방법 논문

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

DOI:

10.3791/53697

⸱

2016년 2월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

필라멘트 액틴(F-actin)은 척추 발생, 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 F-actin puncta의 정량화는 시냅스 구조의 무결성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 저밀도 1차 피질 신경 세포 배양에서 Phalloidin으로 표지된 F-actin puncta를 정량화하는 절차를 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F - 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F - 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 - 관련 단백질 2 (수지상 F - 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F - 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다.

레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 ​​가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F - 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F - 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을.

Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F - 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 프로토콜을 검토하고 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호 : A3049-01)에 의해 승인되었다.

1. 저밀도 배아 신경 문화

  1. 기본 대뇌 피질의 신경 세포 배양을위한 준비
    1. 솔루션 :
      1. 10 ml의 보레이트 완충액에 폴리 -L- 리신 5mg을 용해시켜 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 제조 하였다.
      2. 49 ml의 붕산염 완충액 1 ml의 폴리 - L - 라이신 주식을 희석하여 솔루션을 작동 준비합니다.
      3. 395 ml의 DH 2 O로 시작하고 모든 재료 (붕사의 1.24 g의 붕산 + 1.9 g)을 추가하여 붕산 완충액, pH가 8.4을 준비합니다. 1 M의 NaOH로 pH를 8.4로 조정합니다. 400 ml의 조정 및 후드 아래에 0.2 μm의 나일론 멤브레인 필터로 필터링 할 수 있습니다.
      4. 445 ml의 DH 2 O로 시작하는 다른 모든 성분을 추가하여 HBSS 용액의 pH 7.2을 준비합니다 (50 ㎖ 10X HBSS 재고 + 1.2 g HEPES). 1 N 염산, 브리에 의해 7.2의 pH를 조정NG 500 ㎖의 후드 아래에 0.2 ㎛....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 발명의 방법에서, 우리는 첫 번째 문화 쥐 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 대뇌 피질의 뉴런. 도 1에있어서, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 일 4, 6, 10, 시험관 내에서 14, 21 및 27에서 태아 래트 피질 뉴런 개발 형태 변화를 나타낸다. 길이와 수상 돌기의 수는 배양 된 쥐 주 신경 세포의 성숙에 따라 증가합니다. 뉴런은 단지 14 일 숙성 한 후 실험에 사용된다.

수상 및 시냅스 변화를 감지하기 위해, 우리는 수상 돌기의 MAP2 항체 검출을 Phalloidin의 F - 굴지 라벨을 결합한다. F 액틴의 Phalloidin의 라벨링 (20-30 분)이 매우 빠르게되기 때문에 시각적 ICC 항체 표지 (도 2를

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F - 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다.

F - 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네트워크가 명확하게 볼 수 있어야 변화를 확인하려면,이 하나의 신경 세포에서 적절한 번째 순서 수지상 세그먼트를 선택할 수 있습니다. 저밀도 도금 개별 뉴런을 시각화뿐 아니라 아교 세포의 존재를 최소화하기 위해 모두 중요하다. 성상 세포는 F - 굴지을 포함하고 신경 세포 마커없이, F - 굴지 긍정적 인 puncta의 분석을 혼동 할 수있다. 저밀도 문화로 Neurobasal 배지의 사용은 세포 배양에서 성상 세포의 증식을 감소 시키는데 도움이된다. 그러나, F-액틴 단백.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 DA013137, DA031604 및 HD043680으로 자금을 지원받았습니다. 부분적인 지원은 생물의학-행동과학 분야의 NIH T32 교육 보조금으로 제공되었습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 커버 글라스MatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
Poly-L-LysineSigmaP9155
Boric acidSigmaB0252
BoraxSigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
포도VWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Neurobasal 매체Life Technologies21103-049
B-27 보충제Life Technologies17504-04450X
항생제-항진균제 솔루션Cellgro30004CI100X
중탄산나트륨Life Technologies25080
Vannas 가위세계 정밀 기기500086
아이리스 가위세계 정밀 기기500216
아이리스 집게세계 정밀 기기15914
Dumont #7 집게세계 정밀 기기14097
Dumont #5 펜치월드 정밀 기기14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
파라포름알데히드 SigmaP6148
커버 유리VWR631-0137
AlexaFluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Normal horse serumLife Technologies26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2abcamAb92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgGLife TechnologiesA11042
NucBlue 라이브 셀 염색 ReadyProbes 시약 Hoescht 33342Life TechnologiesR37605
NIS-Elements 소프트웨어 패키지Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 반전 형광 컴퓨터 제어 현미경 니콘 인스트루먼트
0.2 μ m Nalgene 나일론 멤브레인 필터Fishersci151-4020
당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

MAP2

관련 논문