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방법 논문

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53696

⸱

2016년 6월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nanobiomedical Sciences and BK21 PLUS NBM Global Research Center for Regenerative Medicine, Dankook University, 2Insititute of Tissue Regeneration Engineering, Dankook University, 3Department of Biological Sciences, Ajou University, 4Department of Pharmacy, Sahmyook University, 5Department of Animal Biotechnology, Sahmyook University

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

초록

유전자 침묵 및 과발현 기술은 배아 발달에 관여하는 유전자를 식별하는 데 도움이 됩니다. 착상 전 배아에서 직접 표적 유전자 변형은 예를 들어 영양배엽(TE)과 내부 세포 덩어리(ICM)로의 세포 분화와 관련된 유전자의 기본 메커니즘을 연구할 수 있는 수단을 제공합니다. 여기에서는 착상 전 마우스 배아에서 초기 세포 운명 결정을 위한 진정한 수용체로서 네오게닌의 역할을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 먼저, 우리는 네오제닌 cDNA와 shRNA를 미세주입하여 네오제닌 기능의 이득 및 상실을 생성하는 데 사용된 실험적 조작에 대해 논의합니다. 이 접근법의 효과는 적색 형광 단백질(RFP) 또는 녹색 형광 단백질(GFP)의 쌍별 발현 수준과 네오제닌 발현의 면역세포화학적 정량화 사이의 강력한 상관관계에 의해 확인되었습니다. 둘째, 착상 전 마우스 배아에서 네오게닌의 과발현은 정상적인 ICM 발달로 이어지는 반면, 네오게닌 녹다운은 ICM을 비정상적으로 발달시키는데, 이는 네오게닌이 할구를 초기 세포 운명으로 유도하기 위해 세포 외 신호를 전달하는 수용체일 수 있음을 의미합니다. 새로운 배아 발달 단계 특이적 수용체(embryonic developmental stage-specific receptor)의 기능을 조사하는 데 있어 이 상세한 프로토콜의 성공을 감안할 때, 우리는 배발생 동안 다른 단계 특이적 유전자의 탐색 및 식별을 도울 수 있는 잠재력이 있다고 제안합니다.

서론

착상 전 배아 발달이 상실 배와 배반포로 한 세포 단계에서, 여러 가지 구별되는 단계로 나눌 수있다. 많은 증거가 극성 위치 단서가 trophectoderm (TE) 및 내부 세포괴 (ICM)에 이른 세포 운명 결정에 중요한 역할을 제안합니다. 그러나, 셀룰러 신호로 형질 도입 방법을 단서의 특성 및 생리적 컨텍스트는 이러한 신호들은 알려지지 않은 세포 계통의 분화를 개시 할 수있다. 이 분화 된 세포는 태반 1-3의 배아 적절한 형성과 성장에 필요한 특성 구조와 기능에 걸릴 시작, 전문화를 받다.

착상 전 배아의 siRNA 또는 표적 cDNA의 변성 등의 유전 재료의 직접적인 주사에 의한 조작에 특히 순종하며, 따라서 특정 표적 분자를 연구하는데 이용 될 수있다. 유전이 성장 이해가척추 동물 배아의 분석은 배아 발달 4에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 적시 문맥 배아 내로 야생형 유전자 또는 돌연변이 형태의 정밀한 도입 이득 - 또는 기능 상실 유전자 크게 발달 조절 유전자에 대한 연구를 촉진했다 수행한다. Loss- 및 이득의 기능 개별 이른 비 포유 동물과 포유 동물의 배아에 유전 물질의 미세 주입을 통해 이유로 인해 그들의 큰 크기와 큰 감수성 (5)의 상대적으로 간단하다. 마이크로 인젝션은 전형적으로 비 - 바이러스 성 벡터를 사용하여 수행된다. 특별한 장점은 바이러스 벡터 및 유전자 위에 비 바이러스 성 벡터를 사용의 용이성이 고려되어왔다. 마우스 배아 급격한 loss- 또는 기능 획득 발현 시스템은 우리 해부 척추 동물 배아 -6,7- 유전자 기능을 이해할 수 있도록 개발되어왔다.

배아의 형광 라벨이 크게 MICR의 선택을 용이하게 할oinjected 또는 유 전적으로 조작 된 배아를 동시에 간접 형광 강도 (8)에 기초하여 마이크로 인젝션의 siRNA 또는 cDNA의 발현 수준을 정량 할 수있는 수단을 부여. 이 라벨 형광 단백질 cDNA를, GFP 또는 RFP를 달성하기 위해 공동 주입 융합 구조물 또는 별도로 하나 같다. GFP 또는 RFP의 형광 강도는 loss- 보장 또는 기능 획득 이루어진 것으로하기의 siRNA 또는 외부 DNA의 발현의 정도를 보여준다.

