다음은 기존의 생물 안전성 캐비닛 및 인큐베이터를 대체하여 최대한의 무균성과 재현성을 허용하는 밀폐된 세포 배양 시스템에서 만능 줄기 세포(PSC) 및 신경 줄기 세포(NSC)를 성장시키는 프로토콜입니다. 이 장비는 cGMP(Clinical Good Manufacturing Practice) 및 cGLP(Clinical Good Lab Practice) 지침을 충족합니다.
이 논문에서
요약
초록
이 백서에서는 기초 및 전임상 연구를 위해 맞춤형으로 제조된 상업적으로 이용 가능한 밀폐형 세포 배양 시스템을 사용하는 방법을 설명합니다. 생물안전성 작업대(BSC) 및 인큐베이터는 오랫동안 기초 및 전임상 연구를 위한 세포주 배양 및 확장의 표준이었습니다. 그러나 많은 줄기세포 실험실의 초점이 기초 연구에서 임상 중개로 이동함에 따라 세포 배양 시스템에 대한 추가적인 요구 사항이 필요합니다. 모든 공정은 잘 문서화되어야 하며 멸균 및 재현성에 대한 탁월한 요구 사항이 있어야 합니다. 기존 인큐베이터에서는 공급, 계대 배양 또는 기타 조작을 위해 세포를 제거할 때마다 가스 농도와 온도가 크게 변동합니다. 이러한 중단은 cGMP 및 GLP 지침의 표준이 아닌 환경에 기여합니다. 이러한 중단은 특히 세포가 치료 목적으로 활용되는 경우 최소화되어야 합니다. 표준 BSC 및 인큐베이터 시스템에서 폐쇄형 시스템으로 전환하려는 동기는 이러한 중단을 무시할 수 있기 때문입니다. 폐쇄형 시스템은 세포 배양을 공급하고 조작할 수 있는 작업 공간을 제공하며 온도와 가스 농도가 일정하게 유지되는 통제된 환경에서 세포 배양을 유지합니다. 이러한 방식으로 만능 및 다능성 줄기 세포는 파생 순간부터 최종적으로 치료에 사용될 때까지 최적의 건강 상태를 유지할 수 있습니다.
서론
표준 줄기세포 배양 기술은 세포에 과도한 스트레스를 가하고 세포를 허용할 수 없는 오염 위험에 노출시키는 몇 가지 환경적 제약으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 표준 세포 배양 조건에서 세포가 견딜 수 있는 스트레스 중에는 이산화탄소 및 산소 농도 수준의 급격한 변화가 있습니다3,4. 이는 세포가 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛 및/또는 현미경으로 이동할 때 발생하며, 이는 세포에 최적이 아닐 수 있습니다. 이전 연구에서는 저산소성 조건에서 만능 줄기세포와 신경 줄기세포를 모두 배양하는 것의 장점이 확인되었으며, 4,11 최상의 결과를 얻으려면 이러한 조건이 연속적이어야 합니다. 더욱이, 실험실 환경과 인력이 배양 및 조작의 거의 모든 단계에서 세포에 영향을 미치기 때문에 세포 오염의 위험이 더 높습니다. 기존의 클린룸은 오염 위험을 크게 줄일 수 있는 효과적인 방법 중 하나이지만 비용이 많이 들고 설치 면적이 크며 이산화탄소 및 산소 농도와 관련된 스트레스 요인을 해결하지 못합니다.
오염 위험과 가스 농도를 모두 해결할 수 있고 cGMP 기준9를 충족할 수 있는 세포 생산 시설은 기초 과학 연구 및 임상 응용 분야를 위한 고품질 세포를 제공합니다1,6,7. 이러한 세포 생산 시설은 최소한 다음과 같은 구성 요소로 구성됩니다 : 세포 배양의 공급 및 조작을위한 가열 된 작업 공간 역할을하는 공정 챔버; 시약, 튜브 및 도구의 초기 살균을 위한 층류 후드; 후드와 공정 챔버 사이에 있는 두 개의 완충 에어록 챔버; 공정 챔버에서 접근할 수 있는 2개의 세포 배양 인큐베이터; 공정 챔버에 인접한 현미경 챔버; 마지막으로 이러한 모듈 내의 조건을 설정하고 모니터링하는 컴퓨터 소프트웨어입니다. 이 기본 인프라를 사용하여 만능 줄기 세포 및 다능 신경 줄기 세포의 표준 섭식 및 패시징과 같은 다양한 작업을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍, 체외 이동 연구, 전기 생리학적 특성 분석을 위한 신경 줄기 세포 분화와 같은 보다 전문화된 방법을 수행할 수 있습니다.
프로토콜
1. 초기 설정
- 가스 및 온도 농도 설정
- 소프트웨어를 사용하여 그래픽 인터페이스의 왼쪽 상단에있는 "고객"탭을 클릭합니다. 지정된 사용자 이름과 암호를 사용하여 시스템에 로그인합니다. 각 사용자가 자신의 사용자 이름과 암호를 가지고 있는지 확인하십시오.
- (그림 1) 조정 모듈을 클릭합니다. 현재 설정을 표시하는 새 창에서 "설정 점"아래 기존의 O 2 세트 포인트 값을 클릭하고이 모듈에 필요한 O 2 농도를 입력합니다. 신경 줄기 세포가 성장 또는 조작 될 경우, O (2) 다 능성 줄기 세포가 성장 또는이 모듈에서 조작 될 경우, 5 % O 2를 입력하고, 9 %. 세트 포인트를 확인하기 위해 녹색 체크 표시를 클릭합니다.
