이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.
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이 논문에서
요약
초록
내피 NO-합성 효소 (eNOS의)에서 생산 내피 세포에서 파생 된 질소 산화물 (NO) 심장 혈관 생리학에서 가장 중요한 vasoprotective 분자의 하나입니다. eNOS의의 언 커플 링이 슈퍼 옥사이드 음이온에서 NO 생체 이용률 및 증가 감소 리드로 장애 eNOS의 예 (O 2 .-) 생산, 차례로 심혈관 질환을 촉진한다. 따라서, 내피 세포에서 NO와 O 2 .- 수준의 적절한 측정이 심혈관 질환과 합병증에 대한 연구를위한 중요한 있습니다. 때문에 NO와 O 2 .-의 매우 불안정한 특성 때문에 NO 측정하고, O 2 .- 직접 혈관에 어렵다. 수많은 방법은 NO 측정 및 O 2 .- 생산하기 위해 개발되었습니다. 이것은, 그러나, 어느 둔감 또는 비특이적 또는 기술적으로 요구하고, 특수 장비를 필요로한다. 여기에 우리가 적응을 설명얼굴의 동시 검출 및 세포 NO와 O 2의 시각화 도중에 .- 유도 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에 각각 세포 투과성 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하는 형광 염료 방법 높은 지방 다이어트 먹이로. 제어 린 마우스에 비해 우리는 비만 마우스의 갓 고립 그대로 대동맥 2 .- 수준을 세포 내 NO 감소 O를 향상 것을 보여줍니다 수 있습니다. 우리는이 방법은 직접 검출 및 시각화 NO와 O 2를위한 쉬운 기술 .- 그대로 혈관에 널리 (물리 치료사) 병리학 적 조건에서 내피 (DYS) 함수의 조사를 위해 적용 할 수 있다는 것을 보여줍니다.
서론
혈관 내피 세포는 혈관 활성 인자 1을 해제하여 혈관 기능 및 구조적 무결성을 유지합니다. 이러한 요인 중 내피 NO 신타 제 (eNOS의)를 통해 L 아르기닌으로부터 생성 내피 - 유도 질소 산화물 (NO)이 심혈관 생리학에서 가장 중요하고 가장 특징 요소이다. NO 따라서 혈관 질환 개발 3 보호에 피하 공간으로 혈소판 응집 및 염증 세포의 부착 및 침윤을 억제 평활근 이완을 유발하고 세포 증식을 억제한다. 등 노화, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 등 많은 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 특징 내피 기능 장애는 NO 생체 이용률을 감소하지 않고 O 2 .- 생산이 존재하고 동맥 경화증 2의 발병을 촉진 증가했다. 최근의 연구에서 eNOS의 언 커플 링이를이 있음을 입증다양한 상기 조건 1,4에서 eNOS의 효소는 O 2를 생성하는 내피 기능 장애, .- 대신 NO의 중요한 메커니즘. 따라서, 혈관 내피 기능의 분석, 특히 NO 생산 내피없고 O 2 .- 생성 심혈관 질병 및 합병증에 대한 실험적 연구에 중요한 것이다.
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프로토콜
동물 작품은 프리 부르, 스위스의 수의학 사무실의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 우리 기관에서 동물 관리 및 실험에 대한 가이드 라인을 따른다.
격리 된 동맥의 배양을위한 셋업 1. 준비
- 37 ° C로 가열하고, 탄소 가스 탱크 95 % O 2, 5 % CO 2 통기 될 수 기관 욕 시스템을 구축.
- 다음 조성물의 농도가 필요한만큼 크렙스 - 링거 중탄산 버퍼 준비 (118 mM의 염화나트륨, 4.7 mM의 KCl을 2.5 mM의 CaCl2를 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 NaHCO3을, 0.026 mM의 EDTA, 11.1 mM의 글루코오스 D).
- 얼음에 주식 버퍼를 유지하고 95 % O 2 5 % CO 2와 버퍼를 공기에 쐬다.
- 오르간 조 시스템 스위치는 37 ° C의 온도를 설정 한 각 실에 즉시 사용 완충액 5 mL를 추가95 %의 O 2 5 % CO 2와 버퍼를 폭기 유지. <....
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결과
비만은 허혈성 심장 질환의 주요 위험 인자와 관련된 어떠한 생물학적, 동맥 경화성 혈관 질환 (21)의 특징 내피되지 감소된다. -eNOS의 언 커플 링 (22), 죽상 동맥 경화증, 비만 14 노화 등 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 내피 기능 부전의 중요한 메커니즘으로 도시되었다. 따라서, 우리가 대표 NO의 결과와 O 2 .- 대동맥의 수준을 보여 마른 비만 쥐를 비교합니다.
10.6 %, 지방 27.6 %의 단백질, 57 %의 탄수화물, 섬유 4.8 % 에너지 함량 7 주 세의 나이에 시작, 수컷 생쥐 (C57BL / 6J)는 중 정상 우 (NC 14 주 동안 무료로 액세스 권한을 부여했다 ) 또는 고지방식이 (HFD 에너지 함량 : 55 %.......
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토론
NO 또는 O (2)의 검출 .- 형광 염료 자주 조직 저온부 (23)에 또한 배양 된 내피 세포에서 많은 연구에 사용 하였다. 여기에서 우리는 얼굴 NO의 검출 및 O 2 .-, 비교적 간단하고 직관적 인 효과가 각각 DAF-2DA 및 DHE,와 내피 층의 수준 도중, 즉 그대로 살아있는 혈관에이 방법을 확장했다. 동맥 미디어 탄성 섬유, 특히 저온부에서 대동맥 특정 NO 또는 O이 방해 할 수있는 매우 강한 형광도 신호를주고 이후 혈관 저온부의 방법에 비해,이 방법은 낮은 배경 프로그램 등 정량적이다. - 내피 세포에서 생성 된 신호. 또한, 내측 평활근 세포의 NADPH 산화 효소 또는 다른 효소에 의해 특이 O 2 .- 생성은 방해 할혈관 저온부와 방법의 문제점을 나타내는 부분의 혈관에서 혈관 내피.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립과학재단(310030_141070/1), 스위스심장재단, 스위스 국립연구역량센터(NCCR-Kidney.CH)의 지원을 받았습니다. Yu Yi는 중국 장학금 위원회의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 디 하이드로 에티듐 (DHE) | Invitrogen | D 1168 | DMSO로 5 mmol/L을 1,000x 재고로 저장, -20 에 저장; &데그; C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | DMSO로 용해 5 mmol/L을 1,000x 재고로 저장, -20 에 저장; &데그; C |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | 물로 300 &마이크로; mol/L을 1,000x 재고로 4 에 저장; &데그; C |
| 장착 매체 | 벡터 노동. (리액톨랩) | H-1000 | |
| Nω -Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| 다중 근사진 시스템 | 덴마크 Myo Technology A/S | 모델 610M | |
| 현미경 | Nikon | SMZ800 | |
| 컨포칼 현미경 | 라이카 | DM6000 | |
| 이미지 처리 소프트웨어 | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| 수술용 가위 | 에스& T AG | SDC-11 | |
| 미세수술용 가위 | F.S.T | 15000-01 | |
| 겸자 | S& T AG | JF-5 | |
| 커버슬립 원형 직경 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| 팁 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| 팁 200 μ l | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml | Eppendorf | ||
| 아세틸 콜린 클로라이드 | 시그마 알드리치 | A-6625 |
참고문헌
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149(2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837....
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재인쇄 및 허가
