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방법 논문

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

11.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

2016년 1월 24일

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 IRF3 전사 인자의 인산화 의존적 활성화에 대한 자세한 분석을 허용하는 절차를 설명합니다. 이는 여러 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다.

초록

IRF3 전사 인자는 주로 인터페론 β 및 항바이러스 유전자 발현을 통해 병원체에 대한 1차 방어선에 중요합니다. IRF3 활성화에 대한 자세한 분석은 병원체가 선천적 항바이러스 반응을 유도하거나 회피하는 방법을 이해하는 데 필수적입니다. IRF3의 뚜렷한 활성화 형태는 인산화 및 단량체 대 이량체 상태에 따라 구별할 수 있습니다. IRF3의 서로 다른 활성화 종 간의 생체 내 구별은 SDS-PAGE의 이동성 이동을 기반으로 IRF3 인산화 형태의 분리를 통해 달성될 수 있습니다. 또한 IRF3 단량체 및 이량체의 수준은 비변성 전기영동을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 여기에서는 IRF3 활성화 상태에 대한 가장 많은 정보를 얻기 위해 최고 해상도에 도달하는 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이는 여러 개의 총 및 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다. 이 실험 전략은 IRF3의 인산화 매개 활성화에 대한 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기 위한 저렴하고 민감한 접근 방식을 구성합니다.

서론

재하와 구조적으로 표현 전사 인자 인터페론 (IFN) 규제 요인 3 (IRF3)는 주로 IFNβ의 유도를 통해 병원균에 대한 방어의 첫 번째 줄에 중요뿐만 아니라, 케모카인 (CC 모티브)의 유도 리간드 (5) (CCL5 통해 ) 및 tetratricopeptide와 인터페론 유도 단백질 등 여러 가지 바이러스 단백질은 IFIT1 / 2 / 3월 1일부터 3일까지 반복합니다. 또는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 4 : IRF3 활성화 polyinosinic - polycytidylic 산 (C 폴리 I)에 다음과 같은 다수의 바이러스 감염 또는 노출을보고되었다. 중요한 것은, 대부분의 연구 바이러스는 IRF3 매개 응답을 회피하고, 이에 호스트 선천성 면역 방어 5 탈출 메커니즘을 진화했다. 따라서 IRF3 활성화를 모니터링하는 것은 선천성 바이러스 숙주 방어의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 또한 본 반응을 방해하는 바이러스에 의해 사용되는 전략을 식별하는 데 매우 중요하다.

ENT "> 많은 출판 리포트 그러나 저해상도 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 IRF3 표적 유전자 도입의 모니터링 (IFNB1 및 IFIT1)에 의해 수행 IRF3 활성화 및 / 또는 루시퍼 라제 리포터 유전자 분석의 제한된 분석을 제공 (SDS- PAGE) IRF3 분석. 그러나, 다수의 생화학 적 연구는 다양한 IRF3 돌연변이 IRF3 결정 구조 6-11의 해명의 행동 분석에서의 인산화에 의해 순차 번역 후 변형의 복잡한 실시된다 IRF3를 확립 기여 여러 사이트. IRF3 활성화에 관여하는 인산화의 집합은 세포 유형의 자극에 따라 가장 가능성이있을 것으로 보인다. 감염되지 않은 세포에서 IRF3 비 인산화 및 인산화되어 종은 1, Thr135 및 Ser173 포함 phosphoresidues을 포함하는 것으로 공존 -198 AA의 N 말단 지역 6,12-14.이 인산화되어 F의 축적IRF3의 ORM은 스트레스 유도, 성장 인자 및 DNA를 손상 에이전트 (6)에 의해 유도된다. 전이 활성화 영역을 포함 IRF3의 C 말단 영역에서 빼앗아 /의 Thr 잔기의 인산화에 의해 활성화 바이러스는 다음의 트리거됩니다 폴리 I : 셀형 의존적 15-17에서 C 또는 LPS. IRF3의 C- 말단 인산화는 각각 이합체를 통해 IRF3 활성화, 핵 축적, CREB와 관련에 기여, 두 가지 주요 클러스터, Ser385 / Ser386 및 Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 구성에는보다 7 별개의 phosphoacceptor 사이트를 포함하지 - 결합 단백질 (CBP) / P300의 공동 활성화 인자, 민감한 반응 요소 (ISRE) 합의 시퀀스 및 표적 유전자 9,10,17-19의 전이 활성화를 IFN하는 DNA 결합. Thr390의 인산화는 또한 바이러스 - 유도 IRF3 활성화 (20)에 기여하는 것으로 생각된다. 질량 분석은 IRF3 분석 Ser386, Thr390, Ser396 및 Ser402 잔류 물이 직접 phosphorylat 것을 증명하고있다κB 키나제 ε의 억제제 (IKKε)에 의해 에드 / 탱크 결합 키나제 1 (TBK1)는 9,10 키나아제. C- 말단 잔기의 인산화는 polyubiquitination 및 프로 테아 매개 저하 (10)를 통해 IRF3 활성화의 종료가 필요합니다. 이 과정은 또한 프로필 이성화 핀 1 10, 11의 채용에 필요한 Ser339의 인산화에 따라 달라집니다. 적어도 포스 Ser339 / 396분의 386 잔류 물을 포함 IRF3 종은 hyperphosphorylated 형태로 간주됩니다. 각 사이트의 정확한 순서와 기능은 토론 10,21의 문제가 남아있다. 그것은 활성화 IRF3가 균일 한 상태를 나타내지 않는,하지만 별개의 인산화 또는 이량 특성을 나타내는 서로 다른 활성 종 10,22 존재 이니까 분명하다.