참고 : 층류 후드 및 현미경 실 : 두 모듈은 가스 조절되지 않습니다. 층류 후드 내의 가스 농도는 대기압이다 whil전자 현미경 챔버 내의 이러한 수동적 프로세스 챔버 내의 가스 농도가 유지된다. - CO 2가 O 2 만 조정할 수 있습니다 버퍼 챔버를 제외한 모든 모듈에 대해 5 % CO 2의 세트 포인트를 입력 대해이 단계를 반복합니다.
- 그들은 새로운 세트 포인트에 도달하는지 확인하기 위해 "공정 값"으로 표시되어 현재의 가스 농도를 모니터링합니다.
- 적절한 값으로 모든 모듈의 가스 세트 포인트를 조정합니다. 서로에 노출되는 챔버의 CO 2와 O 2 레벨 매치. 예를 들어, 또한, 5 % O 2이 기간 동안 프로세스 챔버에 항목을 추가하는 데 사용되는 모든 버퍼 챔버에 적응 5 % O 2에서 세포 성장 배양기를 열기 전에 5 % O 2 프로세스 챔버를 조절한다.
- 가스 조정에 동일한 화면을 사용하여 37 ° C로 처리 챔버의 온도를 설정한다. 또한 프로세스 챔버 (F)을 설정할37 ° C까지 loor 온도.
- 각 인큐베이터 아래 배양 모듈 은행을 클릭합니다. 37 ° C로 은행의 온도를 조절합니다.
- 버퍼 챔버 운영
- 워크 플로우의 지연을 방지하기 위해 초기에 지정된 태스크 (먹이, 분할, 염색 등)에 필요한 모든 물품을 수집. 자유주의로 70 % 에탄올로 모든 재료를 스프레이하고는 층류 후드에서 건조 할 수 있습니다. 플라스크 또는 세포의 판을 분사하지 마십시오 - 70 % 에탄올로 포화 멸균 거즈 스폰지로 부드럽게 닦아냅니다.
- 확실히 두 버퍼 챔버의 외부 및 내부 문이 제대로 닫혀을 확인합니다. 그런 다음 외부 문을 열고 내부의 항목을 배치합니다.
- 외부 도어를 닫습니다. 소프트웨어 내에서 버퍼 모듈을 선택하고, 희석 배수 탭을 클릭합니다. 로그 인자 상자에 1을 입력합니다. 시작을 클릭합니다.
참고 : A "희석 배수"는 의미로 정의되는 버퍼 모듈의 분위기 것진공 청소, HEPA 필터 가스로 1 시간 교체 될 수있다. - 그래픽 인터페이스 "가 희석 팩터를"점멸을 중지하면, 버퍼 챔버의 내부 도어를 열어 처리실 내부의 물질을 가져온다.
주의 : 이제까지 내부와 외부 도어가 동시에 개방하지 않도록하고, 버퍼 챔버는 희석 배수 후의 않은 경우 내부 도어를 열지 않는다. - 프로세스 챔버로부터 아이템을 제거하기 위해, 먼저 상기 버퍼 챔버는 희석 배수를 행한 것을 보장한다. 그런 다음, 안쪽 문을 열고 항목이 내부에 제거 할 수 놓고 내부 덮개를 닫습니다. 그런 다음 외부 문을 열고 항목을 제거합니다.
참고 : 희석 배수가 외부 도어를 열기 전에 실행 할 필요가 없습니다.
2. 소개 및 먹이 세포
- 인큐베이터 설치
- 각 인큐베이터의 바닥에있는 물을 냄비에 3 배양 접시를 놓습니다. steril 이러한 요리를 채우기전자 물. 직접 물 냄비를 작성하지 마십시오. 그들은 044의 상대 습도 (RH) 세트 포인트를 유지하는 중요한 것처럼, 이러한 음식의 물 수준을 유지한다.
- 그래픽 인터페이스 내에서 인큐베이터를 클릭합니다. 세트 포인트에서 상대 습도 (RH)에 대한 기존의 값을 클릭하고 85 %를 입력합니다. 이 값을 허용하도록 녹색 확인 표시를 클릭합니다.
- 세포에 대한 세포 생산 설비의 제조
- 아직 수행되지 않은 경우, 버퍼 챔버, 처리 챔버, 및 도입되는 세포의 유형에 요구되는 가스의 세트 포인트를 조절 배양기.
- 멸균 거즈와 비 가연성 살균제와 공정 챔버의 표면을 청소합니다. 강한 닫힌 시스템에서와 같이, 어떤 초산 계 소독제를 사용하지 마십시오, 느린 증기는 포유 동물 세포에 독성. 대신, 염화 벤잘 코늄 기반 제품을 사용합니다.
- 소독 계속합니다. commo있는 장갑과 표면을 청소할수 있답니다는 문 손잡이로, 만졌다. 공정 챔버에서 초과 액체 습도, 응축 가능한 미생물의 성장에 기여하는 바와 같이, 철저하지만 드물게 소독제를 사용합니다.
- 층류 후드의 표면을 청소하고 70 % 에탄올로 챔버를 버퍼링하고, 건조 할 수 있습니다. 에탄올로 포화 멸균 거즈 스폰지와의 외부 표면을 닦아 후드에 (우리의 경우, PSC를 또는 NSCs을의) 세포의 플라스크 또는 플레이트를 놓고 잠시.
- 버퍼 챔버에서 플라스크 또는 판을 넣고 희석 인자 (단계 1.2.3)를 실행합니다.
