성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 여기서는 후 시험관 허혈 암수 신생아 새끼의 성상 세포 기능의 기초가되는 메카니즘을 연구하기 위해 거세 해마 성상 세포 배양 프로토콜의 구체적인 방법을보고하고있다.
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이 논문에서
요약
초록
저산소증 / 국소 빈혈 (HI) - 관련 뇌 손상 다음 Astrogliosis는 신생아의 증가 이환율과 사망률의 역할을한다. 최근의 임상 연구는 뇌 손상의 정도 섹스 의존적으로 나타난 나타내고, 수형 신생아는 유사한 뇌 손상과 여자에 비해 더 심한 신경 결과 결과 HI 관련된 뇌 손상의 영향에 더 민감하다있다. 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 매우 풍부한 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 재산 소화 하였다 시험관 허혈, 산소 - 글루코스 부족의 모델을 거치게되는 특정한 성별 해마 성상 세포 배양 물을 생성하는 방법을 설명한다. 이후 반응 astrogliosis는 immunostai에 의해 조사 하였다아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 및 S100B에 대한 닝. 이 방법은 개별적으로, 신생아 HI 다음 남성과 여성의 해마 성상 세포의 역할을 연구하는 유용한 도구를 제공합니다.
서론
성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 증거의 성장 몸은 성상 세포의 역할이 신경 지원을 제공보다 더 있음을 나타냅니다. 사실, 생리 학적 조건에서 아스트로 사이트의 역할은, CNS 혈류량이 조절 현상 축삭 (1)의 이동을 안내하는 시냅스 간질 액 (3)의 pH의 항상성을 유지하고, 혈액 뇌 장벽에 참여 같이 매우 복잡 할 수있다 4 시냅스 전달 (5). 병적 인 조건에서 성상 세포는 성상 세포와 기능 (모욕으로부터의 거리에 대한) 형태, 수, 위치, 지형이 이종 방법 6,7에서 변경 될 수있는 반응 astrogliosis라는 과정을 부상으로 반응한다. 아마 신생아의 이환율과 사망률에 기여 신생아 저산소 성 허혈성 뇌증 다음 볼 Astrogliosis 8입니다.
최근의 임상 및 실험적 연구는 뇌 손상의 정도를 비교하여 수형 신생아는 심한 신경 결과 결과 저산소증 / 허혈 (HI) - 관련 뇌 손상의 영향에 더 민감하다 섹스 의존적으로 나타나고 있음을 나타낸다 비교 뇌 손상 9-11와 여성. 부상의 위치 파악은 임신 기간 및 지속 기간 및 모독의 정도에 따라 다....
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프로토콜
참고 :이 연구는 국립 보건 연구소의 실험 동물의 관리를위한 가이드의 추천 및 사용에 따라 실시 하였다. 동물 프로토콜은 위스콘신 - 매디슨, 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다. 여기에 제시되는 기본 성상 세포 배양 프로토콜은 장 Y (19) 등. 그리고 젠 기스 20 쪽 등에 의해 제시된 프로토콜에서 채택된다. 일부의 수정.
1. 해마 해부 및 성상 세포 문화
- 2 mL의 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 각 가득 얼음에 수술 가위, 부드러운 미세 집게, 플랫 팁 집게, 종이 수건, 쓰레기 봉투, 70 % 에탄올, 2 해부 요리 (3.5 cm 직경)를 포함하여 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다 . 있는지 확인 수술 장비의이다 (오토 클레이브) 이전 절차와 성상 세포 배지 도금 (다른 모든 재료를 사용하여 멸균 : DMEM + 5 % 말 혈청 +1 % 사전 멸균 등의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 말 혈청, HBSS, 0.25 % 트립신, 커버 글라스, 페트리 접시, 50분의 15 ML의 튜브, T25 플라스크 등).
- 부드럽게 유지하고 70 % 에탄올로 머리와 마우스 강아지의 목 스프레이 날카로운 멸균 가위를....