특정 병원체에 응답 IRF3 활성화의 완전한 이해를 제공하기 위해, 그것은으로 Ch 필요가있다유도 활성 종의 어느 aracterize. IRF3 대상 유전자, IFNB1 및 IFIT1의 유도는 IRF3 활성화를위한 신뢰할 수있는 판독을 제공하기 위해 입증되었습니다. 그러나, 이들 유전자의 발현을 모니터링 IRF3의 다른 활성화 상태를 구분하지 않습니다. 특정 설정에서 IRF3 활성화 상태의 포괄적 인 분석은 인산화 및 이량 상태 (10)의 상세한 특성에 의존한다. Unphosphorylated (폼 나는), (II 형) 및 hyperphosphorylated, 인산화 (형태 III 및 IV) IRF3 양식 6,18,23이 성공적으로 고해상도의 SDS-PAGE 분석 감소 이동성을 해결할 수 있습니다. 단량체 및 이량 IRF3 종 효율적 네이티브-PAGE 분석에 의해 식별 될 수있다. 별개의 IRF3 phosphoacceptor 부위에 대해 지시 한 포스 포 항체와 조합하여 사용할 때 이러한 방법이 크게 개선된다.

표준 프로토콜의 가난한 해상도를 허용별개의 IRF3 인산화 된 형태의 효율적인 분리를 허용하지 않습니다 단백질. 여기서는 총 및 포스 포 - 항체를 사용하여 면역 블롯과 조합 네이티브-PAGE에 결합 SDS-PAGE를 이용하여 고유 바이러스 활성 IRF3 종의 유도를 모니터링하기 위해 높은 해상도를 얻기 위해 상세 절차를 설명한다. 활성화 된 다른 간의 생체 차별 IRF3 형태의 SDS-PAGE상에서 관찰 그들의 이동성 변화에 기초하여 수행된다. 또한 IRF3 단량체 및 이량 체는 비 변성 전기 영동으로 구별 될 수있다. 면역 이들 두 기법의 상보 결합 IRF3의 인산화 - 매개 활성의 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기위한 저렴하고 민감한 방식으로 증명한다.

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프로토콜

주 : 프로토콜 센다이 바이러스 (SEV) 감염 A549 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 그러나, SDS-PAGE 및 기본 페이지에 대한 프로토콜은 지금까지 테스트 한 모든 인간과 쥐의 세포 유형, 다양한 IRF3-활성화 자극 9,15,19,24,25 자극 특히 골수 세포와 함께 작동합니다.

A549 세포의 감염 1.