- 희석 인자 종료 후 즉시 플라스크를 이동하거나 적절한 배양기 접시. 인큐베이터가 공정 챔버의 뒤쪽에있는 바와 같이, 셀 배치 프로세스 챔버에 선반을 당긴다. 프로세스 챔버의 공기를 인큐베이터에 비해 매우 건조한 같이 장시간 또는 불필요 인큐베이터 도어를 개방하지 않도록하고, 상당한 초래할 것인큐베이터에서 습도의 손실.
- 세포 배양 먹이
- 매체 구성 요소, 혈청 피펫, 전자 피펫, 거즈와 살균제를 수집합니다. 또한 소비 세포 배양 배지 용 폐기물 용기를 수집하지만, 표백제를 기입하지 않는다. 섹션 1.2에 기재된 바와 같이, 버퍼 챔버를 통해 처리 챔버로 재료를 준비한다. 전술 한 바와 같이, 처리 챔버 내에서 세포 배양 배지를 준비 9,10 (또한 재료 표 참조)
- 최적의 작업 공간을 사용하는 방식으로 물질을 배열. 프로세스 챔버의 중앙에 사용되지 않는 항목을 두지 않는다.
- 약간 캡핑 미디어 컨테이너를 떠나하여 시스템 내에 존재하는 CO 2와 O 2 수준 평형 수있는 매체 허용합니다. 일부 PSC 매체 제조업체는 37 ºC에서 미디어를 따뜻하게하지 나타냅니다; 이 경우, 상기 매체를 평형화 버퍼 챔버를 사용한다. 중동 허용dium을 20 분 동안 평형.
- 적절한 stereological 피펫과 전자 피펫을 사용하여 우물에서 기존의 매체를 제거합니다. PSC를 들어, 공급 과정에서 탈수를 방지하기에 충분히 오래 매체 적은 잔량하지만 모두 제거한다. NSCs의 경우, 기존 매체의 절반을 제거합니다. 피펫 폐기 용기에 폐기물.
- 원래 포장지에 다시 사용 피펫을 배치하고 처리 챔버 측으로 이동하거나, 폐기물 제거를 위해 지정된 버퍼 챔버 내로. 신선한 멸균 혈청 학적 피펫으로 배양 플레이트 셀과 지정된 인큐베이터에 다시 접시를 배치하는 새로운 배지를 추가합니다.
- 공급의 마지막에, 살균제 거즈 스프레이 철저히 처리 챔버의 바닥과 문 손잡이를 청소. 여러 세포주 시스템에서 재배되고있는 경우, 각각의 세포주를 공급 사이에 소독. 이것이 교차 오염의 위험을 최소화.
- 완료되면, 폐기물 제거버퍼 챔버 중 하나를 통해 또는 다른 불필요한 항목.
3. 분할 세포 배양
- PSC를 또는 NSCs을의 효소과 Passaging
- 계대에 필요한 모든 항목을 수집합니다. 이것은 매체, 효소 또는 비 효소 적 세포 해리 완충액을 포함하고 (후자는 NSCs을위한 전용) DPBS, 플레이트 또는 플라스크, 세포 외 기질 (ECM), 원추형 튜브 및 혈청 피펫. 버퍼 챔버를 사용하여 시스템에 그들을 가져옵니다.
- ECM와 코트 신선한 플레이트 또는 플라스크는 앞서 9, 10을 설명했다. 마우스 육종 세포주에서 유래 된대로에는 Alert 일부 ECM들 - 4 ~ 15 ° C 사이에만 액체, 그래서는 가열 공정 챔버에서 작업하는 동안 ECM 감기를 유지하기 위해 살균 감기 블록 또는 겔 얼음 팩을 사용합니다.
- 피펫 문화에서 소비 된 매체 오프 및 폐기물 용기에 폐기하십시오.
- 잘 DPBS / 1 ㎖를 사용하여 잘 또는 술병 표면을 씻어하고 DPBS 폐기하십시오.
- 추가 1-2각 웰에 따뜻한 효소 ml의. 매우 조밀 한 문화 2 ml의 필요합니다.
- 즉시 현미경 챔버로 배양 접시 또는 플라스크를 이동, 조심스럽게 문화를 관찰합니다. 접시를 완화하기 시작 개별 셀의 흔적을보세요. 세포가 다음 단계로 진행하기 전에 현탁액에 떠 때까지 기다리지 마십시오.
- 주요 공정 챔버에 세포를 돌려줍니다. 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여, 효소의 각각 1ml를위한 DPBS 4㎖를 추가하고 강제적 웰 표면으로부터 셀을 제거하도록 상하 피펫과. 다중 벽 플레이트에서 여러 우물을 계대 경우, 잘 개별 우물에서 세포를 빠지 전에 각에 DPBS를 추가합니다.
- 적절한 크기의 원뿔형 튜브에 효소 PBS 세포 현탁액을 전송.
- 원심은 셀 생산 설비에 사용할 수없는 경우, 단단히 원추형 튜브를 밀봉 버퍼 챔버에 배치하고, 도어가 닫힌 씰.
- 버피에서 원뿔 튜브를 제거층류 측으로부터 FER 챔버 및 RT에서 5 분 동안 100 XG에서 세포를 스핀.
- 70 % 에탄올로 원뿔형 튜브 스프레이 및 버퍼 챔버 및 희석 배수를 사용하여 처리 챔버로 가져.
