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방법 논문

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

10.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53709

⸱

2016년 6월 7일

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

연구에 따르면 음극 경두개 직류 자극은 약물 내성 발작을 억제하는 효과를 낼 수 있습니다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌 절편 제제에서 직류 자극 및 발작과 같은 활동의 다전극 어레이 기록을 평가하는 시험관 실험 설정을 고안했습니다. 직류 자극 매개변수를 평가했습니다.

초록

Cathodal 두개 직류 자극 (tDCS)의 약제 내성에 발작 억제 효과를 유도한다. 효율적인 동작을 수행하기 위해, 상기 자극 파라미터 (예를 들면, 방향 전계 강도와 자극 시간)을 마우스 뇌 슬라이스 제제에서 검사 될 필요가있다. 테스트 및 마우스 뇌 슬라이스의 위치에 전극의 상대적 배향을 정렬이 가능하다. 본 발명의 방법은 앞쪽에 cingulate 피질 발작 같은 활동에 대한 DCS의 효과를 평가하기 thalamocingulate 경로를 유지합니다. 다 채널 어레이 레코딩 결과 cathodal DCS 크게 -4- 아미노 피리딘과 bicuculline 유도 발작 같은 활성의 자극 - 유발 반응의 크기 및 지속 시간을 감소 것으로 나타났다. 이 연구는 또한 15 분에서 cathodal DCS 응용 프로그램이 thalamocingulate 경로에 장기 우울증의 원인 것으로 나타났습니다. 본 연구는 thalamocingulat에 ​​DCS의 효과를 조사전자 시냅스 가소성 및 급성 발작 같은 활동. 현재의 방법은 시험 관내 마우스 모델에서 방향 전계 강도와 자극 시간을 포함하여 최적의 자극 파라미터를 테스트 할 수있다. 또한,이 방법은 두 셀룰러 네트워크 레벨에서 대뇌 발작 같은 활동 DCS의 효과를 평가할 수있다.

서론

간질은 흔한 신경 질환입니다. 간질 환자의 30%는 약물 내성 발작을 앓고 있다1. 경두개 직류 자극(tDCS)은 발작과 같은 큰 뇌 영역에 걸쳐 네트워크 활동을 제어하거나 변경하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공합니다. 임상 연구에 따르면 tDCS는 난치성 발작을 효과적으로 치료하고2 발작에 대한 단기 및 장기 억제 효과를 나타낼 수 있다3-5. 그러나 tDCS 작용의 치료 메커니즘은 아직 불분명합니다. 제시된 뇌 절편 모델은 tDCS 작용의 치료 메커니즘이 발작과 같은 뇌 활동의 증상을 어떻게 변화시키는지 조사하기 위한 시험관 내 방법입니다. 따라서 최적의 효과를 얻으려면 방향, 전계 강도 및 자극 지속 시간을 포함한 특정 자극 매개변수를 실험 모델에서 테스트해야 합니다. 이전 연구에서는 전기장의 방향이 치료 효과를 얻는 데 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 따라서 테스트된 뇌 절편의 위치에 대한 전극의 방향을 테스트하고 배열하는 것이 가능합니다.

전두엽 간질과 전대상피질(ACC) 발작은 종종 약물에 내성이 있습니다7,8. 일부 연구에서는 대상피질9-11에 tDCS가 적용되었다고 보고했습니다. tDCS는 ACC 활동의 변화를 통해 경계, 의사 결정 및 감정에 영향을 미치는 것으로 나타나며, 이 뇌 영역에서 신경 흥분성 및 발작 활동을 조절할 수 있습니다12. 그러므로, ACC 발작에 대한 tDCS의 억제 효과는 임상 치료 및 대체 치료법의 평가에 도움이 될 수 있습니다.

본 프로토콜은 뇌 절편의 DCS를 위해 기록실에 전극을 준비하고 다전극 어레이(MEA)를 사용한 발작 유사 활동 기록에 미치는 영향을 설명합니다.

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프로토콜

동물의 과목을 포함하는 절차는 기관 동물 관리 및 활용위원회, 중앙 연구원, 타이페이, 대만에 의해 승인되었다.