  1. 37 ° C / 5 % CO 2 (20)에 15cm 플레이트에서 배양 A549 세포를 유지 ml의 10 %를 열 불 활성화 소 태아 혈청 (HI-FBS), 1 % L- 글루타민을 함유하는 F12K / 햄 배지 (완전 F12K / 햄 매체).
    참고 : 세포 배양 및 치료에 사용되는 모든 솔루션은 멸균해야합니다.
  2. 감염 전에 24 시간에서 매체를 기음과 증류수 인산염 완충 생리 식염수 실온에서 (D-PBS) 10 mL로 세포를 씻어.
  3. 세포를 커버하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하기 위해 각 플레이트에 0.25 % 트립신 EDTA 용액 1ml를 추가합니다.
  4. 빨리 번째로 부화 중지전자 세포는 부드럽게 한 손으로 판을 눌러 판에서 분리하기 시작. 접시 당 예열 완전한 F12K / 햄 10 ml의 배지를 첨가함으로써 트립신을 불 활성화하고 15ml의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다.
  5. 실온에서 3 분 동안 350 XG에 원심 분리기. 상등액을 제거하고 균일 한 단일 세포 현탁액을 얻었다 완전한 F12K / 햄 매질 8 ml 중에 세포 펠렛을 재현 탁.
  6. 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 예열 완료 F12K / 햄 배지 4 ㎖ 중의 60mm 판 당 1 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드. 부화 20 - 37 ℃ / 5 % CO 2에서 24 시간 후에는 20 - 24 시간, 세포는 90 % 컨 플루 언트 단층 (이 1.5 × 106 세포에 상당)을 형성.
  7. 매체를 제거하고 혈청이없는 F12K / 햄 매체의 2 ㎖ (SFM)로 세포를 씻어. 60mm 판 당 신선한 SFM 2 ㎖를 추가합니다.
  8. 간단히 얼음과 소용돌이에 (저장 -80 ° C에서 분주) 센다이 바이러스 (SEV)의 나누어지는을 녹여.
  9. 일을 희석예열 SFM의 E 바이러스 60 HAU / 100 μl를 얻었다. 아래로 부드럽게로 pipetting에 의해 혼합 40 HAU / 10 6 세포에 감염을 수행 할 판 당 희석 바이러스 100 μl를 추가합니다. 감염되지 않은 제어 판에서 바이러스를 추가하지 마십시오.
  10. 37 ° C / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 손으로 3 또는 4 회 플레이트를 교반하거나 감염의 최초 시간 동안 인큐베이터에 직접 배치하는 자동 궤도 또는 요동 쉐이커를 사용.
  11. 2 시간의 감염 후에서 10 % HI-FBS의 최종 농도를 얻기 위해 20 % HI-FBS를 포함하는 F12K / 햄 배지 2 ㎖를 추가한다.
  12. 각각 3, 6, 9 hr의 총 감염 시간에 도달하기 위해 추가 1, 4, 7 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 이 시점 각각에서 2.1 단계로 진행합니다.

전 세포 추출물 2. 준비 (WCE)