- 상청을 피펫 오프, 및 PSC 또는 NSC 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁. PSC를를 계대 경우 이전에 9,10을 설명한대로, 10 μM의 농도로 배지 ROCK 저해제를 포함해야합니다.
- 혈구를 이용하여 세포 수 및 필요한 웰 또는 플레이트의 수를 결정한다. / cm 2 1 × 10 5 세포 - 5 × 104에서 플레이트 PSC를. 2 비율 : 1에서 NSCs을 분할합니다.
참고 : NSCs을 자주 덩어리와 혈구 정확한 계산에 저항. - 세포를 동결 보존이 필요한 경우 적절한 프로토콜 9,10 따르지만, 모든 공급 냉동 매체를 미리 준비하고, 상기 공정 챔버 내에 위치되도록. DMSO는 37 세포에 매우 독성6, C, 그래서 매우 빠르게 작동합니다. 층류 후드에서 RT에서 이소프로판올-재킷 동결 용기를 보관하십시오. 냉동 보관 튜브가 작성 및 밀봉되면, 즉시 버퍼 챔버를 통해 전달하여 공정 챔버에서 튜브를 제거합니다.
- PSC를 수동과 Passaging
- 문화는 이전 8 설명한 바와 같이, 계대 할 필요가 있는지 확인합니다. 그렇다면, 신선한 플레이트 또는 세포 외 기질로 코팅 플라스크를 준비합니다. 그런 다음 완전히 매체를 변경합니다.
- 살려주 양 불연성 소독제에 적신 멸균 거즈와 현미경 실 청소 - 너무 많이 실을 초과 흐림 발생합니다. 만 장갑, 바닥 면적, 무대를 청소하십시오. 챔버에 여러 개의 200 μL 1,000 ㎕의 개별 포장 피펫 팁을 가져옵니다.
- , 현미경 실에 PSC를의 판을 가져와 뚜껑을 제거하고는 갓 청소 바닥에 내려 놓는다. 뚜껑을 위로두면 밑면 일세를 노출ectly 공기 흐름, 그리고 잠재적 인 오염.
- 피펫 팁을 푸는하고, 문화를 시각화 피펫의 팁을 사용하여 좋은 형태가 식민지를 따로 선택하는 현미경을 사용.
참고 : 개별 사용자가이 더 편안를 발견하면 피펫 팁은 피펫에 부착 될 수있다. - 접시에 뚜껑을 교체하고 다시 공정 챔버 플레이트를 이동합니다.
- 새로운 판에서 초과 ECM 오프 피펫하고 새로운 판 (서스펜션의 식민지 조각을 포함) 이전 판에서 용지를 전송합니다. 이전 판은 아직 포착 할 준비가되어 있지 않은 식민지가 포함 된 경우뿐만 아니라 그것을 먹이.
4. 전문 문화 기술
- PSC를에 섬유 아세포의 센다이 형질 도입
- 셀 생산 설비에서, 5 % O 2에서, DMEM / F12, 10 % FBS, 20 ng의 / ㎖ FGF2 섬유 아세포를 함유하는 배지에서 인간의 피부 섬유 아세포 (1) 확장. 6 웰 배양 dishe를 사용하여0.1 % 젤라틴으로 코팅 s는.
- 준비 세포를 0.25 % 트립신 1 ㎖로 해리 웰당로 형질 도입된다. 1 ml의 섬유 아세포 배지에서 트립신 불활. 200 XG 스핀은 섬유 아세포 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 혈구를 사용하여 계산.
- 재현 탁 2.0 × 105 2 ml의 섬유 아세포 배지에서 세포와는 젤라틴 코팅 된 6 웰 플레이트 (2.1 × 104 세포 / ㎠) 1 웰에 세포 현탁액을 추가한다. 다시 인큐베이터에있는 세포를 넣습니다.
- 세포가 접시의 바닥에 부착하기위한 24 시간을 허용합니다.
- 상기 프로세스 챔버 내부의 신선한 섬유 아세포 배지 (형질 도입되는 세포를 웰당 배지 1 ㎖)을 배치하고,이 가스에 평형을 허용한다.
- 70 % 에탄올로 예비 냉각 된 저온 살균 블록 및 버퍼 챔버에 배치. 상업용 냉장 블록을 사용할 수없는 경우 잘라 구멍에 겔 얼음 팩을 사용합니다.
참고 :이 있습니다 3-4 별도의 센다이빨리 해동하지만, 한 번 해동 추위 블록에 보관해야합니다 (전달 키트의 버전에 따라) 바이러스. - 15 초 (튜브 잠수함하지 않음)에 대해 37 ° C를 물을 욕조에 튜브의 아래쪽을 찍어 즉시 70 % 에탄올로 튜브 외관을 청소합니다. 상기 버퍼 챔버 내의 저온 살균 블록에 튜브를 배치하고, 희석 배수를 실행.
- 신속하게 작업의 평형 매체 (2) 각 센다이 재 프로그래밍 바이러스의 필요한 볼륨을 추가합니다. 셀의 수, 각 바이러스의 역가, 각 바이러스 감염의 바람직한 다중 - 볼륨이 세 가지 변수들에 의해 결정된다. 추천 MOI의 키트 설명서를 참조하십시오. 수식은 다음과 같습니다
바이러스의 μL 필요 = / (바이러스 역가) (1,000) (감염의 다수를) (세포의 수는 형질 전환되는)] - 세포의 잘 (들)에서 상층 액을 제거하는 재 프로그래밍한다. 각 웰의 경우, 메디 1 ㎖를 추가음 바이러스를 포함. 부드럽게 미디어가 쏟아지지 않도록주의하면서 판 바위, 다시 5 % O 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 2 시간 후 조심스럽게 다시 판을 바위와 또 다른 2 시간 후에 다시 반복합니다.
