방법 논문

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

2016년 10월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

이 논문에서

요약

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 여기서는 후 시험관 허혈 암수 신생아 새끼의 성상 세포 기능의 기초가되는 메카니즘을 연구하기 위해 거세 해마 성상 세포 배양 프로토콜의 구체적인 방법을보고하고있다.

초록

저산소증 / 국소 빈혈 (HI) - 관련 뇌 손상 다음 Astrogliosis는 신생아의 증가 이환율과 사망률의 역할을한다. 최근의 임상 연구는 뇌 손상의 정도 섹스 의존적으로 나타난 나타내고, 수형 신생아는 유사한 뇌 손상과 여자에 비해 더 심한 신경 결과 결과 HI 관련된 뇌 손상의 영향에 더 민감하다있다. 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 매우 풍부한 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 재산 소화 하였다 시험관 허혈, 산소 - 글루코스 부족의 모델을 거치게되는 특정한 성별 해마 성상 세포 배양 물을 생성하는 방법을 설명한다. 이후 반응 astrogliosis는 immunostai에 의해 조사 하였다아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 및 S100B에 대한 닝. 이 방법은 개별적으로, 신생아 HI 다음 남성과 여성의 해마 성상 세포의 역할을 연구하는 유용한 도구를 제공합니다.

서론

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 증거의 성장 몸은 성상 세포의 역할이 신경 지원을 제공보다 더 있음을 나타냅니다. 사실, 생리 학적 조건에서 아스트로 사이트의 역할은, CNS 혈류량이 조절 현상 축삭 (1)의 이동을 안내하는 시냅스 간질 액 (3)의 pH의 항상성을 유지하고, 혈액 뇌 장벽에 참여 같이 매우 복잡 할 수있다 4 시냅스 전달 (5). 병적 인 조건에서 성상 세포는 성상 세포와 기능 (모욕으로부터의 거리에 대한) 형태, 수, 위치, 지형이 이종 방법 6,7에서 변경 될 수있는 반응 astrogliosis라는 과정을 부상으로 반응한다. 아마 신생아의 이환율과 사망률에 기여 신생아 저산소 성 허혈성 뇌증 다음 볼 Astrogliosis 8입니다.

최근의 임상 및 실험적 연구는 뇌 손상의 정도를 비교하여 수형 신생아는 심한 신경 결과 결과 저산소증 / 허혈 (HI) - 관련 뇌 손상의 영향에 더 민감하다 섹스 의존적으로 나타나고 있음을 나타낸다 비교 뇌 손상 9-11와 여성. 부상의 위치 파악은 임신 기간 및 지속 기간 및 모독의 정도에 따라 다르지만, 해마 용어 신생아 HI 후 CNS에서 가장 흔히 영향 영역 중 하나이며, 해마 astrogliosis가 상향 조절로 확인되었다 증가 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 신생아 HI 7,10,12,13 후 3 일. 성상 세포 기능의 성별 차이는 뇌허혈 14, 15 후 모두 신생아와 성인 설치류에 나타내었다. 또한, 체외 허혈에 남성 성상 세포 감수성이 증가 CEL으로 나타났다문화 (16) 여성 대뇌 피질 성상 세포에 비해 리터의 죽음.

성별 차이에-자궁 시작과 죽음 (17)까지 계속. 지난 10 년간, 세포 배양 및 생체 내 연구 실험 조건에서 남녀 등의 중요성은 의학 및 NIH 연구소의 강조는 생리적, 병리 적 상태 (17, 18)을 볼 성별의 차이에 기초 지식을 추구 할 수 있었다 . 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구는 산소가 / 포도당 박탈 (OGD) 및 재산 소화 (REOX), 유도 다음 GFAP 면역 성상 세포의 역할을 평가하기 위해 신생아 쥐에서 농축 성 별 해마 성상 세포 배양을 준비하기 위해 기술을 제공하도록 설계되었습니다세포 배양 환경에서 HI. 이 기술은 정상 산소 및 허혈성 조건 신생아 암수 해마 성상에 속하는 모든 가설을 테스트하기 위해 사용될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

참고 :이 연구는 국립 보건 연구소의 실험 동물의 관리를위한 가이드의 추천 및 사용에 따라 실시 하였다. 동물 프로토콜은 위스콘신 - 매디슨, 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다. 여기에 제시되는 기본 성상 세포 배양 프로토콜은 장 Y (19) 등. 그리고 젠 기스 20 쪽 등에 의해 제시된 프로토콜에서 채택된다. 일부의 수정.

