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방법 논문

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53682

⸱

2016년 3월 2일

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

이 논문에서

요약

아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 아레나바이러스 부착 이벤트의 초고감도 검출 및 정량화를 위한 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석을 보고합니다.

초록

아레나바이러스는 심각한 인간 질병을 일으키는 외피 RNA 바이러스의 일종입니다. 아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 바이러스-세포 부착은 비오틴, 방사성 동위원소 또는 형광 염료로 표지된 비리온을 사용하여 측정할 수 있지만, 이러한 접근 방식은 일반적으로 결합된 바이러스를 검출할 수 있도록 높은 다중 감염 다중성(MOI)을 필요로 합니다. 비리온 패키징 바이러스 게놈 RNA의 정량화를 통해 Junin 바이러스 균주 Candid 1 부착을 측정하는 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 뛰어난 감도와 입력 바이러스를 정제하거나 라벨링할 필요 없이 광범위한 MOI에서 부착물을 측정할 수 있는 기능 등 여러 가지 장점이 있습니다. 중요한 것은 이 접근 방식이 바이러스 특이적 qRT-PCR 시약을 사용하여 다른 바이러스와 함께 사용하도록 쉽게 조정할 수 있다는 것입니다. 또한 이 분석은 입자 세포내이입 및 게놈 비코팅을 측정할 수 있도록 수정할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 아레나바이러스-세포 부착의 고감도 측정을 위한 간단하면서도 강력한 분석법을 설명합니다.

서론

Arenaviruses 자연 1-3 설치류에서 주로 유지 포위, 단일 가닥 RNA 바이러스의 가족입니다. 이 바이러스는 일반적으로 설치류 저수지 1,2의 증상, 지속적인 감염을 설정하는 동안, 그들은 인간 3 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 중요 병원성 종은 새로운 세계 후닌 바이러스 (JUNV) 4 아프리카에서 남미, 라사 열에서 아르헨티나 출혈열의 병원체가 각각있는 올드 월드 라사 바이러스 (5)를 포함한다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 가정 (6)의 본보기 바이러스는 전 세계적으로 분포가 면역 억제의 면역 개인 6 무균 성 뇌막염, 태아 7 심각한 선천성 또는 높은 치사율을 포함하는 다양한 질환 상태에 대한 책임 고체 장기 이식 8,9 다음 개인. 미국의 부족식품의 약국 (FDA)은 백신 이들 바이러스에 대처하기 위해 효과적인 항 바이러스제는 치료 이들 신흥 / 재 신흥 병원균을 대상으로 새로운 전략을 개발하는 중요한 필요성을 강조 -approved.

arenavirus 게놈 두 개의 단일 가닥 RNA 세그먼트, 대형 (L) (~ 7.2 킬로바이트) 작은 (S) (~ 3.6 킬로바이트) 세그먼트 (10)로 구성되어 있습니다. L 세그먼트가 바이러스 폴리머 라제 (L) 및 매트릭스 단백질 (Z)을 인코딩하는 동안 S 세그먼트 바이러스 핵 단백질 (NP)과 외피 당 단백질 (GP)을 인코딩한다. L과 S 게놈 RNA 세그먼트 (vRNA들)은 비리 10-12로 포장됩니다. arenavirus 감염의 초기 단계는 바이러스 입자의 부착 JUNV 들어 인간 트랜스페린 수용체 1 (hTfR1) (13, 14)과, 바이러스 GP 및 해당 숙주 세포 수용체 사이의 상호 작용을 통해 세포를 호스팅한다. 부착 후, JUNV 입자는 클라 트린 매개 엔도 시토 시스 (15)를 통해 세포로 수행한다.입자이 구획의 낮은 pH가 GP 16, 17의 활성화를 유발 후반 엔도 좀에 다음 트래픽. 일단 바이러스와 엔도 솜 막의 융합을 개시 사이, GP 부호화 융합 펩티드 삽입 엔도 솜 막으로 활성화. 그들은 게놈 복제 및 전사에 대한 템플릿 역할을 세포질에 비리 패키지 vRNA들의 릴리스의 성공적인 융합의 결과. 바이러스의 구조 단백질과 vRNA들의 충분한 양이 생성되는 경우, 새로운 입자가 조립하고 감염된 세포에서 새싹 라이프 사이클 (18)를 완료합니다.

