방법 논문

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

DOI:

10.3791/53697

⸱

2016년 2월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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필라멘트 액틴(F-actin)은 척추 발생, 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 F-actin puncta의 정량화는 시냅스 구조의 무결성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 저밀도 1차 피질 신경 세포 배양에서 Phalloidin으로 표지된 F-actin puncta를 정량화하는 절차를 설명합니다.

초록

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(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F - 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F - 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 - 관련 단백질 2 (수지상 F - 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.

서론

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본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F - 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다.

레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 ​​가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F - 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F - 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을.

Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F - 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의 다양한 표현 이산 "핫스팟"또는 밝은 "puncta에"를 생성합니다. 미성숙 등뼈 얇은 filopodia 패치 형태의 일부 형태를 포함하고 spinogenesis 3의 개시를 나타낼 수있다. 미성숙 가시 및 비 - 가시 패치 PSD95 4 부족하다. 뿐만 아니라 등뼈의 후속 변경뿐만 아니라 추가 수지상 구조에 F - 굴지의 납 생산의 변화, 따라서 synaptodendritic 무결성 5-7을 조사하기위한 중요한 도구 Phalloidin의 제작. 일반적으로, Phalloidin의 양성 (F - 굴지) puncta의의 수는 활성 시냅스 사이의 균형 (흥분성과 억제), 굴지 역학과 시냅스 안정성 (8)을 반영한다.

특정 t을 연구하는 중요하지만치료의 대상이 알려지지 않은 경우에 시냅스 (즉, 흥분성 등뼈)의 씨네마 스테이션 먼저 수지상 구조의 다양한 일반 무결성을 추정 할 필요가있다. F - 굴지는 억제 시냅스, synaptopathy을 나타낼 수 F - 굴지 puncta에의 변경 번호를 포함 돌기 쪽과 다른 구조의 주요 구성 요소이기 때문에. 이 synaptopathy는보다 구체적인 변경에 대한 추가 조사를 할 수있다. 여러 시냅스 유형 / 구조를 검출하기위한 우리의 정량화 방법은 다양한 실험적인 치료 다음과 같은 돌기 시냅스 변화 (증가 및 감소)의 전체 추정치를 산출한다.

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프로토콜

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모든 동물 프로토콜을 검토하고 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호 : A3049-01)에 의해 승인되었다.

