초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.
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이 논문에서
요약
초록
우리 연구소는 최근 자연 살해 (NK) 세포가 암 세포가 β - 갈 락토 - 결합 렉틴 galectin의 발현에 결함이 렌더링되는 경우 두개 내 생착 후 CNS-1 악성 신경 교종 곧 동소 이식 마우스 GL26과 쥐를 박멸 할 수 있음을 보여 주었다 -1 (GAL-1). 최근의 연구는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 인구는이 효과에 중요한 것을 알 수있다. 더 NK와 골수 세포가 우리가 단리 교종 함침 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)의 분석을위한 광범위한 프로토콜을 개발했다 GAL-1 결핍 종양 거부를 부여하기 위해 협력하는 메커니즘을 이해하기. 이 방법의 종양 미세 환경 내로 침투 PBMC를 비교하여 여기에서 설명된다 shRNA를 녹다운 통해 GAL-1 결핍 렌더링하는 것과 GL26 교종을 GAL-1 발현. 프로토콜에 대한 설명으로 시작하는 방법 문화와 GL26 가전을 준비동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접종에 대한 재편. 그러므로 초기 뇌 종양 미세 환경에서 신경 교종 함침 된 PBMC의 분리 및 유세포 분석에 관련된 단계를 설명한다. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 실험 디자인에 적용 할 수있다. 교종 함침 된 PBMC는 독립적 인 실험 내내 시점 유사한 종양에서 관찰 유사한 세포 수와 24 시간 후 종양 생착 자마자 두개 내 종양으로부터 분리 될 수있어서, 민감하고 재현성이다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출에서 방법을 수행 할 수있다. 대안 교종 모델 및 / 또는 셀 특정 검출 항체는 또한 몇몇 다른 immun의 침윤을 평가 experimentalists '판단에 사용될 수있다전체적인 절차 변경 없이도 관심 E 세포 유형.
서론
신경 교종은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는 변형 신경교 neuroepithelial 뇌암의 클래스이다. 모든 신경 교종의, 세계 보건기구 (WHO) 등급 IV 신경 교종, 또는 아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 1 치명적이다. GBM은 테모 졸로 마이드 2 방사선 플러스 수반과 보조 화학 요법 다음에 가능한 범위에 종양 절제술로 구성되어 현재의 표준 진료에 매우 내화입니다. 이 치명적인 암 5 년 3 후에 질병을 생존 환자의 5 %와 초기 진단의 시간에서 생존의 15-18개월의 실력 예후를 수행한다.
혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재는, 전문적인 항원 제시 세포의 부족 (장갑차) 및 뇌 내에서 4 선의 림프 구조의 존재는 이전 미확인 특권 면역 GBM의 개념을 이끌어왔다. 그러나, 많은 연구가 지금 SHO이러한 뇌 암은 참으로 단핵구, 대 식세포 및 골수 유래 억제 세포 (MDSCs) (5)를 포함 기원에 주로 골수 있습니다 주변 면역 세포의 채용을 발생시킬 것을 승. GBM은 6,7 프로 종양 될 뇌 상주 미세 아교 세포의 활동에 영향을 미친다. 이러한 CD8 + T 세포 (8)과<....
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프로토콜
참고 : 실험을 수행하기 전에 전체 프로토콜을 검토하십시오. 동물의 사용과 복지의 해당 기관위원회에서 척추 동물의 사용에 대한 승인은 진행하기 전에 취득해야합니다.
두개 내 생착에 대한 종양 세포의 1. 준비
- 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 작동하는 (10 % 멸균 여과 열 활성화 된 우 태아 혈청으로 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)의 500ml의 병을 보충하여 GL26-CIT의-NT / gal1i 세포 배양 배지를 제조하여 FBS를 시작할 ), 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, mCitrine 발현 벡터의 선택 / ㎖의 G418 설페이트 (600 μg의) 및 비 선택 용 퓨로 마이신 염산염 (3 ㎍ / ml의 ) 타겟팅 또는 GAL-1-shRNA를 특정.