치료 병원성 arenaviruses 타겟팅 새로운 전략의 발견을 용이하게하기 위해, 우리 그룹은 호스트에 대한 바이러스 증식에 중요하지만, 폐기 가능하다 호스트 요소의 식별에 초점을 맞추고있다. 이러한 맥락에서, 이러한 숙주 요인에 의해 제어 바이러스 생활주기의 정확한 스테이지 (들)를 형성하는 안내 할 필요가있다항 바이러스 전략의 개발. 여기서, 우리는 선택된 숙주 단백질 및 / 또는 바이러스 분자 바이러스 엔트리 (19)의 초기 단계에 영향 여부를 식별하기위한 목적 arenavirus 세포 부착을 측정 할 수 정량 (Q) RT-PCR 기반 분석법을 설명한다. arenavirus 세포 부착을 측정하는 다른 방법은 비오틴 (20), 형광 염료 (21), 또는 방사성 동위 원소 (22)으로 표시 비리를 추천했다. 이러한 방법에 대한 단점은 입력 바이러스의 대량 방사능의 사용 (감염 (MOI)의 예를 들면 높은 다중도), 및 / 또는 입력 된 바이러스 (예를 들어, 농도 및 / 또는 바이러스의 표시)을 제조하기위한 추가 처리 단계들에 대한 요구 사항을 포함 할 수있다 . 특히, 높은 MOI를 사용하는 것이 곤란 비생산적인 부착 이벤트 15,23 비해 생산성을 구별 할 수있다. 여기에 설명 된 QRT-PCR 기반의 분석은 거의 20 패에 대한을 사용하여 첨부 이벤트를 검색 할 수 있습니다밍 단위 48 웰 플레이트에 대해 0.0004의 MOI로 변환 바이러스 (PFUs). 따라서, 분석의 감도가 강한 높은 MOI 대한 요구뿐만 아니라 바이러스 라벨 또는 농도 단계를 극복한다. 또한, 분석 내가) 비리의 엔도 사이토 시스를 측정 할뿐만 아니라 세포질에 바이러스 게놈의 방출 등의 융합에 따라하도록하고 ⅱ) 예제 바이러스 특정 QRT-PCR 시약의 개발을 통해 다른 바이러스와 함께 사용 (위해 맞춤형 할 수 있습니다 참조 24-27).

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프로토콜

주 : 설명 프로토콜 (프리 PCR 실험실 방법 좋은 사전-PCR 기법을 사용하여 실험을 실시하는 설정 방법에 대한 뛰어난 개관 28 참조) 엄격한 사전-PCR 기법을 사용하여 수행하는 것이 중요하다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 프로토콜의 개요는도 1에 도시되어있다.

1. 48 웰 플레이트에서 미디어 및 종자 세포를 준비

  1. 50 ㎖를 첨가하여 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 이글 보통 500 ㎖ (DMEM), 1 % HEPES (N-2- 히드 록시 에틸-N-2- 에탄 설 폰산) 완충액을 준비 열 불 활성화 소 태아 혈청 DMEM 5 ㎖의 500ml의 병에 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 100X HEPES 완충액 각. 이 시약은 사에 저장 될 수있다(76); 개월 동안 C.
  2. 완전 DMEM 500 ㎕의 최종 부피에서 48- 웰 조직 배양 플레이트 내에 웰 당 종자 2.5 × 104 베로 E6 세포. 10~18 시간 동안 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
    1. 평일의 끝 플레이트 종자. 중 중복 또는 세중의 우물에서 각 바이러스 샘플을 테스트합니다.
      주 :이 분석 용 48- 웰 기반 플랫폼이 설명되지만, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 다운 사용 분석을 확장 할 수 있어야한다.

2. 바이러스 세포 첨부 파일을 실행

주 :이 프로토콜에서 사용되는 바이러스를 JUNV 균주 솔직 # 1 (C # 1) 성공적 JUNV 병 (29)의 예방을위한 약독 화 생백신으로 사용되어왔다. JUNV C # 1은 생체 내 및 생체 외 모두 직렬 통로를 통해 악성 JUNV 변형 XJ에서 파생 된 12 아미노산 (30)에 의해 부모 XJ 균주와 다른했다. Becaus전자 JUNV C # 1이 바이오 안전성 수준 (BSL) -2 등급 병원체이며,이 섹션에 설명 된 작업은 적절한 BSL-2 방식 (31)를 사용하여 수행해야합니다. 이것은 개인 보호 장비 (예 : 눈 보호, 실험실 코트, 이중 장갑), 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛의 사용을 포함, 모든 직원이 기관의 교육과 안전이 유기체를 처리하는 데 필요한 승인을받은 것을 보장한다.

