 발현은 여전히 사일 후 검출하지만 이러한 OCT3 / 4 (POU5F1) 및 NA.......

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토론

현재 사용 분화 프로토콜은 거의 100 % 차별화 된 세포에서 발생합니다. 아직 해결해야 할 몇 가지 이유로 세포 분화 과정 레지스트. 사용 된 분화 프로토콜의 효율 및 ESC의 성향에 따라 잔류 다 능성 세포의 소정 수는 일반적으로, 심지어 최종 내배엽으로 분화 후에 관찰되는 광고. 이러한 잔류 세포는 transcriptomics, 단백질 체학 및 miRNA의 발현 분석 등 다운 스트림 분화 또는 추가 분석을 방해 할 수 있습니다. 잔여 만능 세포 또는 기타 원치 않는 계보는 차별화 목표를 방해 할 수 있습니다 분비 효과를 나타낼 수있다. 따라서, 이들 세포의 제거 재현성 향상 될 수있다.

CXCR4 내배엽 분화 후 세포를 발현 + 정제 이러한 집단을 풍부하게하고 분화 과정 저항 세포를 제거하는데 사용될 수있다.DE 표면 마커 단백질 CXCR4는 내배엽 세포의 특정의 정제에 사용될 수있다. 손 MACS 정제 프로토콜은 이하에서 2 시간 내에 완료 될 수 있고, 고가의 실험실.......

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

재스민 Kresse의 숙련 된 기술 지원은 기꺼이 인정 받고 있습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Hues8 인간 배아 줄기 세포주하버드 줄기 세포 및 재생 생물학배엽 생성에 적합한 세포주
Hes3 인간 배아 줄기 세포주ES Cell International내배엽 생성에 적합하고 견고한 세포주
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC 배양 배지
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humanMiltenyi Biotec130-098-357
anti-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-109자기장
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK 억제제
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies7174Enzyme-free 계대 태징 용액, 대안 : Trypsin / EDTA
Matrigel *Corning354277기저막 매트릭스
* -80 °C에서 분취량으로 분해 및 저장; C는 공급업체 설명서에 설명되어 있습니다. 사용 시 얼음에서 해동하고 25ml의 얼음처럼 차가운 녹아웃 DMEM/F-12.
에 희석합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 1ml를 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다.
마트리겔을 제거하고 즉시 사용하십시오.
MS 컬럼Miltenyi Biotec30-042-201
MACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Technologies
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan 분석Applied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggtacttgtag		Life Technologies
Human POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies
Human POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		Life Technologies
Human Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Life Technologies
Human Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies
Human TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		생명 과학 인간
G6PD REV
cga tga TGC ggt TCC AGC CTA T 		생명
SOX2산타 크루즈 생명 공학sc-17320
안티 FOXA2머크밀리포어07-633
안티 SOX17R & D 시스템AF1924
과 내과학 안티

참고문헌

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

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재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

CXCR4definitive endodermROCK

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