유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

Sandra Van de Wiel; Maarten Merkx; Stan Van de Graaf

doi:10.3791/53659

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방법 논문

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

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DOI:

10.3791/53659

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2016년 1월 4일

Sandra Van de Wiel¹ , Maarten Merkx²^,³ , Stan Van de Graaf¹

¹Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, ²Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), ³Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

이 논문에서

요약

유전적으로 암호화된 BAS FRET 센서를 사용하여 살아있는 세포의 담즙산 역학을 연구하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 담즙산 센서는 다양한 세포 유형에서 담즙산 수송 및 FXR 활성화를 연구(조절)하는 고유한 도구를 나타냅니다.

초록

Förster Resonance Energy Transfer(FRET)는 단일 세포에서 단백질 접힘, 상호 작용 및 국소화를 모니터링하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. FRET의 원리에 의존하는 바이오센서는 높은 시간 및 공간 해상도로 살아있는 세포에서 세포 내 신호 전달 이벤트를 실시간으로 시각화할 수 있게 했습니다. 여기에서는 파르네소이드 X 수용체 리간드 결합 도메인(FXR-LBD)에 융합된 두 개의 형광단으로 구성된 유전적으로 암호화된 담즙산 센서(BAS)의 적용을 설명하며, 이를 통해 많은 수의 담즙산 종 및 기타(합성) FXR 리간드에 의해 활성화될 수 있는 담즙산 센서를 형성합니다. 이 센서는 핵(NucleoBAS) 및 사이토졸(CytoBAS)을 포함한 다양한 세포 구획을 대상으로 하여 국소적으로 담즙산 농도를 측정할 수 있습니다. 이를 통해 세포 담즙산 유입, 유출 및 내인성 담즙산의 세포 내 분포를 형광 태그 또는 방사성 핵으로 표지할 필요 없이 빠르고 간단하게 정량화할 수 있습니다. 또한 BAS FRET 센서는 FXR 리간드 결합을 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 이 FRET 바이오센서가 스펙트럼적으로 구별되는 다른 형광단의 이미징과 결합될 수 있음을 보여줍니다. 이를 통해 세포 내 담즙산 역학 및 i) 관심 단백질의 국소화 및/또는 풍부도, ii) 단일 세포의 세포 내 신호 전달을 결합할 수 있습니다.

서론

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 ^1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 ² 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 ^{3 생활에} 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 ^4를 대상으로한다.

세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히 저조한 이해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된....