1. 해마 해부 및 성상 세포 문화

  1. 2 mL의 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 각 가득 얼음에 수술 가위, 부드러운 미세 집게, 플랫 팁 집게, 종이 수건, 쓰레기 봉투, 70 % 에탄올, 2 해부 요리 (3.5 cm 직경)를 포함하여 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다 . 있는지 확인 수술 장비의이다 (오토 클레이브) 이전 절차와 성상 세포 배지 도금 (다른 모든 재료를 사용하여 멸균 : DMEM + 5 % 말 혈청 +1 % 사전 멸균 등의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 말 혈청, HBSS, 0.25 % 트립신, 커버 글라스, 페트리 접시, 50분의 15 ML의 튜브, T25 플라스크 등).
  2. 부드럽게 유지하고 70 % 에탄올로 머리와 마우스 강아지의 목 스프레이 날카로운 멸균 가위를 사용하여 목을 벨 [그림 1 (1)].
  3. 뇌 [그림 1 (2-3)] 노출 두피를 따라 작은 가위로 머리를 전방에 후방에서 중간 선 절개를 수행합니다.
  4. 작은 가위로 코 목에서 조심스럽게 두개골을 잘라. 그런 두개골베이스에서 두개골을 분리하는 소뇌에 두개골 후각 전구에 앞쪽과 열등를 잘라.
  5. 두개골의 바닥에 작은 절개를 확인하고 중간 선을 따라 절단. 두개골을 벗겨 멸균 평면 팁 집게를 사용합니다. 곡선 집게의 도움으로 뇌 줄기를 제거합니다. 두개골에서 뇌를 제거하고 첫 해부 접시에 배치 [그림 1 (4-9)] (2)1.
  6. 곡선 집게를 사용하면, 뇌의 복부면이 위를 향하도록 뇌를 반전하고 날카로운 멸균 수술 블레이드 [그림 1 (10, 11)]와 두 반구를 분리
  7. 껍질 다시 대뇌 반구 조심스럽게 해마, 내측 측두엽 [그림 1 (12 ~ 14)]에있는 작은, 해마 모양의 구조를 나타 내기 위해 멸균 평면 곡선 집게로 돌출 중뇌와 시상 조직을 제거합니다.
  8. 모두 해마 로브 [그림 1 (15, 16)]를 제거하고주의 깊게 미세 집게로 잡아 당겨 로브에서 수막을 해부하다. 이 단계는 수막 세포와 섬유 아세포에 의해 최종 성상 세포 문화의 오염을 방지 할 수 있습니다.
  9. HBSS로 채워진 두 번째 접시에 준비된 해마 로브를 전송하고 얼음 [그림 1 (17, 18)]에 반환. 하마의 준비를위한 - 한 번의 마우스에서 풀을 모두 해마 로브 (P2 P0)campal의 성상 세포 배양. 이 성상 세포 적절한 밀도를 제공한다. 날카로운 멸균 수술 블레이드 (약 4 시간)을 사용하여 해마 로브를 말하다.
  10. 대기음 HBSS 15 mL의 멸균 원뿔 튜브로 전송하고 부드러운 흔들림과 함께 20 분 동안 37 ° C에서 조직을 품어, 혼합, 접시에서 1 mL를 피펫에 부착 된 멸균 팁을 사용하고 0.25 % 트립신의 3 mL를 넣고.
  11. 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 대기음 상등액을 조심스럽게 진공 라인에 연결된 멸균 유리 피펫을 사용. (- 30 ~ 20 배) 조직 조각 균질화 될 때까지 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 매체와 씹다 도금 10 ML의 성상 세포를 추가합니다.
  12. 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 기음 뜨는 및 신선한 데워진 성상 세포 도금 미디어의 2 mL를 넣어. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 메쉬 필터 (셀 스트레이너)를 통해 세포를 전달합니다.
  13. 3 mL를 함유하는 폴리 D 라이신 / 라미닌 코팅 멸균 T25 플라스크 배양 접시 전체 세포 현탁액성상 미디어 도금 후, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 플라스크를 배양한다.
  14. 기념일에 기음 전체 미디어 내가 N-시험 관내 (DIV) 1, DIV 3 DIV 7, 신선한 성상 세포 도금 미디어의 2 mL로 교체합니다. 성상 세포 도금 미디어를 교체하는 동안 광학 현미경마다 진행 및 성상 세포 합류를 관찰한다.
    참고 : DIV 1에서 모든 가능한 성상 세포는 배양 플라스크의 표면과 신경 세포가 뜨는에 떠있다 포함 죽었거나 죽어가는 세포에 부착된다. DIV 3에서, 부착 된 세포는 성상 세포 층을 형성하도록 분할하는 시작한다. 지지 기대 조건이없는 경우, 배양은 신경 세포의 성장이 거의없는 상태이다. 90 % 합류 몇 미세 아교 세포뿐만 아니라 희소 돌기 아교 세포 전구체 셀 성상 층의 상부에 존재 - DIV 7에서 성상 세포 층은 80이다.
  15. 린스, 플라스크에서 도금 매체를 대기음 신선한 데워진 성상 세포 도금 배지 2 ㎖를 추가성상 세포가 합류하고 배양을 서브 할 준비가되면 차, DIV (11)에 다시 제거합니다.
  16. 조심스럽게 플라스크를 몇 번 회전 흡인 트립신은 멸균 유리 피펫을 사용하여, 0.25 % 트립신의 2 ML을 추가합니다.
  17. 0.25 % 트립신 2 mL를 넣고 플라스크 4의 조직 문화 후드에 앉아 보자 - RT에서 5 분.
  18. 트립신을 제거하고 10 분 동안 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 플라스크를 유지한다. 5 ㎖ 중간 도금 성상 세포를 데워진 추가하고 당신의 손의 손바닥에 플라스크를 터치하여 성상 세포 층을 분리 - 완전한 분리를 달성하고 15 ML 원뿔 튜브의 성상 세포를 수집하기 위해 부드러운 저작하여 (3 ~ 4 회).
  19. 원심 분리기 튜브는 5 분 300 XG에, 뜨는을 대기음, 1 mL의 신선한 성상 세포 도금 매체를 추가 할 수 있습니다.
  20. 혈구에 세포 현탁액 10 μL를 추가하고 역 위상차 현미경 (10X 대물 렌즈)를 사용하여 대형 중앙 리딩 된 영역 (1 ㎜ × 2)의 세포 수를 계산. 도난tiply 104 mL로하여 당 세포의 수를 추정한다. 하나 T25 플라스크 ~ 1 × 106 총 해리 세포를 얻을 것입니다. 씨 ~ 1 × 24 웰 배양 접시의 우물에서 12mm 직경 폴리 - D - 라이신 예비 코팅 유리 커버 슬립 2 ML의 성상 세포 도금 배지에서 5 세포.
  21. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션. 14 (2 절) - DIV 12 OGD / REOX을 수행합니다.
  22. 미세 아교 세포없는 해마 문화가 원하는 경우 DIV (11)까지 5 MM의 L - 류신 메틸 에스테르 (LME) 하이드로 클로라이드와 DIV 3에서 성상 세포 배양을 취급합니다. LME 배양 한 후, (1 시간 동안 300 rpm으로)을 흔들어에 따라 문화 미세 아교 세포를 오염 제거합니다.
    주 : LME는 미세 아교 세포 (22) 증식 제거하는 방법으로 광범위하게 사용 된 소교 세포 독성 제입니다.