1. 다중 전극 배열 녹화에 대한 실험 솔루션 및 장비 준비

  1. 인공 뇌척수액 (ACSF 준비 124 mM의 염화나트륨, 4.4 mM의 KCl을들을 1mM의 NaH를 2 95 % O 버블 PO 3, 2 mM의 황산, 2 mM의 CaCl2를 25 밀리미터의 NaHCO3 및 10 mM의 글루코오스, 2, 5 % CO 2).
  2. 6 × 10 평면 MEA와 8 × 8 MEA : MEA 프로브의 두 가지 유형을 사용합니다. 전자 프로브는 피질, 선조체 및 시상을 포함하는 영역을 포함한다. 후자의 프로브는 대뇌 피질의 영역을 다룹니다.
  3. 0.1 Hz에서 1,200 증폭에서 3 kHz의 사이에 밴드 패스 필터를 60 채널 증폭기를 사용한다. 10 kHz 샘플링 레이트로 데이터를 획득.
  4. DCS의 MEA 챔버 내부에 두 개의 AgCl을 코팅은 와이어를 놓습니다. AgCl을을 사용하여실버 코팅 된 와이어는 절연 자극에 의​​해 생성 된 전기장을 생성한다.
  5. 텅스텐 전극 (; 길이 7.62 cm 8 ° AC 테이퍼 팁 직경 127 μm의 저항 5 MΩ) 장소 시상 자극을하고, MEA 실 기준 전극을 배치합니다. 펄스 발생기에 의해 제어되는 격리 자극기를 사용하여 텅스텐 전극의 전류를 제공한다.

2. 뇌 조각 준비

  1. 4-8주 세 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다. 집 에​​어컨 방에 ​​동물 음식과 물을 무료로 이용할 수로 (21 ~ 23 ° C, 50 % 습도 / 12 시간 / 암주기, 오전 8:00에 점등 12 시간).
  2. 단계 1.1에서 제조 된 ACSF의 250 ML의 나누어지는을 가지고, 얼음이 들어있는 비커에 넣습니다. 동시에, 95 % O 2, 5 % CO 2로 구성되는 연속 가스를 공급한다.
  3. 외과
    1. 유리에서 4 % 이소 플루 란 동물을 마취약 3 분 동안 상자. 동물 (발가락 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 표시) 마취의 수술 깊이에 도달하면, 얼음 조각으로 가득 얕은 트레이에 배치하고 가위를 사용하여 헤드를 제거합니다.
    2. 두개골을 노출하고, 나머지 근육을 잘라. 다음으로, rongeurs를 사용하여 뇌에서 두개골의 지느러미 표면을 벗겨. rongeurs을 이용하여 두개골의 측면을 얻어 낸다. 75 % 에탄올 용액으로 수술 도구 모두 멸균.
    3. 주걱을 사용하여 두뇌의 복부 표면을 따라 후각 전구 및 신경 연결을 절단, 뇌를 제거합니다. 잘린 후, 신속하게 얼음처럼 차가운 산소 ACSF 가득 비커에 두뇌를 전송합니다.
  4. 내측 시상 (MT) -ACC 뇌 조각의 준비
    참고 : ACC (13)에 MT에서 경로를 포함 슬라이스를 준비합니다.
    1. 2.0 mm 각 반구의 중간 선 측 방향이 시상 인하와 함께 뇌 블록을 손으로 잘라피질 해부학을 표시합니다. 그런 다음 두 개의 각도 절단을합니다. 선조체에서 볼 수 섬유 기관의 첫 번째 크로스 컷 평행합니다.
    2. thalamocingulate 경로에 복부와 평행 전방 접합면과 광학 기관 사이의 중간 지점으로 소뇌와 시각 피질 사이의 연결에서 두 번째 크로스 컷을 확인합니다.
    3. 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 각도 플레이트 (~ 120 °)로 뇌 블록을 연결하고 그냥 경로의 전환점 위에 상처를합니다. 플레이트를 펼쳐을 평평하게하고, vibratome의 실 단계에 그것을 접착제.
    4. 내측 시상-ACC 뇌 조각 다음 (500 μm의 두께) 및 1 산소 ACSF로 녹화 실에 얼음처럼 차가운 산소 aCSF.Transfer 조각에서 그들을 몰입, 지속적인 관류 (12 ml / 분)에서 32 ° C로 유지합니다 시간.

