여기에서는 IRF3 전사 인자의 인산화 의존적 활성화에 대한 자세한 분석을 허용하는 절차를 설명합니다. 이는 여러 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다.
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방법 논문
고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면
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이 논문에서
요약
초록
IRF3 전사 인자는 주로 인터페론 β 및 항바이러스 유전자 발현을 통해 병원체에 대한 1차 방어선에 중요합니다. IRF3 활성화에 대한 자세한 분석은 병원체가 선천적 항바이러스 반응을 유도하거나 회피하는 방법을 이해하는 데 필수적입니다. IRF3의 뚜렷한 활성화 형태는 인산화 및 단량체 대 이량체 상태에 따라 구별할 수 있습니다. IRF3의 서로 다른 활성화 종 간의 생체 내 구별은 SDS-PAGE의 이동성 이동을 기반으로 IRF3 인산화 형태의 분리를 통해 달성될 수 있습니다. 또한 IRF3 단량체 및 이량체의 수준은 비변성 전기영동을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 여기에서는 IRF3 활성화 상태에 대한 가장 많은 정보를 얻기 위해 최고 해상도에 도달하는 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이는 여러 개의 총 및 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다. 이 실험 전략은 IRF3의 인산화 매개 활성화에 대한 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기 위한 저렴하고 민감한 접근 방식을 구성합니다.
서론
재하와 구조적으로 표현 전사 인자 인터페론 (IFN) 규제 요인 3 (IRF3)는 주로 IFNβ의 유도를 통해 병원균에 대한 방어의 첫 번째 줄에 중요뿐만 아니라, 케모카인 (CC 모티브)의 유도 리간드 (5) (CCL5 통해 ) 및 tetratricopeptide와 인터페론 유도 단백질 등 여러 가지 바이러스 단백질은 IFIT1 / 2 / 3월 1일부터 3일까지 반복합니다. 또는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 4 : IRF3 활성화 polyinosinic - polycytidylic 산 (C 폴리 I)에 다음과 같은 다수의 바이러스 감염 또는 노출을보고되었다. 중요한 것은, 대부분의 연구 바이러스는 IRF3 매개 응답을 회피하고, 이에 호스트 선천성 면역 방어 5 탈출 메커니즘을 진화했다. 따라서 IRF3 활성화를 모니터링하는 것은 선천성 바이러스 숙주 방어의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 또한 본 반응을 방해하는 바이러스에 의해 사용되는 전략을 식별하는 데 매우 중요하다.
ENT "> 많은 출판 리포트 그러나 저해상도 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 IRF3 표적 유전자 도입의 모니터링 (IFNB1 및 IFIT1)에 의해 수행 IRF3 활성....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
주 : 프로토콜 센다이 바이러스 (SEV) 감염 A549 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 그러나, SDS-PAGE 및 기본 페이지에 대한 프로토콜은 지금까지 테스트 한 모든 인간과 쥐의 세포 유형, 다양한 IRF3-활성화 자극 9,15,19,24,25 자극 특히 골수 세포와 함께 작동합니다.
A549 세포의 감염 1.
- 37 ° C / 5 % CO 2 (20)에 15cm 플레이트에서 배양 A549 세포를 유지 ml의 10 %를 열 불 활성화 소 태아 혈청 (HI-FBS), 1 % L- 글루타민을 함유하는 F12K / 햄 배지 (완전 F12K / 햄 매체).
참고 : 세포 배양 및 치료에 사용되는 모든 솔루션은 멸균해야합니다. - 감염 전에 24 시간에서 매체를 기음과 증류수 인산염 완충 생리 식염수 실온에서 (D-PBS) 10 mL로 세포를 씻어.
- 세포를 커버하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하기 위해 각 플레이트에 0.25 % 트립신 EDTA 용액 1ml를 추가합니다.
- 빨리 번째로 부화 중지전자 세포는 부드럽게 한 손으로 판을 눌러 판에서 분리하기 시작. 접시 당 예열 완전한 F12K / 햄 10 ml의 배지를 첨가함....
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결과
그림 2는 고해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE의 해상도 후 Ser396 및 Ser398에 대한 IRF3 총 항체 및 IRF3 - 포스 포 - 항체 검출 IRF3의 전형적인 면역 이미지를 보여줍니다. 자극되지 않은 A549 세포에서, IRF3은 50 개의 대역과 비 - 인산화 (형태 I)에 대응하는 SDS-PAGE의 53 kDa 이상, 인산화 결정 (II)의 IRF3 종으로서 검출된다. 시간에 따른 변화에 9 시간 결과 천천히 나는를 양식에서 잘 구별하고 II hyperphosphorylated 형태 III 및 IV를 마이그레이션하기 - A549 세포의 노출은 3가 SEV합니다. hyperphosphorylated 밴드 kDa의 55-57에 이동한다. 형태 III과 IV는 특히 Ser396과 Ser398에 대한 포스 포 항체를 사용하여 immunodetected 있습니다. 굴지의 면역은 차선 사이에 동일한 부하의 제어 역할을합니다. SE.......