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결과
생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 거세 성상 세포 기능의 역할을 이해하는 것은 대단히 관내 조건 하에서이 세포를 배양하여 규명되었다. 성별화 된 배양을 수행의 중요한 측면은 이전의 사용에 마우스 강아지의 성별을 결정하는 것입니다. 우리는 유전자 PCR에 의해 시각적 평가 (그림 2) (16)에 의해 마우스의 성별을 결정했다. PCR을 사용하여 성 결정의 방법론은 McClive과 싱클레어에서 수정을 채택, 빠르고 간단하고 매우 재현 방법 23.도 2a는 PCR을 사용하여 성 결정의 대표 결과를 보여줍니다. PCR 생성물은 두 개의 대표 P1 남성과 여성의 꼬리 자르는로부터 추출 된 DNA와 함께 생성 하였다. 반응은 441 bp의과 여성과 특이 남성 특정 밴드를 생성 SRY 및 Myog 유전자 다중 프라이머 쌍을 포함.......
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토론
생리적 및 병리 적 조건에서 아스트로 성 특성의 차이 및 기능을 연구하기 위해, 세포 배양에서 거세 일차 성상의 제조 활용하는 중요한 도구이다. 본 연구에서 우리는 체외 신생아에서 성별화 된 해마 성상 세포의 고농축 균질 인구 (P0-P2) C57BL / 6 (야생형) 또는 K19F (GFAP 널) 마우스 새끼 고효율과 문화에 재현 방법을보고합니다. 이 방법을 설정하면 연구자는 시험관 허혈 후 성별화 된 해마 성상 세포의 생리 학적 및 병리학 적 기능을 이해하는 데 도움이됩니다.
단일 세포 현탁액을 달성하기 위해서는 소화 조직 저작하여 트립신 동안 멸균 및 해마 로브 적절한 소화의 유지를 포함하여이 방법을 설정하는 두 개의 중요한 단계가있다. 에서 차 성상 교세포의 예방오염 점점 배양 과정 전반에 걸쳐 가장 큰 도전 중 하나입니다. 적절한 치료를 채용하지 않은 경우 기술을 수행하는 동안 배양 세포 쓸모 렌더링 할 수있는 오염 물질의 두 가지 일.......
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공개 사항
저자의 아무도는 경쟁하거나 충돌하는 이해했다.
감사의 글
NCATS UL1 TR0000427 및 KL2 TR000428(Cengiz P)의 임상 및 중개 과학 상 프로그램, NIH/NCATS의 UW ICTR 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 UL1TR000427, NINDS(Cengiz P) 및 NIH P30 HD03352(Waisman Center)의 K08 NS088563-01A1, NIH/NINDS 1K08NS078113(Ferrazzano P). GFAP 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Albee Messing 박사님께 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, 고포도 | cellgro | 10-013-CV | |
| 말 세럼 | Gibco | 26050-070 | 최종 농도: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 최종 농도: 1% |
| L-Leucine 메틸 에스테르 염산염 | Aldrich | L1002-25G | 최종 농도: 5mM |
| 뇌 조직 소화를 위한 용액 | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 트립신 | cellgro | 25-050-CI | 최종 농도: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) 에탄올 | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm 라운드 커버슬립 | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | 세포 배양 등급 |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | 세포 배양 등급 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 생명 기술 | 25300-062 | |
| 70 μ m 멸균 세포 여과기 | 피셔 사이언티픽 | 22363548 | |
| 3.5 cm 페트리 디쉬 | BD 팔콘 | 353001 | |
| 15 mL 팔콘 튜브 | BD 팔콘 | 352096 | |
| 50 mL 팔콘 튜브 | BD 팔콘 | 352070 | |
| 펜치, 세밀 | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| 펜치, 플랫 팁 | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13cm 수술용 가위 | Aesculap | BC-140-R | |
| 컨포칼 현미경 | Nikon | A1RSi | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | 토끼 단클론 |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | 마우스 단클론 |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | 토끼 단클론 |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (칵테일) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | 에는 4개의 시약이 포함되어 있습니다. |
| 염소 안티 토끼 Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| 염소 안티 마우스 Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
참고문헌
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32<....
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