  1. 원하는 PFUs에 테스트 할 JUNV C # 1 샘플 (들)을 희석 또는 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM에서 형성 단위를 집중하고 각 웰에 추가 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다.
    주 : 완전 DMEM에 희석 바이러스 결합 연구를 수행하는 대안 혈청 바이러스 첨부 간섭이 발생할 수 있는지 여부를 설정하는 축소 혈청 농도 (2 %) 및 ​​적합한 완충액 PBS를 함유하는 최소 배지를 사용할있다. 다른 바이러스 유사 첨부 프로토콜은 bicarbo없이 RPMI 1640 배지의 사용을보고0.2 % 소 혈청 알부민, 10mM의 (2- (모르 폴리 노) 에탄 설 폰산)를 포함 네이트, 10 mM의 HEPES, pH가 6.8 32. 이 바인딩 미디어는 미디어가 인큐베이터의 CO 2 - 환경에서 제거 될 때 발생할 수있는 pH 변화를 방지하기 위해 우수 할 수있다.
    1. 비생산적인 첨부 이벤트를 제한하기 위해 200에서 2,000까지 PFUs와 우물을 접종한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 상기 분석은 거의 20 PFU (또는 많은 6~10 × 2 PFU 등)를 이용하여 부착을 검출 할 수있다.
    2. 세포 상에 접종에 대한 바이러스의 마스터 믹스를 만듭니다. 각 바이러스 샘플을 잘 당 50 μL의 볼륨에서 중복 우물에 접종한다. 웰 당 2,000 PFUs 바이러스의 추가를 원하는 경우, 따라서 DMEM 완료 차가운 얼음 120 ㎕의 총 부피로 희석 4800 PFUs.
      1. 분석의 특이성에 대한 제어하기 위해, 하나가 TfR1 (TRVb) 또는 특급을 표명하지 아니 중국어 햄스터 난소 세포 라인의 일치 쌍을 사용하여이 세포에 JUNV의 첨부 파일로 RESS hTfR1 (TRVb-1) 감소 여부, 각각 13,33해야 하나. 또한, arenavirus 첨부 파일 34 또는 항목 35을 방지하기 위해 이러한 테의 K 같은 단백질 분해 효소와 세포를 치료. 그들은 세포 13,36에 JUNV의 항목을 차단 알려진대로 hTfR1에 대한 고유 수용성 hTfR1 또는 monocolonal 항체 ch128.1은, 또한 고려 될 수있다. 또한, 무료 만노스 14 JUNV 특정 중화 항체 (37)와 입자의 배양과 세포의 전처리 바이러스 항목을 억제 할 수 있습니다.
      2. 이 그럴듯한 설명이지만 JUNV 항목을 차단에도 불구하고 이러한 후자의 시약 및 방법은, 첨부 파일을 차단하는 확인되지 않은, 그러나, 유의하시기 바랍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 정식 이러한 다양한 접근 충격 비리 부착 여부를 결정하기 위해 사용될 수있다.
  2. 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 제거하고배치 중 4 ° C의 냉장고에서 15 분 엔도 시토 시스를 수행하는 도금 세포의 기능을 억제하기위한 얼음.
  3. 다음으로, 각 웰에서 완전한 DMEM을 대기음 빠르게 얼음 차가운 PBS (인산염 완충 식염수)의 pH 7.4의 100 μl를 사용하여 두 번 아니라 각 씻는다. 그런 다음 적절한 우물 (단계 2.1에서 준비) 사전 희석 바이러스 샘플의 50 μl를 추가합니다.
  4. 플라스틱 포장에 접시를 감싸 즉시 다시 얼음이나 바이러스 첨부 파일이 발생할 수 있도록 1 시간 1.5에 대한 4 ° C 냉장고에 하나 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 4 ° C에서 감기, 판을 보관 버퍼를 세척 및 바이러스 샘플.
  5. 39 ° C에서 배양 종료 후, 바이러스 접종 물을 흡인하고 빙냉 PBS 200 ㎕를 각 웰을 3 회 세척 하였다.