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토론
우리는 여기 설명 프로토콜 IRF3의 이합체 / 단량체 및 phosphoforms I-IV를 구별하기 위해 여러 포스 포 항체의 용도에 결합 고해상도 SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE의 조합으로 이루어져있다. 이 IRF3 종의 적절한 검출은 완전히 특정 설정에 IRF3 활성화를 특성화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 활성화 된 대 식세포의 LPS의 자극, 인산화 (II 형)를 전시 이량 체, Ser396 / 398 인산화 IRF3의 형성을 유도하지만, SDS-PAGE 15 (형식 III 및 IV), 패턴을 hyperphosphorylated 없습니다. 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 프로파일은 Ser386 및 Ser396의 인산화 (10)에 더하여 추가 Ser339의 인산화를 필요로 바이러스 - 유도 hyperphosphorylated 형태로부터 구별 될 수있다. 중요한 것은,이 또한 이량을 나타내지 만, 전사적으로 10 활성하지 Ser396 인산화 종을 구별.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 프로토콜 개발에 대해 실험실의 이전 및 현재 구성원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(CIHR)[보조금 # MOP-130527]와 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회[NSERC-355306-2012]의 자금 지원을 받았습니다. NG는 Tier II 캐나다 연구 의장을 수상했습니다. AR은 Fonds de la recherche du Québec-Santé(FRQS)의 Respiratory Health Research Network의 교육 프로그램에서 학생으로 선정되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | 37°C에서 웜; 사용 전 C 목욕. |
| 소 태아 혈청 | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-글루타민 | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | 세포 배양용. |
| 트립신/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| 센다이 바이러스 Cantell 균주 | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| 염화나트륨(NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| 글리세롤 | Bioshop | GLY001.1 | 팁과 피펫의 끝부분을 매우 두껍기 때문에 천천히 자릅니다. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | 등록 상표는 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) 세제 |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 에 해당합니다. | |
| 불화나트륨 | 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich | 201154 | |
| 오르토바나데이트나트륨(Sodium orthovanadate | ) MP Biomedicals | 159664 | 오르토바나데이트나트륨(sodium orthovanadate)의 활성화 0.2 M : 1) 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH를 10.0으로 조정합니다. 오르토바나데이트 나트륨 용액의 시작 pH는 많은 화학 물질에 따라 달라질 수 있습니다. 2) 용액은 pH 10.0에서 황색입니다. 3) 무색이 될 때까지 끓인다. 4) RT로 식힙니다. 5) pH를 10.0으로 다시 조정하고 용액이 무색으로 유지되고 10.0에서 안정화될 때까지 3-4단계를 반복합니다. 활성화된 오르토바나데이트 나트륨 부분 표본을 -20 °C에서 보관합니다. |
| p-니트로페닐 포스페이트 디소듐 염 헥사하이드레이트 | 시그마-알드리치 | P1585 | |
| 베타-글리세로인산 | 시그마-알드리치 | G6376 | |
| Bio-Rad 단백질 분석 시약 | 바이오 라드 | 500-0006 | 세포 독성 |
| 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | 세포 독성 |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| 염산 (HCl) | LabChem | LC15320-4 | 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 독성이 있고 자극적입니다. |
| 소듐 도데실 설페이트 (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | 자극. |
| 과황산 아모늄 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | 독성 및 자극성. |
| 브로모페놀 블루 | Fisher Scientific | B392-5 | |
| 베타-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M6250 | 흄 후드 아래에서 작동합니다. 신경계, 점막에 독성이 있습니다. 상부 호흡기, 눈, 중추 신경계에 독성이 있을 수 있습니다. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| 소듐 하이드록사이드 (NaOH) | Bioshop | SHY700 | 자극. |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인(0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 아세트산 빙하 | Bioshop | ACE222.4 | 흄 후드 아래에서 작업합니다. 독성, 자극성 및 가연성. |
| 레드 폰소 | 시그마-알드리치 | P3504 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | 면역블롯을 위한 PBS 조성물. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | 면역블롯용 PBS 조성용. |
| KH2PO4 | 시그마-알드리치 | P0662 | 면역블롯을 위한 PBS 조성물. |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906 | 면역블롯을 위한 PBS-T-BSA 조성. |
| 무지방 분유 | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | 팁과 피펫의 끝부분을 매우 두껍기 때문에 천천히 자릅니다. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store 분주 -20 oC. 동결/해동을 피하십시오. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store는 -80 oC로 나눠 받았습니다. 동결/해동을 피하십시오. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | 는 -20 oC에 저장합니다. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store는 -80 oC로 나눠 받았습니다. 동결/해동을 피하십시오. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. 동결/해동을 피하십시오. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | 저장소 -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD 카메라 장치 | GE 헬스케어 | ||
| SDS-PAGE 분자량 표준, 광범위한 | Bio-Rad | 161-0317 | -20 oC. |
참고문헌
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
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재인쇄 및 허가