다중 전극 배열 녹화에 대한 관류 상공 회의소 3. 준비

  1. 예비관류 상공 회의소
    1. 다중 채널 시스템에서 MEA 프로브를 배치하고, 연동 펌프에 프로브를 연결하는 두 개의 분리 된 폴리에틸렌 튜브를 사용한다. MEA를 챔버와 챔버 밖으로 ACSF을 안내하는 다른 튜브에 ACSF을 안내하는 하나의 튜브를 사용합니다. 마지막으로, 연속적으로 따뜻한 (29-30 °의 C) 산화 된 ACSF (8 ml / 분)로 제조를 관류.
  2. MEA에 뇌 조각을 전송합니다. 젖은 면봉을 사용하여 MEA에 뇌 슬라이스를 누르십시오. 조심스럽게 ACC는 전극 위에 지향하기 위해 뇌 조각을 이동합니다.
  3. 뇌 조각을 눌러 슬라이스 앵커 키트를 길게 다운을 사용합니다. 이 단계는 슬라이스와 전극 사이의 우수한 전기 접속을 보장한다.

DCS에 의한 전기 분야의 4 세대

주 : 전계 방향의 정의는 ACC axodendritic의 축 방향을 기준으로 하였다. 수상 돌기 및 소마 구획의 방향이었다골지 염색 (12)을 이용하여 확인 하였다.

  1. 누산기에 인접 (양극으로 정의 됨) AgCl을 전극을 배치하고, ACC에 말단 (캐소드로 정의) 다른 전극을 배치합니다. MEA에 의한 두개의 전계 배향 (누산기 axodendritic 섬유에 평행 및 수직)에 의해 생성되는 자기장 강도를 기록 및 자극 장치를 이용하여 전계의 전류를 제공한다.
  2. AgCl을 전극 (약 1.5 cm)의 거리를 수정 한 mA 0.5 내지 2를 DCS을 할 수있는 자극의 현재 강도를 조정합니다.

5. 전기에 의한 두피 시냅틱 응답

주 : 프로그램 가능한 전기 자극 발생기 직사각형 이상성 전류 펄스를 생성하는 MT의 전기 자극에 의​​한 ACC 시냅스 반응을 유도한다.

  1. 위의 반복 제 3 절.
  2. 이동 단말에 텅스텐 전극을 배치하고, thal에 자극에서 펄스를 제공바이폴라 텅스텐 전극을 통해 조각의 아미드 영역입니다.
  3. 에 ACC 응답을 이끌어 임계 값을 결정하기 위해 다양한 전류 강도를 사용합니다. 여기에 대부분의 조각에서 ACC에서 80 %의 최대 반응을 유도 200 마이크로 초의 ± 150 μA의 강도와 지속 시간을 사용합니다.
  4. 최적의 응답 프로파일을 얻기 위해 MT-ACC 슬라이스에 (뇌량에 MT에서)를 thalamocingulate 경로를 따라 텅스텐 전극을 이동합니다.
  5. ACC 응답의 10 ~ 20 스윕을 확인하고 소프트웨어를 사용 MT 자극에 의​​해 유발 ACC 모두 평균을 자동으로합니다. MT-ACC 경로에 의해 MT 자극으로부터 유도 된 ACC에서 시냅스 응답 ISS 결과입니다.

6. 전기에 의한 발작 같은 활동

(250 μM 4-AP) 및 bicuculline (5 μM) 발작 같은 활동은 4 아미노 피리딘의 응용 프로그램에 의해 유도되었다합니다. 이전 시간 제어 연구는 최대 안정적인 반응이 나타난 것을 보여 주었다약물 응용 프로그램 (14) 후 2 ~ 3 시간.

  1. 위의 반복 제 5 절.
  2. 관류 액에 약물을 추가합니다. 4-AP (250 μM) 및 bicuculline (5 μM)를 사용합니다. 균일하게 약물을 혼합하고, 2 ~ 3 시간 동안 재관류를 계속합니다.
  3. 간질 유사 활성을 촉진하기 위해, 또한 pH를 구배의 형성을 방지 할 수있는 상대적으로 빠른 혈류 속도 (8 ml / 분)에서 관류 펌프를 유지한다.
  4. 이동 단말에서 텅스텐 전극을 배치하고 ACC 응답 프로파일을 얻기 위해 전기 자극 (150 μA, 200 마이크로 초 시간)를 제공합니다.
  5. 10 ~ 20 스윕을 확인하고 응답을 평균.
  6. 약을 씻어 신선한 ACSF와 관류 솔루션을 교체합니다. 단계를 반복 6.5.