  1. 감염 매체를 제거합니다. 1 ㎖에 의해 긁어 세포 수확빙냉 D-PBS로 미리 냉각 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
  2. 20 초 동안 4 ℃에서 16,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠릿 신중 D-PBS의 모든 흔적 캔트.
    주 :이 단계에서, 세포 펠렛을 직접 단백질 추출 또는 플래시 냉동 액체 질소 나 드라이 아이스 / 에탄올 욕과 용해 될 때까지 -80 ℃에 보관을 실시 할 수있다.
  3. 의 50 mM HEPES pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 10 % 글리세롤, 1 % Nonidet P-40 탈 이온수를 함유하는 용해 버퍼를 준비한다 (DDH 2 O). 즉석에서 프로테아제 (1 μg의 / ㎖ 류 펩틴 및 2 μg의 / ㎖ 아프로 티닌) 및 포스파타제 억제제를 추가 (5 mM의 불소화 나트륨을 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트 2 mM의 P 니트로 페닐 포스페이트, 10 mM의 β-글리세 산도 7.5 활성화).
    주 : 억제제없이 용해 버퍼는 4 ℃에서 저장 될 수있다. 나트륨 오르토 바나 데이트의 활성화를위한 특정 프로토콜은 특정 시약 / 산업 장비의 표에 설명되어 있습니다NT.
  4. 용해 완충액 70 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 일반적으로 해물 농도 / μL 약 2 μg의 것입니다.
  5. 얼음에서 20 분 동안 배양한다. 15 초 동안 액체 질소 용기에 배양하여 해물을 플래시 동결. 그것은 완전히 10 초 동안 용융 소용돌이 될 때까지 실온에서 해물을 해동. 동결 / 해동 / 소용돌이 사이클을 3 회 반복합니다.
    1. 대안 적으로, 1 분 동안 에탄올 / 드라이 아이스 배스에서 동결 단계를 수행한다.
  6. 20 분 동안 4 ℃에서 16,000 XG에 원심 분리기. 새로운 사전 냉장 1.5 ML의 원심 관에 뜨는 (WCE에 해당)를 전송합니다. 항상 얼음에 WCE를 유지합니다.
  7. 이러한 브래드 포드 단백질 기반 분석 (26) 용해 완충액과 호환 어떤 단백질 정량 방법을 사용하여 단백질을 정량.

높은 해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE 3. 해상도

  1. 세 변성 전기 영동 젤을 준비합니다.
    1. 감응(1 37.5), 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS IRF3 형태는 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드로 이루어지는 분리 겔 16cm 길이의 최소 두 겔을 부어 ), 1 %과 황산 암모늄 0.1 % DDH 2 O에 TEMED 및 4 %의 아크릴 아미드로 이루어지는 적층 겔, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 0.05 % SDS, 1 %과 황산 암모늄 0.1 %의 DDH 2 TEMED 영형.
      주의! 아크릴 아미드, TEMED 및 SDS는 독성 및 / 또는 자극이다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다.
    2. SEV 단백질의 검출을 위해, 분리 겔은 12 % 아크릴 아미드를 포함하는 것을 제외하고, 3.1.1에 기술 된 겔과 유사한 특성을 갖는 8.5 cm 길이의 최소 하나의 겔을 붓는다.
  2. 1 가산함으로써 단계 2.6에서 수득 WCE 변성 : 4 (v / v)의 5 배의 로딩 완충액 (125 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 10 % SDS, 20 % (P / V) 글리세롤, 0.0005 % 브로 모 페놀 블루 및 100 ℃에서 가열 하였다 DDH 2 O의 25 % β-머 캅토 에탄올)10 분 동안 C. 빠른 스핀 튜브 캡에 형성 응축을 가지고 있습니다.
    주의! β-머 캅토 에탄올 흡입 독성. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다.
  3. 마이그레이션 장치에서 젤을 탑재합니다. 25 mM 트리스 - 자료, 0.1 % SDS 증류수에 192 mM의 글리신 (DH 2 O)를 포함하는 버퍼를 실행하는 상부 및 하부 챔버를 입력합니다.
  4. 로드 각 16cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 14 μL와 8.5 cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 7 μL. IRF3 형태 검출 단계 3.1.1에서 제조 한 두 겔의 웰 당 변성 WCE의 30 μg의 부하 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 부하 8 - SEV 분석 단계 3.1.2에서 제조 한 겔 변성 WCE 웰 당 10 μg의 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨).
  5. 이주 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 정전류 30mA에서 젤을 실행.
    참고 : 마이그레이션은 일반적으로 approxima 지속tely 16cm 젤 3 시간과 8.5 cm 젤 45 분.
  6. 니트로 셀룰로오스 막 (5 단계) 상에 전송 진행합니다.

기본-PAGE에 의해 IRF3 이합체 4. 분석

참고 :이 방법은 원래 박사 T. 후지타 (27)의 그룹에 의해 설명되었다.