- 24 시간 (1 일 후 형질) 후, 다 능성 줄기 세포의 배지 1 ㎖로 웰 피드. 2 일에 반복하지만, 우물에서 매체를 제거하지 마십시오.
- 일 3 및도 4에서, 배지의 절반을 변경.
- 5 일 이후에, 전체 매체를 변경합니다.
- 식민지가 표시되면, 이전에 2 설명 된 바와 같이, 식민지가 능성 참임을 확인 멸균 항체를 사용 문화를 얼룩. 먹이 셀 같이, 항체를 포함하는 PSC 매체 셀 생산 설비의 가스로 평형화되었는지 확인.
참고 : 성공적인 프로그래밍에서, IPSC 식민지가 전달 1 일 이후 현재 약 이주해야합니다. - 식민지는 큰 성장하면충분히, 3.2 절에 기술 된 바와 같이, 표시 및 ECM 코팅 된 플레이트 상에 기계적으로 통과를 위해 현미경을 사용합니다.
- 이전에 9,10을 설명한대로 수동으로 또는 효소 식민지를 확장합니다.
5. 정리 후 매일 사용
- 멸균 버퍼 챔버로, 액체 폐기물 플라스크를 포함한 모든 폐기물을 놓습니다. 프로세싱 챔버의 표면을 멸균 거즈 불연성 소독제 공급하여 접촉하는 모든 영역을 닦아 낸다.
- 버퍼 챔버에서 모든 고체 폐기물을 제거하고, 적절한 폐기 용기에 버린다.
- 적절한 폐기 용기에 액체 폐기물을 폐기하거나 표백제와 혼합 및 드레인을 붓는다. 비누와 브러시와 함께 폐기물 용기를 청소합니다. 70 % 에탄올로 소독 용기와 버퍼 챔버를 통해 다시 상기 공정 챔버로 이동합니다.
주 :이 글은 표백제를 사용하지 않는 것이 좋습니다표백제 연기가 재순환 및 세포 배양을 해칠 수 있으므로 폐기물 용기는, 시스템 내부에있다. - 위생 고려 사항은 70 % 에탄올로 시스템의 프로세싱 챔버의 전면 플라스틱 표면을 닦아. 이것은 사용자의 이마에서 땀과 피부에 오일을 청소하는 데 도움이됩니다.
- 결로가 공정 챔버 내부에 내장 된 경우, 결로을 취소하는 희석 배수를 실행합니다. 이 적어도 1 시간을 완료 할 수 있습니다.
6. 일상 비 일상적인 작업
- 필요한 경우 멸균 증류수로 세포 배양 인큐베이터에서 물 요리를 보충. 적어도 일주일에 한 번 요리를 맨. 그러나, 증발 속도가 인큐베이터 문을 열 빈도에 따라 변동될, 문화 액체의 부피, 인큐베이터 설정.
- 한 달에 한 번, 모든 챔버에서 O 2 및 CO 2 설정을 재조정. 이 SPAN (교정) 가스, 계속의 사용을 필요로AINS 참조 표준으로서 O 2, CO (2)의 농도 수준을 공지. 확실히 교정을 시작하기 전에 적절한 SPAN 가스 공급이 있는지 확인하십시오. 시스템은 가스 농도를 검출하기 위해 각 모듈 내에있는 특정 가스 센서를 사용한다; 따라서, 고품질 SPAN 가스의 사용은 센서가 안정적으로 정확하게 가스 농도를 산출 것을 보장한다.
- 정기적 처리실과 현미경 챔버 장갑을 장착. 에 관계없이 시스템이 사용되는 빈도의, 2 개월마다 장갑을 교체합니다. 설치하기 전에, 살균제와 새 장갑을 소독. 장갑을 교체 한 후 공정 챔버에 희석 배수를 실행합니다.
참고 : 시스템의 팔목 위에 뻗어 때 니트릴 장갑 물리적 응력 및 열 노출 영역에 구멍을 개발하는 경향이있다. 이것은 정상적이고 불가피한 마모입니다. - 매 6 개월마다 모든 방에서 주사기 필터를 변경합니다.
- t 교체하거나 세척이 더러운 나타나기 시작으로 그는 즉시 층류 후드에 프리 필터.
- 주요 부품의 교체에 대한 정보를 정기적으로 제조업체의 문서를 참조하십시오.
시스템 7. 청소
- 세포 배양의 대부분에 영향을 미치는 주요 오염 이벤트의 경우에는 영향을받지 인큐베이터 (가능한 경우) 시스템에서 살아남은 세포 배양 이동하거나.
- 영향을받지 인큐베이터의 제외한 모든 챔버의 가스 제어 전원을 끕니다.
- 장치의 유연성 전면 패널을 제거하고 영향을받는 세포 배양 인큐베이터에서 스테인레스 스틸 선반을 제거합니다. 또한 물 팬을 제거합니다.
- 인큐베이터 선반과 물을 냄비 압력솥 및 인큐베이터에 다시 넣어. 70 % 에탄올로 인큐베이터의 내부 표면을 닦아주십시오. 에탄올이 증발 할 수 있도록 허용하고, 인큐베이터 덮개를 닫습니다.
- 70 % 등으로 처리 및 현미경 챔버의 표면을 닦아한올. 장치의 전면 패널을 장착합니다.