3. 바이러스 성 RNA 추출

  1. (예를 분리하고, RNeasy 미니 키트) 코르 상업용 키트를 사용하여 C JUNV 번호 # 단층에 부착 한 입자를 바이러스 RNA를 정제하여제조 업체의 프로토콜 땡. 특히, 아래의 수정을하고, RNeasy 미니 수첩의 페이지 23-28 (제 4 판 2006 년 4 월)의 "스핀 기술 프로토콜을 사용하여 동물 세포에서 총 RNA의 정화"를 따릅니다.
    1. 를 Lyse 각 웰에 직접 용해 완충액 RLT 350 μl를 첨가하여 공정 (b)에 지시에 따라 세포. 세포 용해를 위해 상기 버퍼를 여러 번 섞는다. 세포가 쉽게 용균 완충액 완전한 용해가 반전 현미경 웰을보고 확인할 수 있습니다.
    2. 키트 컬럼 (3a 단계)에 생성 된 세포 용 해물을 전송하고 설명 된대로 프로토콜의 나머지 부분을 따르십시오. 프로토콜의 나머지 단계는 클래스 II 바이오 캐비닛의 외부에서 수행 키트 튜브 감염성 바이러스에 오염되지 않은 제공 될 수 있으므로이 점에서, 바이러스는 용해 완충 용액으로 중화되어있다.
    3. 되어온는 제조 업체의 프로토콜에서 옵션 9 단계를 포함스핀 열의하는 ional 원심 분리는 버퍼 RPE의 가능한 이월을 제거합니다.
    4. 최종 단계에서 제조사의 프로토콜 (단계 10) 뉴 클레아 제 무 DDH 2 O. 30 μL를 사용하여 스핀 칼럼으로부터 정제 된 RNA를 용출 상점이 시점에서 -80 ° C에서 RNA 또는 QRT-PCR 분석에 직접 사용합니다. 뉴 클레아 제에 의해 정제하여 바이러스 RNA 시료의 열화를 방지하기 클레아없는 시약 및 장치를 사용하여 얼음 위에서 해동 RNA 샘플을 유지한다.
      참고 : 버퍼 RLT 및 RW1은 구아니딘 염을 포함하고 표백제와 혼합 할 수 없습니다. 버퍼 RW1 에탄올이 포함되어 있습니다.