  1. (-) 및 하부 (+) 챔버 전기 영동 버퍼 상단을 준비합니다. 상부 챔버 버퍼는 DDH 2 O 25 mM 트리스 - 염산 pH가 8.4 (RT), 192 mM의 글리신과 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 (DOC)로 구성 하부 챔버 버퍼 DDH 2 O. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 8.4 (RT) 및 192 mM의 글리신을 포함
    주 : 상부 및 하부 챔버 전기 버퍼를 사용할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 그러나,이 전기를 수행하기 전에 실온으로 미리 예열되어 있는지 확인합니다.
  2. 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 1 % 탄약 : 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (37.5 1)를 함유하는 8.5 cm 길이의 최소 비 변성 겔을 붓고 해결DDH 2 O.에서 TEMED 천년 황산 0.1 %
  3. 얼음에 30 분 동안 40mA 정전류에서 젤을 사전 실행합니다. 대략 하부 챔버 영동 버퍼의 레벨을 얼음에 주행 장치를 누른다. 이것은 겔이 얼음에없는 것이 중요하다.
  4. 1 (v / v)의 DDH 2 125 mM 트리스 - 염산 pH가 6.8 (RT), 30 % 글리세롤 및 0.1 % 브로 모 페놀 블루를 포함하는 오 : 사전 실행하는 동안 WCE는 2 배 기본 페이지 로딩 버퍼 1 얼음에 보관 혼합
  5. 부하 8 - 즉시 프리 런의 끝에서 (단계 4.4에 기재된 바와 같이 제조)의 10 μg의 WCE.
  6. 프리 런에 대해 상술 된 바와 같이 이주 전면 겔 (약 40 분)의 바닥에 도달 할 때까지, 얼음에 25mA의 정전류에서 겔을 실행.

IRF3 종 5. 면역 블롯 분석

  1. DDH 2 O. 25 mM 트리스 -베이스 및 192 mM의 글리신을 함유하는 전송 버퍼를 준비 냉장 사용하기 전에 4 ° C에서 전송 버퍼.
  2. 니트로 셀룰로오스 막 습윤 세 조각 전송 버퍼를 포함하는 플라스틱 / 유리 상자 겔보다 약간 큰 크기로 잘랐다. 한 코너를 절단함으로써 막의 배향을 나타낸다. 전송 버퍼는 3 번 재사용 될 수있다. 용도 사이에 4 ° C에서 버퍼를 저장합니다.
  3. Uncast 겔 (SDS-PAGE 및 기본-PAGE)과 올바른 방향에 대한 각 젤의 한 모서리를 잘라.
    1. 네이티브-PAGE를 들어, 전송 버퍼에 전송하기 전에 DOC를 제거하기 위해 SDS-PAGE에서 러닝 버퍼에 적어도 30 분 동안 교반과 함께 RT에서 겔을 부화.
  4. 10 분 - 5 전송 버퍼에서 겔 (SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE)를 배양한다.
  5. 양극 (폼 패드 / 종이 필터 / 멤브레인 / 젤 / 필터 종이 / 폼 패드)을 향해 막으로 전송 카세트에 젤 당 전송 샌드위치를​​ 탑재합니다. 샌드위치의 층 사이에있는 모든 거품을 제거하기 위해주의해야합니다.
  6. 추천 B로 전송을 수행Y 사용 전송 장치 제조업체.
    참고 : 흔들 또는 궤도 떨고 플랫폼에서 다음 단계의 모든 배양 및 세척을 수행합니다.
  7. 전송 시간의 끝에서, DDH 2 O. 7 % 아세트산, 40 % 에탄올을 3 % 글리세롤을 함유하는 고정액에 15 분 동안 막을 배양 세포막을 씻어 PBS의 3 배 5 분 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10.2 밀리미터 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4 DH 2 O에서).
    주의! 아세트산은 독성, 자극과 가연성이다. 보호 장갑을 착용하고, 흄 후드에서 조작 할 수 있습니다.
    주 : 고정 용액은 여러 번 재사용 될 수있다.
  8. 기본 페이지 막 들어 5.11 단계로 바로 진행합니다.
  9. DDH 2 O.에서 6.57 mM의 붉은 개양귀비 빛 1 % 아세트산을 함유 개양귀비 빛 적색 용액에 1 분 동안 배양 하였다 그들을 DH 2 O 빠르게 세 SDS-PAGE 막을 린스
    주 : 빨간 개양귀비 빛 솔루션은 R 수 있습니다 수회 eused.
  10. 배경이 빨간색으로 염색 단백질 밴드를 볼 수있을만큼 흰색 때까지 DH 2 O의 세포막을 씻어. 연필로 표시를 참고 단백질 주위 초과 막 잘라. 교반하면서 PBS에서 5 분 동안 인큐베이션 막을 Destain.
  11. 블로킹 용액에 4 ° C (PBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 비 지방 건조 우유를 함유하는 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 막을 배양한다 (PBS-T-우유). 상기 멤브레인을 3X 5 분간 씻어 PBS-T.
    주 : PBS-T 세척 선택적 5 % 소 혈청 알부민 (PBS-T-BSA) 다음 단계에서 (도 1 및 표 1)을 함유하는 PBS-T에 희석 항체를 적용 할 때 엄격하게 요구된다.
  12. . 그림 1 및 표 1에 설명 된 순서에 따라 차 항체 (SDS-PAGE 및 네이티브 페이지에서) 네 멤브레인을 품어 PBS-T에서 5 배 5 분 세척을 수행합니다.
"> figure-protocol-1
면역 블롯의 분석 그림 1. 순서. 계통도에서는 다양한 IRF3 인산화 및 이량 체 / 단량체 형태를 감지하는 데 필요한 개별 SDS-PAGE 및 기본-PAGE 젤을 설명합니다. 면역 과정의 각 겔로부터 생성 된 막에인가 된 항체의 구체적인 순서를 설명한다. 항 - 액틴 항체는 다른 특이적인 항체를 적용하기 전에 샘플의 동일한 로딩을 위해 사용되는 제 유의. 항 - 액틴 항체 대체 시퀀스는 또한 동작, 항 - 포스 포 IRF3 항체 후에 적용된다. 스트립 안티 굴지 및 안티 SEV 항체 또는 항 - 포스 IRF3 때문에 신호의 크기를 중복 방지 IRF3 항체 사이에 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