- 불연성 소독제 영향 배양기의 포함하여, 장치의 내부 표면을 닦아 낸다. 영향을받는 보육 개방의 문을두고 공정 챔버에 희석 배수를 실행합니다. 현미경 실의 문을 열 수도 있는지 확인합니다.
- 세포 배양 인큐베이터의 일상적인 청소를 들어, 인큐베이터 및 공정 챔버가 같은 대기 설정으로되어 있는지 확인하십시오. 인큐베이터 문을 열고 공정 챔버의 표면에있는 모든 세포 배양 접시를 놓습니다.
- 불연성 살균제와 인큐베이터 선반 및 내부 표면을 닦아주십시오. 살균제가 증발 할 수 있도록, 다시 인큐베이터로 세포 배양 이동합니다. 세포 배양 건조되도록을 피하기 위해 가능한 한 빨리 작업 할 수 있습니다.
결과
이 원고 일부 상세 셀 생산 설비 및 폐쇄 시스템 내부의 세포를 배양의 고유 한 특징을 설명한다. 셀 생산 설비의 대부분은 작은 크기를 가지며 쉽게 6 × 7.5 m 2 실 (도 2) 내에 수용 될 수있는 특별 주문품, 묶인 세포 배양 장치를 포함한다. 짧은 시간에 실험실 요원 또는 환경에 노출 장치 내의 세포이다. 이 장치는 여러 모듈로 구성하는 처리 챔버, 층류 후드는 후드와 프로세스 챔버, 두 세포 배양 인큐베이터, 처리 챔버에 인접한 현미경 챔버 사이에서 2 버퍼링 에어 록 챔버 (도 3). 이 시스템은 환경 변수 (도 1)를 제어 및 모니터링 할 수 있도록 소프트웨어에 의해 제어된다. 이 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터가 무정전 전원 공급 장치입니다. 가스 번째에 공급산소, 질소 및 이산화탄소 (도 4)에 대한 매니 폴드의 집합으로 전자 시스템. 액티브 세트 및 예약 설정 - 장치의 가스 탱크 두 세트의 각이 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 활성 세트가 아래로 그릴 때, 매니 폴드는 자동으로 예약 설정 및 직원 위해 교체 탱크로 전환됩니다. 전원 백업 발전기 시스템이다.
능성 및 신경 줄기 세포는 신규 장비에 고유 한 추가 합병증, 이전에 개발 된 프로토콜 (9)를 사용하여이 기능에서 저산소 조건에서 재배 할 수있다. 다 능성 줄기 세포를 분리하고 확장된다 완전히 형질 콜로니를 식별 능성 특이 항체를 사용하여, 센다이 바이러스를 이용하여 유도 될 수있다. (도 5A와 B)이 iPSCs로부터, 신경 줄기 세포와 뉴런 듀얼 SMAD 억제를 유도하여, 그 표현형은 USI를 검증 할 수있다 NG NSC 특이 항체 (도 5c 및 D).
셀 생산 시설에 대한 그림 1. 그래픽 인터페이스. (A)에 CPF의 그래픽 표현은 기본 화면입니다 (그림 1 층) 그림 3. 버퍼 모듈 1 위에 마우스의 클릭으로 표시되는 CAD 도면과 일치 O 2 값 (도 3, 3) 상기 처리 챔버와 일치하도록 설정되어 그 제어 화면 (B)를 연다. 마찬가지로, 프로세스를 클릭 회의소 또는 인큐베이터 1 값이 적절하게 변경하거나 모니터링 할 수 있습니다 각각의 제어 화면 (각각 C와 D를) 나타납니다. rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
는 셀 생산 설비 2. 그림. (A) 정면 우에서 본 시스템. 오른쪽에있는 현미경 액세서리 및 컴퓨터와 천장의 전력 및 가스 연결 및 카트를합니다. (B) 우측에서 본 상기 버퍼 모듈에 액세스 도어와 층류 후드. 후방에 볼 (C) 두 인큐베이터 (블랙 도어)와 프로세스 챔버. (D) 시스템의 오른쪽 통해보기 현미경을 보여주는 거리에서 볼 버퍼 챔버에 문을 모니터링 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
셀 생산 설비도 3. CAD 드로잉. 장치 들어가는 모든 항목은 제 층류 후드에서 건조시켜 알코올과 공기 닦여 (1). 항목은 다음 UCPC 모듈에 전달되기 전에 프런트 버퍼 모듈 (2 층)에서 적절한 분위기로 전환하거나하는 공정 챔버 (3). 세포는 두 인큐베이터 (4, 5)에서 배양한다. 라이브 세포 얼룩, 식민지 따기, 일반 세포의 형태 및 마이그레이션 분석의 평가는 UPC 모듈에서 발생, 또는 현미경 회의소 (6). 마지막으로, 폐기물 후면 버퍼 모듈 (2R)를 통해 시스템을 종료합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. < / P>
가스 및 전력 그림 4. 소스. (A)는 실험실의 모든 인큐베이터 공급과 같이 CO 2 매니 폴드는 4 × 4 설정입니다. (B)이 O이 매니 폴드는 2 × 2 셋업 및 용품에만 셀 생산 설비가있다. 시스템의 질소는 또한 자동으로 (왼쪽 아래) cryofreezers을 채 웁니다 (오른쪽) 액체 질소 매니 폴드에 부착 (바로 종료 기호 아래에, C) 기화기에서 발생한다. 매니 폴드 (160)는 L 액체 질소 탱크 두 쌍에 의해 제공되는 2 × 2 설치된다. CO 2, O 2, N 2 차단 장치 (D)를 통해 천장에 공급된다. 주택의 진공는이 위치에 공급된다. 시스템에 전원을 공급하는 전원 케이블의 한 쌍의 바로 공급 가스 차단 장치 뒤에 본.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