유발 두피 응답에 DCS 7. 시험 효과

  1. 반복 섹션 3과 4는 균일 한 전계가 M 내부에 배치되는 두 개의 평행 한 AgCl을 코팅은 배선 사이에 전류를 통과시킴으로써 생성된다 확인EA 실. 아무 문제가없는 경우, DCS는 0.5 2mA 사이에 유지됩니다.
  2. DCS의 전원을 끄고 (150 μA, 200 마이크로 초 지속 시간 ±) 시상을 자극 텅스텐 전극을 배치합니다. 는 ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻을 10-20 스윕을하고 응답을 평균합니다.
  3. 동시에 DCS (2 MV / mm의 DCS 강도) 및 시상 자극 (350 μA, 200 마이크로 초 기간)를 켭니다. DCS 동안 시상 자극-유발 ACC 응답의 진폭의 변화를 평가합니다.
  4. DCS의 전원을 끄고 관류 액에 4-AP (250 μM) 및 bicuculline (5 μM)를 추가합니다. 그런 다음 2 ~ 3 시간을 기다립니다. 약물은 뇌 슬라이스에 영향을 미칠 경우, 슬라이스는 대뇌 피질의 발작 반응을 생산하고 있습니다.
  5. ACC 응답의 10 ~ 20 스윕을 확인하고 전기 유발 대뇌 피질의 발작 응답의 진폭과 지속 시간을 측정한다.
  6. 단계 7.5 이후, 동시에합니다 (DCS (2 MV / mm DCS 강도) 및 시상 자극에 150 μA, 200 durati을 설정마이크로 초에). DCS 응용 프로그램 중 진폭과 유발 대뇌 피질의 발작 응답 시간의 변화를 평가합니다.
  7. 약을 씻어 신선한 ACSF와 관류 솔루션을 교체하고 반복 7.2 및 7.3 단계를 반복합니다.
  8. 다른 실험 조건에 데이터를 기록 데이터를 모두 수집하고, 기. 다른 실험 조건 하에서 대뇌 발작 응답의 진폭 및 지속 시간을 평가한다.

8. 데이터 분석

  1. (예를 들어, MC 랙 소프트웨어)가 자동으로 기록 된 응답을 평균 소프트웨어를 사용하여 스프레드 시트에 원시 데이터를 내보낼 수 있습니다. 원시 데이터의 크기와 지속 시간을 분석하고 색상 수치를 생성합니다.
  2. 진동 발작 이벤트를 검출하기 위해, 기준 값 및 표준 편차 (SD)를 측정하기 위해 소프트웨어를 사용한다. 임계 값과 잡음 레벨 3 SD를 설정합니다. 이 임계 값을 능가 발진 이벤트 기간 동안 피크의 진폭은 자동으로 감지됩니다에디션.
  3. 학생의 t의 -test를 이용하여 통계 분석을 수행합니다.
  4. 슬라이스의 수를 나타내는 N으로 고속 측정하고 평균 ± SE로서 텍스트의 변동 (ANOVA) 결과 일방향 분석 12 공부.

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결과

Thalamocingulate 조각과 MEA 녹화 시스템 설치 프로그램의 준비

생쥐에서 MT-ACC 슬라이스가 thalamocingulate 경로의 전기 생리 학적 특성을 탐구 할 수있는 특별한 제제 슬라이스이다.도 1a는 MT-ACC 슬라이스 제조 된 방식을 나타낸다. 마우스의 뇌를 신속하게 제거하고 (도 1A, A, B)의 차가운 ACSF 산소로 유지 하였다. 피질을 해부 공개, 뇌, 시상 뇌 블록을 획득하기 위해 각 반구의 중심선으로부터 2.0 mm 측면을 절단 하였다 (도 1a, C, D). 두 각도 복부 상처는 thalamocingulate 경로를 유지하기 위해 뇌 블록 하였다. 제 광구는 뇌 블록의 전면에서 만들어진, 선조체에 보이는 섬유 관 평행. 제 크로스...