차 항체 노동 희석 희석 버퍼 잠복 차 항체 댓글
안티 굴지 1 / 10,000 PBS-T-BSA RT에서 15 분 반대로 마우스 SDS-PAGE 후 사용
0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다.
안티 IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N 4 ° C에서 안티 - 토끼 기본-PAGE 후 사용하십시오.
그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다
안티 IRF3-P-Ser396 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N 4 ° C에서 안티 - 토끼 SDS-PAGE 후 사용하십시오.
그것은 희석 된 항체 안티 IRF3-P-396은 또한 세포 신호에서 사용할 수 있습니다 재사용하지 않는 것이 좋습니다. 최적의 희석이 항체에 대한 1 / 1,000로 정의 하였다, 그러나 많은 사이에 차이가있을 수 있습니다.
안티 IRF3-P-Ser398 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N 4 ° C에서 안티 - 토끼 SDS-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다
안티 IRF3 전체 길이 1 / 7,500 PBS-T-우유 실온에서 3 시간 안티 - 토끼 SDS-PAGE 후 사용하십시오. 안티 IRF3 전체 길이 항체 네이티브-PAGE 후에 사용될 수 있지만, 단량체를 검출에 덜 민감하다. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 된 항체는 여러 번 재사용 될 수있다.
안티 IRF3-NE에스 0.5 μg의 / ㎖ PBS-T-우유 실온에서 3 시간 안티 - 토끼 기본-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다.
안티 SEV 1 / 14,000 PBS-T-BSA 실온에서 3 시간 안티 - 토끼 SDS-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다.
참고 : HRP 결합 된 이차 항체에 사용되는 희석 ​​버퍼는 한 회사에서 다른 변화에 따라 최적화 될 필요가있다.

항체의 표 1. 사양은 면역 블 롯팅 절차에 사용됩니다.