1. 저밀도 배아 신경 문화

  1. 기본 대뇌 피질의 신경 세포 배양을위한 준비
    1. 솔루션 :
      1. 10 ml의 보레이트 완충액에 폴리 -L- 리신 5mg을 용해시켜 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 제조 하였다.
      2. 49 ml의 붕산염 완충액 1 ml의 폴리 - L - 라이신 주식을 희석하여 솔루션을 작동 준비합니다.
      3. 395 ml의 DH 2 O로 시작하고 모든 재료 (붕사의 1.24 g의 붕산 + 1.9 g)을 추가하여 붕산 완충액, pH가 8.4을 준비합니다. 1 M의 NaOH로 pH를 8.4로 조정합니다. 400 ml의 조정 및 후드 아래에 0.2 μm의 나일론 멤브레인 필터로 필터링 할 수 있습니다.
      4. 445 ml의 DH 2 O로 시작하는 다른 모든 성분을 추가하여 HBSS 용액의 pH 7.2을 준비합니다 (50 ㎖ 10X HBSS 재고 + 1.2 g HEPES). 1 N 염산, 브리에 의해 7.2의 pH를 조정NG 500 ㎖의 후드 아래에 0.2 ㎛의 나일론 멤브레인 필터로 필터링.
      5. 10 % 소 태아 혈청 DMEM / F12 : 도금 매체를 준비합니다. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 필터링.
      6. 전체 성장 매체를 준비 : 50 ㎖로 Neurobasal 매체에, 보충 교재를 추가 (500 μL 루타 (100X) + 500 μL 포도당 항생제 - 안티 곰팡이 솔루션 (100X의 + 1 ML의 B-27 (50X) + 500 μL) + 100 ㎕의 7.5 % 중탄산 나트륨. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 여과.
    2. 이틀 문화 전 :
      1. 2 폴리 - L - 라이신 작업 용액 ㎖의, 그리고 후드 O / N에서 유지와 코트 열두 35mm의 유리 바닥 요리.
    3. 문화 전 어느 날 :
      1. DDH 2 O와 빈 코팅 요리에서 에이전트와 린스 요리 후드 아래 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
      2. 10 % 소 태아 혈청 (총 용액의 10 %)와 도금 배지 (DMEM은 / F12를 준비한다. 피펫 2ml의 배지 내로각각의 요리는, 37 O를 C, 5 % CO 2에서 O / N을 품어.
        참고 : 배양 할 때 플라스틱 문화 요리를 방지하는 것이 중요하다. 유리 바닥 (반전 현미경) 요리 또는 (직립 현미경) 커버 글라스의 사용은 샤프하고 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 플라스틱 바닥 접시에 비해 유리 바닥 접시 형광 현미경 동안 원치 않는 색상이나 눈부심을 방지 할 수 있습니다.
  2. 세포 배양 프로토콜 :
    1. HBSS 버퍼 (100 ~ 150 ㎖), 냉장 넣어 100mm 배양 접시, 집게, 가위, 50 ㎖ 튜브 및 후드 UV 빛 아래 15 ml의 튜브.
    2. 문화 실의 외부 후드 5 % 세보의 치명적인 흡입 임신 쥐를 안락사.
    3. 70 %의 EtOH 텐트 복부 cavity.Open 태반을 노출 가위를 이용하여 자궁 중간 꼬리로부터 절단하면서 집게를 사용하여 복부의 피부를 소독.
    4. 8-10 E18 태아를 제거합니다. 놀이터HBSS 솔루션을 포함하는 배양 접시에 8-10 태아를 CE.
    5. 집게로 태아의 머리 뒤쪽을 잡고, 다음 몸에서 머리를 절단 가위를 사용합니다. HBSS의 5-7 ml를 가득 다른 배양 접시에 넣습니다. 후드에 접시를 전송합니다.
    6. 차가운 HBSS와 두 개의 추가 100mm 페트리 접시를 입력합니다.
    7. 껍질 옆으로 두개골, 그리고 HBSS로 가득 찬 새로운 배양 접시에 머리를 특종.
    8. 다음에 차가운 HBSS로 새로운 배양 접시에 두뇌를 전송, 뇌에서 날카로운 곡선 집게, 별도의 소뇌와 뇌간을 사용합니다.
    9. 곡선 집게와 반구를 분리, 고정 핀셋을 사용합니다. 수막을 제거; 표시 15 ML의 원심 분리기 튜브에 정면 피질 및 전송 조각을 격리 할 것.
    10. 신선한 2 ml의 HBSS로 15 ML 튜브를 입력하고 각 15 ML 튜브에 20 μL 트립신 EDTA (0.5 % 트립신 및 5.3 mM의 EDTA.와 10 배 농축 혼합물)를 추가합니다.
    11. RT에서 10 ~ 15 분을 품어. 부드럽게 관에게 몇 분마다 소용돌이, 정착 허용하지 않습니다.
    12. AF터 10 ~ 15 분 사용 유리 피펫 오래된 HBSS를 제거하고 새로운 HBSS로 두 번 씻어합니다.
    13. (2 ml의 HBSS 1 ㎎ / ㎖, 2 mg을 트립신 억제제) 트립신 억제제에 빠져, 잘 혼합하고 5 분 앉아 보자. 신선한 HBSS로 두 번 씻으십시오.
    14. 다시 보정 피펫 매우 균질해질 때까지 서서히 감소 팁 직경 멸균 팁을 사용 bubbles.Triturate을 피하기 위해 매우 천천히 씹다 뇌 피스 고무 전구 10-15 번 유리 피펫을 사용.
    15. 전송 원하는 농도에서 세포를 해리에 코팅 된 배양 접시 (50 셀 / mm2 인) 준비된 사전. 37 O C, 5 % CO2에서 O / N을 품어.
    16. 24 시간 후, 갓 만든 완전한 성장 혈청 무료로 Neurobasal 매체 DMEM / F12 매체를 교체합니다.
    17. 실험 전에 적어도 12~14일 대해 5 % CO 2 / 95 %의 실내 공기의 가습 인큐베이터에서 항상 세포를 유지한다. 신선한 배지로 Neurobasal 이전 매체의 약 50 %를 교체하는 모든 5-6일 세포를 보완.

2. 형광 라벨링 및 면역 세포 화학

주 : 일차 대뇌 피질 세포 배양의 면역 라벨 1 ㎖가 작동 부피 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 행했다.

  1. 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)로 두 번 유리 바닥 접시를 씻으십시오.
  2. 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 수정.
  3. PBS로 두 번 세포를 씻으 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 Permeabilize 하시려면.
  4. F - 굴지 특정 얼룩 실온에서 20 분 동안 세포 치료, AlexaFluor 488 Phalloidin의 (1시 40분, 1 ml의 PBS에서 Phalloidin의 25 μL).
  5. PBS로 두 번 세포를 씻어 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단합니다.
  6. 2 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 4 O ℃에서 O / N을 부화 : 닭 항 MAP2 클론 항체 (2500 1) 희석
  7. 배양 한 다음, 두 번 PBS에 헹군다.
  8. 이차 항체 (알렉사 R 희석ED 594 - 복합 염소 항 - 닭 IgG를 (1 : 500) 2 % 정상 염소 혈청와 실온에서 2 시간 동안 품어.
  9. PBS로 헹구고 10 μL / Hoescht 염료의 요리를 추가합니다.
  10. RT에서 3 분을 품어 PBS로 2 회 씻는다.
    참고 : 3 단계 (F - 굴지 puncta의 계산) 이제 표지 세포가 준비.
  11. coverslipping 제로 antifade 시약 100 ㎕로 세포 샘플을 보존 및 장기 저장을 위해 어둠 속에서 4 ℃로 유지한다.
    참고 : Phalloidin의이 antifade coverslipping 시약으로 보존 할 수 일주 형광까지의 어둠 속에서 4 ℃에서 PBS에서 상대적으로 안정적이다. Phalloidin의 확장 된 스토리지 밖으로 확산 시작할 수 있기 때문에, 최적의 이미지는 염색 후 1-3일를 얻을 수있다.