2. OGD / REOX 치료

  1. 대기음 부착 성상 세포 배양을 포함하는 커버 슬립의 미디어 (DIV 12-14)와 린스 3 회부드럽게 커버 슬립을 (MM에) 포함 1 mL의 등장 OGD 용액 (pH를 7.4)와 몇 번 잡고 24 웰 배양 접시 돌려 : 0 포도당을, 21의 NaHCO3, 120 염화나트륨, 5.36의 KCl, 0.33 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 염화칼슘 2, 0.81 황산.
  2. CO 2 커버 슬립 커버 및 94 % N 2, 1 % O 2를 함유하는 저산소 배양기에서 2 시간 동안 배양하고, 5 % 웰에 0.2 ㎖의 OGD 용액을 추가한다. 부드럽게 가스 교환을 촉진하기 저산소증의 처음 30 분 동안 진탕 기 (50 RPM)로 혼합한다.
  3. 5.5 mM의 포도당을 첨가 제외한 OGD 용액을 동일한 완충액에서 5 % CO 2 및 대기압에서 2 시간 동안 정상 산소의 대조군 세포를 인큐베이션.
  4. 및 REOX, 흡인 OGD 솔루션의 매체를 도금 성상 세포의 2 mL를 넣어. 5 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO 2 대기에서 인큐베이션.