센다이 바이러스에 저산소증에서 파생 된 그림 5. 다 능성 줄기 세포. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (명칭 스토 버 등. 구에 있음), 위상 대비 10 배. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs는 AF-594 표지 트라-1-60, 1 라이브 스테인드 : 미디어 100 희석. 모든 iPSCs 센다이 바이러스, 5 % O 2의 셀 생산 설비에 형질 도입 하였다. 챔버 슬라이드에 5 % O 2에서 성장 SC68.1 - UH0-2I0 - M0S13 - N2G6 IPSC 파생 NSCs의의 (C) 단계의 대비,. 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 항 - 인간 네 스틴 차 항체로 염색 알렉스 488 차 항체 하였다. 모든 규모의 바 (100)에있다1;. m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
그들이 다시 챔버를 현미경하고 챔버를 처리하는 인큐베이터에서 이동할 때 CPF에서 성장 세포는 산소 또는 이산화탄소 농도의 변경을 볼 수 없습니다. 각 실의 조건이 세포 배양기에서 제거되기 전에 세포가 유지되는 특정 인큐베이터에 일치하는 것이 중요합니다. 장치 내의 분위기가 연속적 HEPA 여과하고 산소와 이산화탄소의 농도와 관련하여 정의 할 수 있습니다. 세포 또는 PSC를 NSCs의 5 %는 각각 9 %, 표준 농도에서 성장 될 수있다; 또는 대안 농도는 다른 세포 유형 또는 특정 실험을 위해 선택 될 수있다. 따라서, 상기 장치는 의료용 산소, 이산화탄소 및 질소 (도 4)의 일정한 소스로 공급된다. 이 가스의 세 가지 상수 공급을 위해 가스 관련 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 상기 장치는 또한 교정 가스 혼합물로 이루어진 공급되고산소 10 % (± 0.01 %), 이산화탄소. 상기 매니 폴드 시스템은 셀 생산 설비 밖에 수용하고 가스가 천정 설비에 배관되어있다. 교정 가스 설비 내에 수납된다. 장치는 또한 또한 천장을 통해, 집 진공와 함께 제공됩니다. 송신 장치를 전자 제어 시스템을 사용하여 무선 모든 매니 폴드의 출력 압력을 지속적으로 모니터링한다. 모든 압력 범위를 벗어날 경우, 상기 셀 생산 설비 오퍼레이터는 자동적으로 전화를하고 적절한 조치를 취할 수 있도록 통지한다.
장치의 전력 요건은 천장 내림차순 여섯 120 V 전용 회로에 의해 충족 일정한 공급을 보장하기 위해 병원의 백업 발전기에 접속된다. 장치의 작동은 무정전 전원 공급 장치를 통해 구동되는 PC 기반 컴퓨터 소프트웨어를 통해 제어된다. 이러한 전원과 컴퓨터 준비확인이 계속에도 공용 전력 시스템 장애 발생 시스템 기능. 상기 장치를 제어하는 소프트웨어는 산소 및 이산화탄소 농도의 제어뿐만 아니라, 온도, 습도, 및 챔버 압력을 허용하는 사용자에게 친숙한 그래픽 인터페이스 (도 1)을 갖는다. 모든 이들 파라미터의 값은 연속적으로 모든 장치 파라미터의 주행 기록을 제공하기 위해 기록된다. 이 데이터 무결성을 보호하기 위해 매일 밤마다 원격 서버에 백업됩니다. 컴퓨터 및 소프트웨어 평가 및 / 또는 매개 변수를 변경하려면 관리자 사용자가 원격으로 액세스 할 수 있습니다. 또한, 컴퓨터 소프트웨어는 장치 파라미터 대화식 평가를 허용하고 로컬 사용자와 해결 원격으로 액세스 될 수있다. 부가 경보 전송 장치는 상기 장치에 접속되어 전지의 생산 시설 운영자가 장치의 모든 범위를 벗어난 상태를 통지되도록. 원격 액세스 Capabilities은 로그인하고 범위를 벗어난 조건의 세부 평가 할 수 있습니다.
장치는 모듈 형 시스템으로 모두 매크로와 마이크로 의미로 설계되어 있습니다. 이러한 인큐베이터 및 처리 챔버 등의 개별 세포 배양 모듈은, 서로에 대하여 그들의 크기 및 요구 사항에 관해서뿐만 아니라 레이아웃에 정의 될 수있다. 또한, 각 모듈의 제어 기능의 대부분은 자체 모듈 같은 개별 분위기 가스 컨트롤러, 예를 들어, 용이하게 시스템의 상당한 중단없이 교체 될 수있다.
이러한 미세 시각화 및 세포 배양의 조작 하나로 특수 처리 챔버가 쉽게 시스템에 적합하다. 두 위상차 형광 현미경은 살아있는 세포 염색 할 수 있도록, 시스템 (도 6) 내부에서, 그리고 콜로니 t 내부와 같은 대기 조건에 절개 될 수있다그는 인큐베이터. 처리 챔버의 측벽에 밀봉 고리를 통해 케이블 라우팅 전원 공급 장치 및 시스템은 일반적으로 카트 (도 6)에서, 상기 장치의 외부에 유지되어야하는 등의 장치를 허용한다.