여기, 우리는 우리가 착상 마우스 배아의 초기 세포 분화에 중요한 세포 외 신호를 중계하는 수용체로 neogenin 식별 할 수 loss- 이득 외 기능 기술에 대한 미세 조작 프로토콜을 제시한다.

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프로토콜

참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 삼육 대학교, 서울, 대한민국의 IACUC 규정에 따라 실시 하였다.

1. 과배란, 육성 난관 격리

  1. 다음과 같은 조건에서 근친 C57BL / 6 마​​우스 유지 : 22 ± 3 ° C ~ 60 % 습도, 12 시간 빛 / 어둠주기, 물과 음식 광고 무제한입니다.
  2. 0.1 ml의에서 5 IU 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 복강 내 주사에 의해 3-5주 된 여성 생쥐의 과배란을 유도 / 머리는 0.1 ml의에서 5 IU 인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 복강 내 주사 (hCG의)에 의해 48 시간 이상 이어 /머리.
  3. 즉시 hCG의 주입에 따라, 하룻밤 같은 케이지에서 그들을 유지하여 동일한 균주의 성적으로 성숙한 남성으로 과배란 유도 여성을 짝.
  4. 다음날 아침, 여성 생식기의 정합 플러그 또는 질 플러그의 존재에 의해 성공적인 짝짓기를 확인한다.
  5. 임신 여성 쥐를 희생CO에 의해 2 중독은 hCG의 주입 후 자궁 전위 18 ~ 20 시간 뒤에.
  6. 피부와 다음 미세 가위로 복막 층을 절단하여 복강을 엽니 다.
  7. 미세 집게와 자궁 뿔을 들고 체강에서 조심스럽게 자궁, 난관, 난소, 지방 패드를 멀리 당기십시오.
  8. 난관 미세 가위로 난소 사이의 영역을 잘라. 첨부 된 자궁의 상부 중 적어도 1cm를 떠나, 포셉 위치를 조정하고 난관 근처의 자궁을 잘라.
  9. 실온에서 M16 매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 oviductal 팽대부 전송. 같은 접시에 여러 생쥐의 난관을 풀.
  10. 배아의 검색을위한 실체 현미경 아래에 접시를 놓습니다.

2. 검색 2- 전핵의 배양 (2-PN) 배아

  1. , 30 또는 32 G 피하 주사 바늘의 끝을 잘라 무딘 끝으로 갈기, 그리고 플러싱 바늘로 사용합니다.
  2. 용도미세 집게는 플러싱 바늘에 난관의 끝을 밀어합니다. 조심스럽게 제자리에 고정 할 수있는 접시의 바닥에 대한 플러싱 바늘의 끝을 누릅니다. M16 매체의 0.1 ㎖를 페트리 접시에 2 PN 배아를 분리합니다 ~와 난관을 플래시합니다.
  3. 멸균 유리 피펫을 사용하여 새로운 배양 접시로를 전송할 실체 현미경 아래에서 플러시 M16 매체에서 운 질량을 주변과 함께 2-PN의 배아를 복구 할 수 있습니다.
  4. 50-10 분 동안 37 ° C에서 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서 0.1 ~ 0.5 %의 히알루로 1.0 ㎖의 효소 적 절단에 의해 2 PN 배아에서 운 세포 해리.
  5. 부드럽게 유리 피펫 및 난구 세포의 물리적 제거와 피펫 팅에 의해 배아를 박탈하다.
  6. 배아 당 신선한 인산염 완충 식염수 (PBS)의 30 ~ 50 ml의 무 결함 배아 세 번 씻으십시오.
  7. 10 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA, Fract 보충 M16 미디어에서 35mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 품어이하 4 시간 후에 일반적으로 마이크로 인젝션이 이루어질 때까지 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2, 37 ℃에서 이온 V).

3. 배아 역전사 (RT)와 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)