- 문화 GL26-CIT의-NT 및 / 또는 GL26-CIT의-gal1i 세포 (그림 1A 및 1B ) 37 ℃, 5 % 2 1-2 일 전에 종양의 생착 과정 또는까지 공동 조직 문화 캐비닛 세트의 플라스크 50-80%의 포화 상태에 도달한다.
- 수술 당일에, 10 ㎖의 혈....
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결과
다음 게이팅 전략은 일반적인 실험에 사용되는 : FSC-SSC-대 → SSC-H 대 SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 대 대 카운트 → GR-1 대 CD11b를 → 카운트 대 NK1.1. 게이트는 GzmB 표현 (도 5a)에 기초하여 층화 GR-1 + / + CD11b를 골수 NK1.1 + 세포 및 NK 세포에 배치. NK1.1 + NK 세포 및 GR-1 + / CD11b를 SSC-A는 NK 세포의 작은 림프 크기 및 골수 세포의 비교적 큰 크기를 확인 대 FSC-A 상 실험에서 + 골수 세포 (식별 해당 셀을 백 게이트 그림 5B). 원 데이터 파일 (예., FCS 파일) 등으로서 시판 Flowjo 유세포 데이터 분석 소프트웨어에 의해 분석된다.
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토론
이 프로토콜은 초기 마우스 뇌 종양 미세 환경에 침투 한 한 PBMC의 분리 및 유세포 분석을위한 견고하고 재생 가능한 방법을 설명한다. 신경 교종 세포 현탁액 정위 마우스 뇌의 선조체에 접목 된 실험자에 의해 지정된 농도로 생성된다. 마우스는 다음 실험 디자인에 의해 지정된 소정의 시점에서 안락사 그들의 뇌를 수거하고, 형광 접합 된 일차 항체의 조합으로되어 immunolabeled 교종 함침 한 PBMC를 분리하기 위해 처리된다; immunolabeled 세포를 유동 세포 계측법에 의해 정량화된다. 여기에 제시된 시위 초기 시점에 초점을 맞추고 있지만, 신경 교종-침투 PBMC를 마우스 사망 분석까지 어느 시점 이후 종양 생착 최대로 평가 될 수있다. 다른 항체 조합의 임의 개수이자 난의 면역 세포를 검사하는 데 사용될 수있는 방법으로는 뛰어난 모듈T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대 식세포를 ncluding. 프로토콜이 여성 C57BL / 6J 마우스 시대의 8~10주에서 사용하도록 최적화되어 있습니다. 이 연령.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) MGC에 R01-NS074387, R01-NS057711 및 R21-NS091555 부여의 / 국립 연구소 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; NIH / NINDS는 PRL에 R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 및 R21-NS084275을 부여; 레아의 행복한 마음에서 보조금, MGC 및 PRL에게 수여 미시간 종합 암 센터의 대학; 신경 외과, 의학 미시간 대학의 대학의 부; NIH 보조금 2UL1-TR000433 지원하는 임상에 대한 미시간 연구소 및 건강 연구,; NIH / NCI (국립 암 연구소) 부여 T32-CA009676에 의해 지원되는 미시간 대학 암 생물학 교육 보조금; NIH / NINDS 지원하는 임상과 기초 신경 과학 미시간 교육 대학은 T32-NS007222을 부여; 그리고 NIH / NIGMS (일반 의학 과학의 국립 연구소)에 의해 지원 미시간 의료 과학자 교육 프로그램의 대학은 T32-GM007863을 부여합니다. 저자박사 카린 Muraszko 및 신경 외과의 부서에서받은 교육 리더십과 지원에 감사 재; M. 달 그렌, D. Tomford,과 최상의 행정 지원에 대한 S. 나폴리탄에; 뛰어난 기술 지원 M. Dzaman에; 그리고 자이스 3D 스캐닝 전자 현미경의 ....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코' Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | 4.5g/L D-글루코오스, L-글루타민, 25 mM HEPES 및 페놀 레드를 함유하고 있습니다. |
| 둘베코' s 인산염 완충 식염수 | Gibco | 14190-144 | 염화칼슘 또는 염화마그네슘 없이 |
| 소 태아 세럼 | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml 페니실린; 10,000 μ g/ml 스트렙토마이신 |
| L-글루타민 | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 황산염 | 오메가 사이언티픽 Inc. | GN-04 | |
| 퓨로마이신 디하이드로클로라이드 | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase 비포유류 트립신 대안 | EDTA를 사용한 DPBS의 | Thermo Scientific | SV30030.01 |
| 위상차 혈구계 | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm 깊이 |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| 멸균 0.9% NaCl 주입, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml 바이알 |
| 0.6ml 원추형 폴리프로필렌mi 마이크로튜브 | Genesee Scientific | 22-272 | |
| 아티파메졸 염산염 주입 | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml 용액 |
| 케타민 염산염 주사 | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml 용액 |