3. 면역 세포 화학 염색법

  1. 진공 라인에 연결된 멸균 유리 피펫을 사용하여 배양 배지를 흡인하고 신속 0.1 M 트리스 완충액 (TBS) 1ml를 추가하여 커버 슬립을 한번 씻어 (154 mM의 염화나트륨, 16 mM의 후, Trizma 자료, 84 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의) 잘합니다. 대기음 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 중 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 2 mL를 넣고. 실온에서 15 분 동안 품어.
  2. 대기음 및 0.1 M TBS의 1 mL를 넣고는, 다음 2 분 동안 흔들 통에 넣습니다. 3 번 반복합니다. 용액 (10 % 염소 혈청, 0.1 M TBS에서 10 ㎎ / ㎖ BSA, 0.025 % 트리톤 X-100)를 차단 한 ML을 추가하고 흔들 통에 37 ° C에서 30 분 동안 품어.
  3. 대기음이 솔루션을 차단하고 기본 마우스 단일 클론 항 GFAP 항체 추가 60 분 : 안티 - HIF1α (200 1) 또는 토끼 폴리 클로 날 (1 0.2 mL의 : 차단 솔루션에 500 희석)와 토끼 다 클론 항 S100B (500 1) 흔들 통에 37 ° C에서.
  4. 마우스 월 : 대안 적으로, 일부 성상은 토끼 다 클론 안티 IBA1 (200 1)와 인큐베이션oclonal 방지 MAP2 문화의 순도에 액세스 할 수 있습니다.
  5. 대기음 차 항체 0.1 M TBS 1 ㎖를 추가하고 2 분 후 흡인을위한 흔들 통에 넣어 coverslip에 린스. 두 번 반복합니다.
  6. 흔들 통에 37 ° C에서 60 분 동안 차단 솔루션에 보조 염소 항 - 토끼 488 - 복합 및 항 - 마우스 568 - 복합 항체의 200 희석 : 1의 0.2 ML을 추가합니다.
  7. 대기음 차 항체와 2 분 후 흡인을위한 흔들 통에 0.1 M TBS 1 ㎖를 추가하고 장소로 coverslip에 린스. 두 번 반복합니다.
  8. 슬라이드 건조기에 위치 슬라이드에 배치하여 잘 건조에서 커버 슬립을 제거합니다. VECTASHIELD의 한 방울에 반전하여 새 슬라이드 마운트 커버 슬립은 DAPI (1.5 NG / μL)를 설치 매체를 hardset.
  9. 하나 20X 건조 또는 60X 오일 목표를 사용하여 공 초점 현미경에 이미지 된 커버. DAPI (405 나노 예 / 450 나노 미터 EM) 및 형광 색소 488에 대한 이미지 (X 512 512)를 취득는 GFAP 항체 태그 (488 나노 예 / 515 nm의여자 이름). 20X 및 60X 그룹 내에서 일정한 획득 매개 변수를 유지합니다.

PCR을 사용하여 4 성 결정

  1. 열 강아지 발가락 또는 50 mM의 NaOH를 45 분 동안 95 ° C에서 손가락 스크랩와 1 M 트리스, 산도 6.8의 동일한 볼륨으로 중화.
  2. Myog 및 SRY 유전자에 대한 프라이머의 5 pmole의, 1 배 반응 완충액, 0.2 mM의 각각의 데 옥시 뉴클레오티드와 8 U Taq 중합 효소 : 다음 혼합물의 19 μL에 추출 된 DNA 용액 1 μL를 추가합니다.
  3. 프라이머 시퀀스를 사용하여; SRY 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3'와 Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3'23.
  4. 1 분 동안 72 ° C에서 15 초 동안 58 ° C에서 15 초, 어닐링 95 ℃에서 3 분 동안 변성 한 후 30 사이클을 95 ° C, 신도 다음 PCR 프로토콜을 수행한다. 이 30 사이클 후, 반응물을 1 분 동안 최종 72 ° C의 신장율로 종결.
  5. 별도의 PCR 제품은 전기 영동에 티듐 브로마이드 함유의 2 % 아가로 오스 겔상에서와 UV 조명 하에서 가시화. (그림 2A.)주의! 에티 디움 브로마이드는 잠재적 인 발암 물질이며주의 깊게 취급 기관의 규정에 따라 적절하게 폐기해야합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 거세 성상 세포 기능의 역할을 이해하는 것은 대단히 관내 조건 하에서이 세포를 배양하여 규명되었다. 성별화 된 배양을 수행의 중요한 측면은 이전의 사용에 마우스 강아지의 성별을 결정하는 것입니다. 우리는 유전자 PCR에 의해 시각적 평가 (그림 2) (16)에 의해 마우스의 성별을 결정했다. PCR을 사용하여 성 결정의 방법론은 McClive과 싱클레어에서 수정을 채택, 빠르고 간단하고 매우 재현 방법 23.도 2a는 PCR을 사용하여 성 결정의 대표 결과를 보여줍니다. PCR 생성물은 두 개의 대표 P1 남성과 여성의 꼬리 자르는로부터 추출 된 DNA와 함께 생성 하였다. 반응은 441 bp의과 여성과 특이 남성 특정 밴드를 생성 SRY 및 Myog 유전자 다중 프라이머 쌍을 포함...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