바이러스 성 게놈의 4 QRT-PCR 측정

  1. 이후 qPCR에 대한 cDNA를에 JUNV C # 1 S 세그먼트 RNA를 변환하려면, 50 μL의 총 부피에 RT에 (단계 3.1.4에서 생성) 바이러스 성 RNA 대상으로 할 수 없다.
    1. 클레아의 6.75 μL : RT 반응을 설정하려면 먼저 반응에 따라 다음과 같은 시약을 각각 포함하는 마스터 믹스를 만들-free DDH 2 O, RT 프라이머 S의 2 μM 스톡 5 μL 2098- 2075-에 S 세그먼트 게놈 RNA의 NP 영역 5 μL의 상보 (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), 10X PCR 완충액 II, 25 밀리미터의 MgCl 2 용액 11 μL, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제 1 μL (0.4 단위) 1.25 μL (62.5 단위)과의 dNTP 500 μM의 재고 10 μL.
      참고 arenavirus 복제 과정 동안 4 바이러스 S 세그먼트 RNA 종 생성된다 : 전체 길이 게놈 RNA (vRNA와) 전체 길이 antigenomic RNA (vcRNA) (즉, vRNA와의 역방향 보완) 두 subgenomic의 mRNA를 각각 및 NP 유전자를 코딩 GP. 여기 나열된 RT 프라이머는 S 구간 vRNA와 특정 아니지만 vcRNA, NP의 mRNA 또는 mRNA의 GP.
    2. 조심스럽게 RT 마스터 믹스를 혼합 한 다음 각각의 0.2 ml의 PCR 튜브에 40 μl를 나누어지는. 각 튜브에 바이러스 성 RNA의 10 μl를 추가합니다. 포함 I)없이 템플릿 제어 튜브 (예 :. 뉴 클레아없는 DDH 2 O (40)에 대한 마스터 믹스 μL)과 ⅱ)없이 RT 효소 제어의 10 μl를 (예를 들면받지 않은 마스터 믹스 40 μL에 알려진 양의 바이러스 성 RNA 샘플의 10 μl를 추가 추가 모든 RT 효소) 바이러스 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA와 함께 RT 시약의 오염을 선별한다. 세포 RN​​A의 존재 분석 특이성에 대해 제어 할 수있는 전체 RT 마스터 믹스 감염되지 않은 세포에서 추출한 RNA를 포함합니다.
    3. 또한, RT 시약의 품질을 확인하기 위해 전체 마스터 믹스로 알려진 양성 바이러스 성 RNA 샘플을 포함한다. 필요한 경우 RT 반응 부피 25 μL로 감소 될 수 있습니다.
  2. 다음 사이클 조건 RT 튜브 제목 : 25 ° C를 10 분, 30 분, 48 ° C, 5 분 동안 95 ° C에 대한. 샘플을 4 ° C의 공정을 추가하여이 시점에서 -20 ° C에서 저장 또는 열 순환기에서 밤새 남아있을 수 있습니다.
  3. 피25 μL의 총 부피에 erform qPCR에.
    1. 다음 결합하여 qPCR에 마스터 믹스를 확인 : 각의 S1937 +는 1958+하는 앞으로 PCR 프라이머 (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') (9 μM 주식) 2.5 μl를 및 역방향 PCR 프라이머 S 2001에 1982 ~ (5 에 qPCR에 프로브 S 1960+의 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2 μM 주식의 2.5 μL () 1975+ (5'-6FAM - ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') 및 2 배 보편적 인 qPCR에 마스터의 12.5 μL 혼합. JUNV C # 1에 특이 여기에보고 앞으로 프라이머, NT 악성 JUNV 변형 로메로을 대상으로 처음보고 된 프라이머 서열 38에서 1로 차이가 있습니다.
    2. 부드럽게 솔루션을 혼합 한 후 각 웰 qPCR에 20 μl를 추가합니다. 해당 qPCR에 우물 각 RT 반응의 5 μl를 추가합니다. 시험 각 샘플에 대해 중으로 qPCR에를 실시하고 있습니다. 필요한 경우 PCR 반응 부피가 적은 등 12.5 μL로 감소 될 수 있습니다.
      참고 :와 관련된 소프트웨어를qPCR에 기계 qPCR에 프라이머 대상 JUNV C # 1 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드의 표준 희석 시리즈 각 미지 시료의 값을 비교하여 JUNV C 1 S 세그먼트 게놈 RNA의 절대 복사 번호 생성 프로브 설정합니다. qPCR의 분석에만 표준 곡선의 범위 내에있는 값을 정량 분석​​을 제공 할 수있다. 5, 50, 5 × 103, 5 × 5, 5 × 7 복사 웰당이 때문에, 이하의 (삼중 웰)에서 플라스미드의 양을 포함한다.
  4. 열 순환기에 qPCR에 판을로드하고 다음과 같은 반응 조건을 실행 : 95 ° C를 10 분 15 초와 1 분 60 ° C 95 ° C의 40주기 위해.
    1. 수집하고 제조자의 프로토콜에 따라 각 샘플에 바이러스 RNA의 양을 결정하기 위해 데이터를 분석한다.
  5. qPCR의 타르를 함유하는 플라스미드 새로 정제 샘플을 사용하여 검량선을 설정하려면서열을 얻을 제 용액의 플라스미드 카피 수를 결정한다.
    1. 플라스미드의 분자량을 계산한다. 전체 플라스미드의 서열이 공지 된 경우, 다음 수식을 이용하여이를 계산 : MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). 이중 가닥 플라스미드의 각 가닥에 발견 된 특정 뉴클레오티드의 총 수를 포함해야합니다.
    2. 플라스미드의 크기가 알려져 있지만, 그 정확한 시퀀스가​​없는 경우, 각각의 dsDNA의 염기쌍 600의 MW를 갖는다는 가정하에 계산 MW.
      참고 : 여기에 사용는 pCAGGS - JUNV C # 1 NP의 플라스미드는 4.2 × 10 (6)의 MW 있습니다.
    3. 플라스미드의 MW가 결정되면 μL 당 매수 재고 플라스미드 용액에 존재하는 계산 방법.
    4. 제 용액 플라스미드의 총 μg의 계산 후 플라스미드의 몰이 변환 (69 μg의 플라스미드을 물 300 μL, 6.9 X 1에 포함되어있는 경우, 예를 들어번호를 복사 변환 할 수있는 플라스미드 * 1 몰의 0 -5 g / 플라스미드의 4.2 × 10 6g = 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰), (예를 들어 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰 * 6.022 × 10 (23) 분자 / 몰 = 9.8 × 10 (12) 분자 (또는 사본)).
    5. μL 당 사본을 얻기 위해 그 용액의 부피 플라스미드 플라스미드 용액의 전체 사본을 나눈다 (예를 들면 9.8 × 10 12 카피 / 300 μL = 3.28 × 10 10 부).
    6. 5 ㎕의 부피는 표준 곡선을 확립하는 데 필요한 카피 수의 범위를 전달하기 위해 PCR 플레이트 상에 로딩 될 수 있도록 적절하게 용액을 희석.