  1. 포배기까지의 각 단계에서 적어도 10 배아 모아서 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, 올리고 DT 프라이머 랜덤 6mers,의 dNTP 혼합물을 함유 효소 미리 혼합액 역방향 배 4.0 μL 그들을 수영장,에 반응 완충액 PCR 튜브.
  2. W. 95 ° C에서 5 분 동안 배양 한 다음, 1 시간 동안 42 ° C에서 즉시 RT 반응을 개시 (200)에서 30 초 동안 풀링 된 배아를 20 ㎕의 총 부피의 RNase가없는 증류수 H 2 O를 첨가하고 초음파 처리.
  3. 생성 된 cDNA 솔루션의 각 5.0 μl를 들어, neogenin을위한 프라이머와 일반 PCR 증폭을 실시, CDX2는, Sox2이는 Tead4는, Nanog를이 Oct3 / 4, β - 굴지 (프라이머 서열은 표에 주어진 1. PCR은 95 ℃에서 15 초 동안 배양 40 사이클 구성, (표 1) 소둔 온도에서 30 초, 72 ℃에서 30 초.
  4. 2 % 아가 로스 겔상에서 전기 영동에 의해 분리 된 PCR 제품, 에티 디움 브로마이드로 염색 한 후, UV 광 하에서 겔을 시각화.
  5. β - 굴지 수준에 대한 표적 유전자의 발현을 정상화.

태아의 면역 세포 화학 (4)

  1. PBS에 0.​​01 % BSA를 함유하는 짧은 세척하여 세 번을 실온에서 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드와 각 단계에서 배아를 수정.
  2. 10 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20, 0.1 % 트리톤-100을 함유하는 PBS 1.0 ㎖에 10 배아를 배양하여 Permeabilize 하시려면 세포막.
  3. 1.0 ml의 PBS에 투과성이 배아 부화 비특이적 블록을 실온에서 30 분 동안 10 % 정상 염소 혈청.
  4. 차단 된 배아의 재치를 품어1에서 시간 토끼 안티 neogenin 항체 : PBS 100 희석 밤새 4 ° C에서 0.1 % BSA를 포함.
  5. PBS의 방울에서 30 초마다 세 세척 한 후, 1 알렉사 488 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 또는 알렉사 568 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 하나와 배아를 배양 : PBS / BSA 용액 500 희석 4 ° C에서 하룻밤 .
  6. 액틴 필라멘트를 시각화하고 실온에서 1 시간 동안 PBS에 1 μg의 / ㎖의 팔로이 딘에 배아를 배양한다.
  7. PBS는 실온에서 5 분간 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드)를 함유하는 5 mL를 첨가하여 핵을 염색.
  8. 워시는 PBS로 세 번 짧게 배아.
  9. 유리 슬라이드에 배아를 전송 및 미네랄 오일 방울을 커버.
  10. 적절한 파장의 여기와 공 초점 현미경으로 1000 배 배율에서 이미지를 가져 가라.

Neogenin-RFP 및 Neogenin-siRNA를 GFP 플라스미드 5. 준비

  1. 보결cDNA를 빨간색 형광 단백질 (RFP), 벡터를 함유 neogenin 플래그 - RFP의 결과로 마우스 neogenin을 인코딩 복제.
  2. 에메랄드 녹색 형광 단백질 (EmGFP), 벡터를 함유 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin의 결과로 neogenin 대상으로 작은 헤어핀 RNA를 서브 클로닝 (그림 1).
  3. neogenin 플래그 - RFP 및 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin 플라스미드를 모두 증폭하고 기존의 방법으로 그들을 정화.
  4. 플라스미드의 최종 농도를 조정에 ~ 멸균 트리스 - EDTA (TE) 버퍼 / ㎖ 1.0 μg의.

2-PN 배아에 플라스미드 6. 미세 주입

  1. 신선한 M16 매체와 짧게 한 번 무 결함이-PN의 배아를 씻으십시오.
  2. 전핵의 관찰이 가능하도록 테이블 탑 원심 분리기에서 1,000 × g으로 10 분간 2 PN 배아를 원심 분리기.
  3. additi 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미네랄 오일 아래 M16 배아 당 매체의 20 내지 30 μL의 미세 드롭 배아 부화도 그러 1-2 시간.
  4. 붕규산 유리 모세관 튜브를 당겨 주입 피펫을 들고 피펫 제조 (OD = 1.2 mm를, ID = 0.94 mm) 기계 풀러와 함께.
  5. microgrinder 및 microforger를 사용 무딘 팁과 <500 μm의 팁 길이와 1 ~ 2 μm의 팁 내경 연마 구멍을 가지고 주입 피펫을 제조.
  6. 그들은 20 ㎛, 내경 100 ㎛, 외경 무딘 팁 연마 개구를 갖도록 피펫 들고 제조.
  7. 1.0 μg의 / μL에서 플라스미드 솔루션의 충분한 양의로드 주입 피펫 (> 200 NL).
  8. Microinject ~ 전동 micromanipulator에 부착 된 마이크로 인젝터를 사용 전핵 중 하나에 각각 2 PN 배아 용 플라스미드 용액 10 PL; 이 과정에서 보유 피펫 부압을 적용하여 위치 배아를 유지한다.
  9. 미세 주입 한 후, 난 신선한 M16 매체와 2 PN 배아 3 회 세척1 분마다 시간보다 ESS.
  10. 배양기 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 방울에 의해 덮여 플라스틱 배양 접시에 신선한 M16 매체의 드롭 2 PN 배아.
  11. 미분 간섭 대비에서 24 시간 간격 (DIC) 200X 배율에서 거꾸로 현미경에서 배아를 관찰한다.