셀 생산 설비의 공정 챔버는 종래의 BSC는 상이한 기류 패턴을 갖는다. 기존의 BSC들에서, 공기 흐름은 중앙 배기구에서 아래로 흐르는 다음 캐비닛의 바닥의 전방 및 후방 부분에 두 개의 서로 다른 흡기구에 의해 흡수되는 두 개의 스트림으로 분할합니다. 대조적으로, CPF 천장의 전방 부에서 단일 배출구를 갖는다. 공기는 하향으로 그리고 그 후 흡기 벤트에 상향 인출되는 챔버의 후방을 향해 유동한다. CPF는 본래 매우 청결하지만,이 독특한 기류 패턴 기술자 약간 오염의 위험을 줄이기 위해 자신의 기술을 조정해야한다는 것을 의미한다. 기존의 BSC, 실험실 작업자들과 마찬가지로오픈 세포 배양 접시와 미디어 병의 상류에 손을 배치 hould 마십시오. 그러나, 상류 측 방향은 CPF에 변경되었는지
셀 생산 설비 실험실 자체가 상당히 표준이며, -20 ° C의 냉동고가 장착되어, -80 ° C의 냉동고, 4 ° C 냉장고, 원심 분리기, 수욕. 실험실은 편리한 핸즈프리 작동을위한 발 컨트롤 싱크대가 있습니다. 기능성 임상 셀 생산 설비가되는이 실험 위해서는 그러나 여러 추가적인 변형이 여전히 이루어져야한다. 우선, 상기 장치 자체는 휘발성 유기 화합물, 미립자 및 오염 제거에 사용되는 이산화 염소의 농도를 모니터링 할 수있는 능력이 업그레이드되어야한다. 둘째하는 FACS 시스템을 포함하는 처리 챔버를 수용하고 버퍼 모듈을 통해 상기 장치의 나머지 부분에 연결될 수있다. 이것은 셀 정렬 및 TR 정화용 허용적절한 환경 조건 하에서 ansplantable 세포 집단. 마지막으로, 장치 전체 부드러운 벽 클린 룸 내에 보관되어야한다. 이 장치 (5)에 대한 표준화기구 (ISO) 클래스 8 환경에 대한 국제기구를 제공합니다.
CPF의 높은 불임 및 컴퓨터 제어 특성은 세포 기반 치료 양호한 제조 공정 미래 애플리케이션에 이상적인 시스템을 만든다. 오염의 위험이 크게 완화되어 있지만, 더 중요한 것은, 전지 팽창 조건을 자동으로 기록하고, 컴퓨터 시스템에 의해 보관된다. 가스 농도, 온도, 습도 및 시스템에 액세스하는 모든 이벤트의 편차는 엄격하게 설명되어 있습니다. 제품 품질 문제를 조사하는 경우에 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 여전히 한계가있다. 일체의 시약 및 소모품의 사용은 (예를 들면, 미디어 구성 요소, 피펫, 플레이트) 별도로 문서화해야합니다. 더하다itionally의 CPF의 모니터링 시스템에 의해 문서화 변수는 전혀 관련이있는 발생할 수있다 (인간의 오류의 다양한 형태 포함) 잠재적 인 문제의 다수가 있습니다. 따라서, 고도로 훈련 된 인력과 작업에 대한 자세한 설명서 설명서에 대한 필요성이 장소에 남아 있습니다.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 Xvivo 동봉 된 세포 배양 시스템, 특히 매트 프리먼를 사용하는 학습에서의 도움을 Biospherix에서 직원을 인정하고 싶습니다; 마일즈 & 켈리 건설 회사, 실험실 인프라, 특히 러스 휴즈를 설정에서 자신의 작품에 대한 Inc.의 직원; 실험실 리모델링, 특히 아담 Lukhard와 데빈 Hugie 조정에 업무 시설 및 지원 서비스의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 데이터 관리 인프라 및 원격 액세스, 특히 베트남 트란을 설정하는 그들의 도움에 대한 정보 시스템의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 프로젝트, 특히 박사 마리아 Minon와 브렌트 Dethlefs 자신의 오랜 지원을위한 오렌지 카운티 경영진 팀의 아동 병원. 이 작품은 어린이 오렌지 카운티의 병원 회생 Medicin에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 투자되었다PHS에 부여 TR3-05476을 통해 전자. 모든 저자는이 작품에 동일하게 기여했다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | 버전 i.o.2.1.2.1 | |
| O2 매니폴드 | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 매니폴드 | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 DP21 | 웨스턴 이노베이터 | CTM75-7-2-2-BM | |
| 현미경 | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered | Sodium Hyclone | 9236 | |
| 섬유아세포 성장 인자 2 | R& D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's 기반 세포 해리 버퍼 | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Life Technologies | 21985-023 | |
| 표피 성장 인자 | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 항체 | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 항체 | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 항체 | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 혈청 보충제 | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 설명 |
| 소모품 | |||
| 2 ml 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml 혈청학적 피 | Olympus | Plastics 12-102 | |
| 10 ml 혈청학적 피펫 | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml 혈청학적 피펫 | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml 혈청학적 피펫 | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-웰 플레이트 | Corning | 353046 | |
| 12-웰 플레이트 | Corning | 353043 | |
| T25 플라스크 | TPP | 90026 | |
| T-75 플라스크 | TPP | 90076 | |
| 20 µ l 피펫 팁 | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ l 피펫 팁 | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 피펫 팁 | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% 에탄올 | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| 표백제 | Clorox | A714239 |
참고문헌
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- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
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