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결과

프로토콜의 섹션 4에 기술 된 바와 같이의 qPCR 분석의 감도와 다이나믹 레인지를 설명하기 JUNV C # 1 (범위 5-5 X 107 부)의 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드를 공지 된 양을 qPCR을 행 하였다. 분석은 민감하고 안정적으로 표적 핵산의 5 부 (그림 2) 적은 감지 할 수 있습니다. 템플릿의 적어도 7 로그를 커버 할 수있다,도 2에 도시 된 바와 같이, 또한, 분석의 동적 범위가 크고. 도시하지 않은 동안, 우리는 핵산의 많은 9 10 × 5로 복사로 감지했다.

프로토콜에 기재된 JUNV C 1 입자의 부착 측정 분석의 유용성을 설명하기 위해 JUNV C # 1은 다양한 양 베로 E6 세포 prebound 하였다. 결합되지 않은 입자를 세...

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토론

우리가 설명하는 프로토콜은 간단하고 강력한는 다음과 같은 중요한 고려 사항이 관찰된다 제공했다. 첫째, 엄격한 사전-PCR 기술은 (우수한 검토를 위해 28 참조) 고용해야합니다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 둘째, 프로토콜, 바이러스, 세포, 및 미디어 바이러스 세포 부착 부에 대해 표면 - 결합 세포 내 이입의 비리 방지 39 ° C로 유지되어야한다. 셋째, RNA 추출을 위해 수집 된 세포의 양 RNA 정제 필터의 RNA 결합 용량을 초과해서는 안된다. 넷째, 정제 된 바이러스 RNA 샘플 클레아없는 시약 및 장치를 이용하여 해동 할 때 얼음을 유지하여 리보 뉴 클레아 제 - 매개 분해로부터 보호되어야한다. 다섯째, 표준 곡선의 범위는 충분히 커야 qPCR의 분석에 포함미지 시료에서 관찰 된 모든 값을 촬영합니다. 여섯째, 복제 기술은 분석의 바이러스 세포 부착 부뿐만 아니라 개별 RNA...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 보조금 T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), 및 P20RR021905을 통해 이러한 연구의 지원에 도움이 토론과 국립 보건원 (JB)에 대한 마르쿠스 Thali, 나단 로이, 크리스토퍼 지글러, 에밀리 브루스, 베냐민 왕 감사합니다 .

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMLife Technologies11965-118
페니실린-스트렙토마이신Life Technologies15140-163100x
HEPES 버퍼 솔루션Life Technologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
Vero E6 cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-1586
Costar 48-well plateCorning3548
RNeasy 미니 키트Qiagen74106완충액 RLT 또는  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizerQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µ l)Life Technologies4311235
dNTP 혼합물(10mM, 각 2.5mM, dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II 및 25mM MgCl2 용액Life TechnologiesN808-0010
RNase 억제제(5000U/100 µ 엘)라이프 테크놀로지N808-0119
RT 프라이머 5'-AAGGGTTTAAAAAT < br / > GGTAGCAGAC - 3 '통합 DNA 기술250 nmol DNA 올리고표준 탈염
포워드 qPCR 프라이머  5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'Life Technologies4304971 표준 탈염
역 qPCR 프라이머 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'Life Technologies4304971표준 탈염
TaqMan 프로브 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'Life Technologies4316033HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well 반응 플레이트(0.1 mL)Life Technologies4346906
StepOnePlus Real-Time PCR SystemLife Technologies4376598또는 기타 qPCR 기기
, , 스

참고문헌

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