  1. (인사를 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 세포막을 품어P)는 그림 1과 표 1에 설명 된대로 차 항체를 π 공역. 완전히 트윈의 흔적을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS에서 2 배 5 분 뒤에 PBS-T에서 5 배 5 분을 씻으십시오.
  2. 완전히 막을 덮을 향상된 발광 시약의 부피로 1 분 동안 막을 배양한다. 여과지를 사용하여 멤브레인을 건조.
  3. 면역 밴드를 시각화하기 위해 발광 영상 분석기에서 세포막을 놓습니다.
    1. 대안 적으로, 민감한 X 선 필름을 사용하여 면역 반응성 밴드의 검출을 수행.
  4. PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오.
    주 :이 단계에서 멤브레인 건조하게 유지 될 수있다. 상기 스트립이 요구되는 경우, 이는 막 건조 전에 스트리핑을 수행하는 것이 낫다. 막은 또한 PBS 단기 저장 될 수있다.
  5. 항체와 배양 사이에 제거 필요하지 않은 막 들어 단계로 바로 진행합니다 (그림 1 참조)5.20.
  6. 스트리핑은 항체, 50 ° C에서 DDH 2 O 2 % SDS, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT) 및 0.7 %의 β 머 캅토 에탄올을 함유하는 예비 가온 스트리핑 용액 막을 배양 (도 1 참조) 사이에 요구되는 경우 일반 교반하면서 20 분. PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오.
    참고 : 제거 절차를 수행하는 동안 교반이 핵심입니다. 스트리핑은 혼성화 오븐에서 수행 될 수있다. 대안 적으로, 수욕 비닐 봉투에 밀봉 침지 멤브레인을 사용하여 수행 될 수있다 스트리핑. 배양 동안 5 회 -이 경우, 멤브레인 (4)을 교반을하는 것이 중요하다.
  7. PBS-T-우유에서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 세포막을 품어.
  8. 반복 그림 1 항에있어서 5.16로 5.12 단계를 반복합니다.

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결과

그림 2는 고해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE의 해상도 후 Ser396 및 Ser398에 대한 IRF3 총 항체 및 IRF3 - 포스 포 - 항체 검출 IRF3의 전형적인 면역 이미지를 보여줍니다. 자극되지 않은 A549 세포에서, IRF3은 50 개의 대역과 비 - 인산화 (형태 I)에 대응하는 SDS-PAGE의 53 kDa 이상, 인산화 결정 (II)의 IRF3 종으로서 검출된다. 시간에 따른 변화에 9 시간 결과 천천히 나는를 양식에서 잘 구별하고 II hyperphosphorylated 형태 III 및 IV를 마이그레이션하기 - A549 세포의 노출은 3가 SEV합니다. hyperphosphorylated 밴드 kDa의 55-57에 이동한다. 형태 III과 IV는 특히 Ser396과 Ser398에 대한 포스 포 항체를 사용하여 immunodetected 있습니다. 굴지의 면역은 차선 사이에 동일한 부하의 제어 역할을합니다. SE...