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토론

본 연구에서 ACC 간질 유사 활성에 DCS 기간 및 배향의 영향을 시험 하였다. 마우스 뇌 조각에서 안정적인 데이터를 얻으려면 어떻게 MT-ACC 경로의 무결성을 유지하고,이 각도 복부 상처와 피질의 지느러미를 잘라 만든되는, 특히 단계 핵심 손상을 방지 할 수 있습니다. 또한, 뇌 조각을 준비하는 시간은 신선하고 강한 뇌를 유지할 수 짧은 시간이어야 뇌 슬라이스의 활성에 영향을 미칠 수있다. 이전의 연구 대상 조직에 전기 화학적 손상이 생체 내 준비 15에서 발생할 수있는 것으로 나타났다. 시험 관내 뇌 슬라이스 제제는이 문제를 방지 할 수있다. 시험 관내 대비하여, 조직이 직접 따라서 전기 효과 (16)을 최소화 전극을 접촉하지 않습니다. DCS의 효과는 상이한 방향으로 배향 된 전극과 비교 하​​였다. 때 electrodES는 DCS가 유발 활동 (그림 3)에 영향을 미치지 않았다 90 ° 및 270 °...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

Academia Sinica의 Neural Circuit Electrophysiology Core의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국가과학위원회(National Science Council, 102-2320-B-001-026-MY3 및 100-2311-B-001-003-MY3)와 Academia Sinica의 신경과학 프로그램의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취제:
IsofluraneHalocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
NameCompany카탈로그 번호Comments
aCSF (total:1 L):
D(+)-GlucoseMERCK1.08337.100010 mM
탄산수소나트륨MERCK1.06329.050025mM
염화나트륨MERCK1.06404.1000124mM
(+)-L-아스코르브산나트륨, >=98%SIGMAA4034-100G0.15g/2 cc.c
황산마그네슘, 무수, ReagentPlusSIGMAM7506-500G2mM
염화칼슘 이수화물MERCK1.02382.10002mM
인산이수소나트륨 일수화물MERCK1.06346.10001 mM
염화칼륨5 월 & Baker LTD Dagenham EnglandMS 76164.4 mM
Name>Company카탈로그 번호Comments
Drugs:
(+)-BicucullineTOCRIS01305 µ aCSF
4-아미노피리딘TOCRIS0940250 µ 중 M; M in aCSF
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Brain slice 준비:
VibratomeVibratome시리즈 1000블록 슬라이싱 500 µ m 두께의 슬라이스
NameCompany카탈로그 번호Comments
MEA 시스템:
MEA(Multielectrode Array) 프로브: 6 x 10 평면 MEA다중 채널 시스템60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10전극 직경, 30 & 마이크로; m; 전극 간격, 500 & 마이크로; m; 임피던스, 50 kΩ 200 Hz에서
다전극 어레이 (MEA) 프로브: 8 x 8 MEA AyandaBiosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8피라미드 형 전극; 직경, 40 &마이크로; m; 팁 높이, 50 & 마이크로; m; 전극 간격, 200 & 마이크로; m; 임피던스, 1,000 kΩ 200Hz에서
60채널 앰프는 1,200X 증폭에서 0.1Hz와 3KHz 사이의 대역 통과 필터 세트와 함께 사용되었으며, 다중 채널 시스템MEA-1060-BC
MC 랙 소프트웨어데이터 수집 및 기록용다중 채널 시스템
다중 채널 시스템STG 1002
슬라이스 앵커 키트 및 홀드다운워너 인스트루먼트SHD-26H/10; WI64-0250
연동 펌프-minipuls3GilsomMINIPULS3관류 속도 : 8 ml/min
NameCompany카탈로그 번호코멘트
자극 시스템:
절연 자극기A-M 시스템모델 2100강도 ± 350 &뮤; A, 200 &mu의 지속 시간; sec
텅스텐 전극A-M 시스템575300시상에 배치
, 10KHz 샘플링 속도의 , , 펄스 발생기 제어용 다중 채널 시스템, ,

참고문헌

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