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결과

우리는 neogenin이 일시적으로 초기 2 셀 단계에서와 같은 지속적인 초기 상실 배까지 등장하지만 후반 상실 배와 배반포 단계 (그림 2A)에서 결핍되고, 착상 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 표현된다 발견했다. 또한 neogenin의 공간 분포는 주로 외부 세포로 제한 하였다. RT-PCR 분석의 결과는 4- 세포 단계 고점하지만 완전히 이상 (도 2b)를 16 세포 단계에서 부족하거나, neogenin 발현 초기 과도 특성과 일치 하였다. 반면, F - 굴지는 일시적인 및 편광 식 패턴을 공개하지 않았다.

우리는 다음 neogenin 수준이 로스 neogenin (shRNA를가 neogenin 대상으로 숨겨 neogenin cDNA를 벡터 (neogenin 이득) 또는 벡터 중의 미세 주입에...

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토론

본 프로토콜에서, 우리는 마우스 배아 초기의 세포 분화에 neogenin의 역할을 탐구하는 2-PN 마우스 배아에 유전 물질의 미세 주사의 새로운 방법, cDNA를 또는 shRNA를 하나를 보여줍니다. 착상 전 배아의 유전자 변형은 예를 들어 대한 기본 분자 메커니즘, 첫 번째 셀의 혈통 결정에 대한 주요 정보를 폭로에서 강력한 기술이다. 유전 적 변형은 유전자의 기능을 확인하는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이다. 해외 유전 물질에 대한 2-PN 배아 및 2-PN 배아로의 cDNA와의 shRNA의 미세 주사의 타당성의 비교적 큰 receptibility으로,이 배아 조작 기술은 고유 말할 것도없고, 배아에 최소한의 물리적 방해로 구현 될 수있다 이 유전자 조작과 관련된 보완.

그 세포질 주입을 고려하면 더 쉽고 덜 해로운핵 주입보다 생존하지만, 그럼에도 불구하고, 강조되어야 핵 주입과 연관된 외래 DNA의 높은 발현 한 개선이 핵 내로 마이크로 인젝션 전에 전핵 위치...

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공개 사항

저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.

감사의 글

저자는 또한 제조 및 cDNA를과의 shRNA 벡터를 neogenin의 구조를 공유 조지아 건강 과학 대학에서 박사 시옹의 그룹을 인정하고 싶습니다. 본 연구는 한국 연구 재단의 자금을 지원 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A4A01012572)에서 보조금과 삼육 대학에서 연구비에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
M16 미디엄,Gibco BRL(그랜드 아일랜드, NY)M7292 LOT# 11A832
염소 세럼, Dako (Glostrup, Denmark)X0907
PMSGFolligon, Intervet, HollandG4877-1000IU LOT#SLBD0719V
미네랄 오일Sigma AldrichCG5-1VL LOT# SLBC6783V
인간 융모성 성선 자극 호르몬 및 임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (Intervet, Holland)(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III 역전사효소lifetechnologies18080-044
PCR 사전 혼합물 ( Bioneer, Daehon, S. Korea)GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade)BioRad161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBSAffymetrix USA19943
polyclonal rabbit anti-neogenin anti-neogenin antibodySanta Cruz Biotechnology, USSC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit anti-rabbit antibodyMolecular Probes (Invitrogen, USA)A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibodyMolecular Probes (Invitrogen, USA)A-21428
Alexa Fluor® 555 PhalloidinMolecular Probes (Invitrogen, USA)A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen, USAD1306
재조합 인간 RGM-C/HemojuvelinR&;D 시스템3720-RG
모든 플라스미드 구조 Wen Cheng Xiong 교수, 조지아 보건 과학 대학(조지아주 아구스타).본 연구는 친절하게 제공되었습니다.
네온®   트랜스펙션 시스템lifetechMPK10096
스테레오 마이크로스크로프니콘SMZ1000
니콘니나리시게 ONM-1
마이크로 인젝터니콘 나리시게GASTIGHT #1750
홀더니콘 나리시게나리시게 IM 16
마이크로퓨지니콘 나리시게Narishige MF-900
그라인더NarishigeEG400
풀러셔터 Instrumnet 회사P-97
CO2 인큐베이터Thermo Scientific FormaEW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler LifeTechnologies4388444
콘

참고문헌

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
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  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

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