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토론

우리는 여기 설명 프로토콜 IRF3의 이합체 / 단량체 및 phosphoforms I-IV를 구별하기 위해 여러 포스 포 항체의 용도에 결합 고해상도 SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE의 조합으로 이루어져있다. 이 IRF3 종의 적절한 검출은 완전히 특정 설정에 IRF3 활성화를 특성화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 활성화 된 대 식세포의 LPS의 자극, 인산화 (II 형)를 전시 이량 체, Ser396 / 398 인산화 ​​IRF3의 형성을 유도하지만, SDS-PAGE 15 (형식 III 및 IV), 패턴을 hyperphosphorylated 없습니다. 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 프로파일은 Ser386 및 Ser396의 인산화 (10)에 더하여 추가 Ser339의 인산화를 필요로 바이러스 - 유도 hyperphosphorylated 형태로부터 구별 될 수있다. 중요한 것은,이 또한 이량을 나타내지 만, 전사적으로 10 활성하지 Ser396 인산화 종을 구별...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 프로토콜 개발에 대해 실험실의 이전 및 현재 구성원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(CIHR)[보조금 # MOP-130527]와 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회[NSERC-355306-2012]의 자금 지원을 받았습니다. NG는 Tier II 캐나다 연구 의장을 수상했습니다. AR은 Fonds de la recherche du Québec-Santé(FRQS)의 Respiratory Health Research Network의 교육 프로그램에서 학생으로 선정되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
F12/HamLife Technologies11765-05437°C에서 웜; 사용 전 C 목욕.
소 태아 혈청Life Technologies12483-020
L-글루타민Life Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144세포 배양용.
트립신/EDTA 0.25%Life Technologies25200-072
센다이 바이러스 Cantell 균주Charles River Laboratories600503
HepesBioshopHEP001
염화나트륨(NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
글리세롤BioshopGLY001.1팁과 피펫의 끝부분을 매우 두껍기 때문에 천천히 자릅니다.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771등록 상표는 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) 세제
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 에 해당합니다.
불화나트륨시그마-알드리치(Sigma-Aldrich201154
오르토바나데이트나트륨(Sodium orthovanadate) MP Biomedicals159664오르토바나데이트나트륨(sodium orthovanadate)의 활성화 0.2 M : 1) 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH를 10.0으로 조정합니다. 오르토바나데이트 나트륨 용액의 시작 pH는 많은 화학 물질에 따라 달라질 수 있습니다. 2) 용액은 pH 10.0에서 황색입니다. 3) 무색이 될 때까지 끓인다. 4) RT로 식힙니다. 5) pH를 10.0으로 다시 조정하고 용액이 무색으로 유지되고 10.0에서 안정화될 때까지 3-4단계를 반복합니다. 활성화된 오르토바나데이트 나트륨 부분 표본을 -20 °C에서 보관합니다.
p-니트로페닐 포스페이트 디소듐 염 헥사하이드레이트시그마-알드리치P1585
베타-글리세로인산시그마-알드리치G6376 
Bio-Rad 단백질 분석 시약 바이오 라드500-0006 세포 독성
아크릴아미드/비스-아크릴아미드 (37.5 : 1) 40%BioshopACR005 세포 독성
Tris-BaseBioshopDEO701
염산 (HCl)LabChemLC15320-4 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 독성이 있고 자극적입니다.
소듐 도데실 설페이트 (SDS)BioshopSDS001.1 자극.
과황산 아모늄Sigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010독성 및 자극성.
브로모페놀 블루Fisher ScientificB392-5
베타-메르캅토에탄올Sigma-AldrichM6250흄 후드 아래에서 작동합니다. 신경계, 점막에 독성이 있습니다. 상부 호흡기, 눈, 중추 신경계에 독성이 있을 수 있습니다.
GlycineBioshopGLN001.5
소듐 데옥시콜레이트Sigma-AldrichD6750
소듐 하이드록사이드 (NaOH)BioshopSHY700 자극.
니트로셀룰로오스 멤브레인(0.45mm)Bio-Rad162-0115
아세트산 빙하BioshopACE222.4흄 후드 아래에서 작업합니다. 독성, 자극성 및 가연성.
레드 폰소시그마-알드리치P3504   
염화칼륨 (KCl)Sigma-AldrichP3911 면역블롯을 위한 PBS 조성물.
Na2HPO4BioshopSPD307.5면역블롯용 PBS 조성용.
KH2PO4시그마-알드리치P0662 면역블롯을 위한 PBS 조성물.
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7906면역블롯을 위한 PBS-T-BSA 조성.
무지방 분유Carnation
Poly sorbate 20 (Tween)MP Biomedicals103168팁과 피펫의 끝부분을 매우 두껍기 때문에 천천히 자릅니다.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Store 분주 -20 oC. 동결/해동을 피하십시오.
Anti-IRF-3-P-Ser396Home made19Store는 -80 oC로 나눠 받았습니다. 동결/해동을 피하십시오.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Cell Signaling Technology4947s는 -20 oC에 저장합니다.
Anti-IRF-3-P-Ser398Home made15Store는 -80 oC로 나눠 받았습니다. 동결/해동을 피하십시오.
Anti-IRF-3-full lengthActif motif39033Store aliquoted at -80 oC. 동결/해동을 피하십시오.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781저장소 -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini CCD 카메라 장치GE 헬스케어
SDS-PAGE 분자량 표준, 광범위한Bio-Rad161-0317-20 oC.
) 염

참고문헌

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