생리적 및 병리 적 조건에서 아스트로 성 특성의 차이 및 기능을 연구하기 위해, 세포 배양에서 거세 일차 성상의 제조 활용하는 중요한 도구이다. 본 연구에서 우리는 체외 신생아에서 성별화 된 해마 성상 세포의 고농축 균질 인구 (P0-P2) C57BL / 6 (야생형) 또는 K19F (GFAP 널) 마우스 새끼 고효율과 문화에 재현 방법을보고합니다. 이 방법을 설정하면 연구자는 시험관 허혈 후 성별화 된 해마 성상 세포의 생리 학적 및 병리학 적 기능을 이해하는 데 도움이됩니다.

단일 세포 현탁액을 달성하기 위해서는 소화 조직 저작하여 트립신 동안 멸균 및 해마 로브 적절한 소화의 유지를 포함하여이 방법을 설정하는 두 개의 중요한 단계가있다. 에서 차 성상 교세포의 예방오염 점점 배양 과정 전반에 걸쳐 가장 큰 도전 중 하나입니다. 적절한 치료를 채용하지 않은 경우 기술을 수행하는 동안 배양 세포 쓸모 렌더링 할 수있는 오염 물질의 두 가지 일...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자의 아무도는 경쟁하거나 충돌하는 이해했다.

감사의 글

NCATS UL1 TR0000427 및 KL2 TR000428(Cengiz P)의 임상 및 중개 과학 상 프로그램, NIH/NCATS의 UW ICTR 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 UL1TR000427, NINDS(Cengiz P) 및 NIH P30 HD03352(Waisman Center)의 K08 NS088563-01A1, NIH/NINDS 1K08NS078113(Ferrazzano P). GFAP 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Albee Messing 박사님께 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Astrocyte culture media
DMEM, 고포도cellgro10-013-CV
말 세럼Gibco26050-070최종 농도: 10%
Penicillin-StreptomycinCellgro 30-002-CI최종 농도: 1%
L-Leucine 메틸 에스테르 염산염AldrichL1002-25G최종 농도: 5mM
뇌 조직 소화를 위한 용액
HBSSLife Technologies14170-088
트립신cellgro25-050-CI최종 농도: 0.25%
Other
70% (vol/vol) 에탄올Roth9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm 라운드 커버슬립 Corning354087
WaterSigmaW3500세포 배양 등급
PBScellgro21-040-CV세포 배양 등급
0.05% Trypsin-EDTA 생명 기술25300-062
70 μ m 멸균 세포 여과기 피셔 사이언티픽22363548
3.5 cm 페트리 디쉬BD 팔콘353001
15 mL 팔콘 튜브BD 팔콘352096
50 mL 팔콘 튜브BD 팔콘352070
펜치, 세밀 Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
펜치, 플랫 팁KLS Martin12-120-11
13cm 수술용 가위AesculapBC-140-R
컨포칼 현미경NikonA1RSi 
원심분리기Eppendorf5805000.0175804R
Orbital ShakerThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741토끼 단클론
Anti-MAP2SigmaM2320마우스 단클론
Anti-HIF1alphaabcamab179483토끼 단클론
Anti-S100BSigmaHPA015768Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (칵테일)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG)Vector LabsPK-6101에는 4개의 시약이 포함되어 있습니다.
염소 안티 토끼 Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
염소 안티 마우스 Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004
당

참고문헌

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

GFAPS100B

관련 논문