3. F - 굴지 puncta의 카운팅

  1. 형광 현미경의 전원을 켜고 20 × 목표로 전환합니다. 오픈 현미경 소프트웨어, 1280 × 960 화소의 화상 사이즈에 프로그램을 설정하고, 0.11 배 줌에 7 μm의 / 픽셀 이미지 해상도.
  2. 빨강, 녹색 (495 ㎚) / (613 ㎚) 형광 채널에서 공동 표지 F - 굴지 / MAP2 뉴런의 이미지를 획득.
  3. 5 그린 (F - 굴지) / 레드 (MAP2) immunolabeled / 블루 (Hoescht) 명확하게 정의 된 수지상 아버 개별 신경 세포의 형광 이미지를 선택합니다.
  4. 연속 MAP2의 면역와 두 번째 순서 수지상 세그먼트 (길이 범위 25 ~ 75 μm의)에서 F - 굴지 풍부한 구조를 확인합니다.
  5. 수평 수준으로 이미지의 선택 영역을 돌립니다. 새로운 이미지로 복사 및 붙여 넣기.
  6. 각 접시에 대한 일관성을 조정하여, 이미지의 배경을 뺀다.
  7. 밝은 녹색 F - 굴지 puncta의 카운트 수동으로 훈련 된 독립적 인 관찰자에 의해 선택 수지상 세그먼트의 길이를 추적. 스프레드 시트 파일에 데이터를 보냅니다.
  8. MAP2는 수상 돌기 레이블의 길이 (L)에 의해 총 F - 굴지 라벨 puncta에 (N)을 나누어 밀도를 계산합니다. F-교류의 수와 같은 고속 데​​이터수상 돌기의 10 μm의 당 주석 puncta의
    참고 puncta의 수지상 샤프트 염색의 평균 강도보다 최소한 50 %의 피크 강도 F 액틴 형광 (크기 ≤1.5 것이 μm의) 각각의 선택된 수지상 세그먼트에 포함되었다.

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결과

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본 발명의 방법에서, 우리는 첫 번째 문화 쥐 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 대뇌 피질의 뉴런. 도 1에있어서, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 일 4, 6, 10, 시험관 내에서 14, 21 및 27에서 태아 래트 피질 뉴런 개발 형태 변화를 나타낸다. 길이와 수상 돌기의 수는 배양 된 쥐 주 신경 세포의 성숙에 따라 증가합니다. 뉴런은 단지 14 일 숙성 한 후 실험에 사용된다.

수상 및 시냅스 변화를 감지하기 위해, 우리는 수상 돌기의 MAP2 항체 검출을 Phalloidin의 F - 굴지 라벨을 결합한다. F 액틴의 Phalloidin의 라벨링 (20-30 분)이 매우 빠르게되기 때문에 시각적 ICC 항체 표지 (도 2를

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토론

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이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F - 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다.

F - 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네트워크가 명확하게 볼 수 있어야 변화를 확인하려면,이 하나의 신경 세포에서 적절한 번째 순서 수지상 세그먼트를 선택할 수 있습니다. 저밀도 도금 개별 뉴런을 시각화뿐 아니라 아교 세포의 존재를 최소화하기 위해 모두 중요하다. 성상 세포는 F - 굴지을 포함하고 신경 세포 마커없이, F - 굴지 긍정적 인 puncta의 분석을 혼동 할 수있다. 저밀도 문화로 Neurobasal 배지의 사용은 세포 배양에서 성상 세포의 증식을 감소 시키는데 도움이된다. 그러나, F-액틴 단백...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 DA013137, DA031604 및 HD043680으로 자금을 지원받았습니다. 부분적인 지원은 생물의학-행동과학 분야의 NIH T32 교육 보조금으로 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 커버 글라스MatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
Poly-L-LysineSigmaP9155
Boric acidSigmaB0252
BoraxSigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
포도VWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Neurobasal 매체Life Technologies21103-049
B-27 보충제Life Technologies17504-04450X
항생제-항진균제 솔루션Cellgro30004CI100X
중탄산나트륨Life Technologies25080
Vannas 가위세계 정밀 기기500086
아이리스 가위세계 정밀 기기500216
아이리스 집게세계 정밀 기기15914
Dumont #7 집게세계 정밀 기기14097
Dumont #5 펜치월드 정밀 기기14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
파라포름알데히드 SigmaP6148
커버 유리VWR631-0137
AlexaFluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Normal horse serumLife Technologies26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2abcamAb92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgGLife TechnologiesA11042
NucBlue 라이브 셀 염색 ReadyProbes 시약 Hoescht 33342Life TechnologiesR37605
NIS-Elements 소프트웨어 패키지Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 반전 형광 컴퓨터 제어 현미경 니콘 인스트루먼트
0.2 μ m Nalgene 나일론 멤브레인 필터Fishersci151-4020
당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).

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