| 덱스메데토미딘 염산염 주사 | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml 용액 |
| 자일라진 염산염 주사 | 로이드 | NDC: 61311-481 | 100mg/ml 용액 |
| 카르프로펜 주사 | 화이자 | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml 용액 |
| 부프레노르핀 염산염 주사 | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml 앰플 |
| 1 ml 투베르쿨린 주사기 | 코비디엔 | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45mm x 13mm) 주사기 바늘 | BD | 305111 | |
| 외과용 클리퍼 | 3M | 9661 | |
| 프로비돈-요오드 용액 | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| 멸균 페트롤라툼 안과 연고 | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% 이소프로필 알코올 준비 패드 | Kendall | 6818 | |
| 멸균 거즈 | Covidien | 8044 | 비직물, 4" x 4", 4-플라이 |
| 1.7ml 원추형 폴리프로필렌 마이크로튜브 | Genesee Scientific | 22-281 | |
| 마우스 정위 프레임 | 스톨팅 | 51730 | |
| 수술용 램프 | Philips Burton | CS316W | Coolspot II 가변 스포트라이트 |
| 곡선 해부 겸자 | Ted Pella Inc. | 5431 | |
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| 마이크로리터 주사기 바늘 | Hamilton | 7762-06 | 33 G, 작은 허브 RN NDL, 1.5 인치, 포인트 스타일 3, 6/PK |
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| 폴리우레탄 얼음 양동이 | Fisherbrand | 02-591-45 | 용량: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz 단위/mg 건조 중량 |
| 방지 폴리스티렌 육각형 계량 접시 | Ted Pella Inc. | 20157-3 | 상단 I.D. 115mm, 기본 I.D. 85mm, 203ml 용량 |
| 스테인레스 스틸 단일 가장자리 면도날 | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| 대형 해부 가위 | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| 소형 해부 가위 | FST | 14094-11 | |
| 무딘 끝 집게 | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml 유리 Dounce 티슈 그라인더 | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll 밀도 원심분리 미디어 | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10ml 혈청학 피펫 | Genesee Scientific | 12-104 | 일회용; 멸균 |
| 70 μ M 멸균 나일론 메시 셀 스트레이너 | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (클론: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (클론: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE 활용 쥐 안티 마우스 Gr-1 (클론 : RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP / Cy5.5 복합 쥐 안티 마우스 CD11b (클론 : M1 / 70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (클론 : RTK4530) isotype control | APC | ||
| ; (클론 : eBM2a) 동형 제어 | eBioscience | 17-4724 | |
| PE 접합 쥐 IgG2b, κ (클론 : eB149 / 10H5) 동종 제어 | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (클론: RTK4530) 아이소타입 컨트롤 | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (클론: GB11) | 바이오레전 | 드 515403 | |
| 퍼시픽 블루 활용 마우스 IgG1, κ (클론: MOPC-21) 이소타입 제어 | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Genesee Scientific | 21-103 | 원뿔형 바닥 |
| 50 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | Genesee Scientific | 21-108 | 원뿔형 바닥 |
| 12 mm x 75 mm 라운드-바닥 폴리프로필렌 FACS 튜브 | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria 특별 주문 연구 제품 플로우 사이토미터/세포 분류기 | BD | ||
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | The Baker Company | SG603 | 모델: SterilGARD III Advance |
참고문헌
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352<....
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재인쇄 및 허가
