여기에서는 깨어 있고 행동하는 원숭이의 단세포 기록 중 신경 약리학 물질의 압력 주입을 보여줍니다. 이 절차는 피질 기록 부위 바로 근처에서 약리학적 조작을 가능하게 합니다.
이 논문에서
요약
초록
피드포워드 피질 정보 처리의 하향식 조절은 주의에 의한 감각 정보 처리의 조절을 포함하여 많은 인지 과정에 기능적으로 중요합니다. 그러나 어떤 신경전달물질 체계가 이러한 조절에 관여하는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 질문을 해결하는 실용적인 방법은 적절한 동물 모델에서 단세포 기록과 국소 및 임시 신경약리학적 조작을 결합하는 것입니다. 여기에서는 급성 단세포 기록과 기록 전극 바로 근처에 신경 약리학적 제제를 주입하는 기술을 보여줍니다. 이 비디오는 주입할 물질의 준비를 포함하여 압력 주입/기록 시스템의 준비를 보여줍니다. 우리는 붉은털원숭이가 시각적 주의 작업을 수행하는 것과 블록별 약리학적 조작을 사용한 단일 단위 기록 절차를 보여줍니다.
서론
피질 및 피질하 영역에서 신경 활동은 다양한 신경 조절제, 예를 들어 아세틸콜린1의 영향을 받습니다. 뉴런 반응에 대한 이러한 조절 효과는 시험관 내 연구(in vitro studies)2, 마취된 동물의 전기생리학적 기록3 및 인간을 대상으로 한 전신 약리학적 조작(systemic pharmacological manipulation)4에서 보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, 다양한 신경조절인자의 정확한 역할과 다양한 수용체 아형의 관여는 대체로 알려져 있지 않습니다. 단일 뉴런의 활성에 대한 특정 신경조절물질의 효과를 측정하기 위해서는, 기록전극에 가능한 한 가깝게 일시적인 신경조절물질의 변화를 유도하는 것이 바람직하다. 더욱이, 이러한 조작은 깨어 있는 동물에서 이루어지는 것이 중요한데, 인지 기능은 마취가 없는 상태에서만 존재하기 때문입니다. 또한 마취는 콜린계 및 GABAergic 시스템과 상호 작용하며5,6 신경 활동의 변화를 유발할 수 있습니다3.
지난 수십 년 동안 국소 약물 전달의 두 가지 주요 방법, 즉 이온 영동과 압력 주입이 개발되고 개선되었습니다. 두 방법 모두 약물은 유리 또는 강철로 만들어진 마이크로피펫을 통해 전달됩니다. 이온 영동으로, 전류는 약물의 방출을 조절합니다7. 또한, 분출된 분자8의 총량에 대한 전기삼투압의 상당한 기여가있으며, 이는 마이크로피펫의 팁 직경9 및 사용된 물질의 농도8와 상관관계가 있습니다. Iontophoresis는 소량의 신경 조직을 빠르고 정확하게 조작할 수 있는 강력한 도구입니다. 이온 영동 주사의 경우, 다중 배럴 마이크로 피펫은 일반적으로10 개가 사용되며, 하나는 기록 장치 역할을하고 다른 위치는 전달 피펫 역할을합니다. 이 방법의 한계는 하전된 분자만 사용할 수 있어 약물 선택이 심각하게 제한된다는 것입니다.
압력 주입은 공기 압축 또는 기계적 압력을 사용하여 마이크로 피펫에서 물질을 배출합니다. 이 방법을 사용하면 큰 분자를 포함하여 전하를 띠거나 전하를 띠지 않은 모든 용해성 물질을 사용할 수 있습니다. 압력 주입 방법은 1933 년 Reyniers에 의해 처음 설명되었으며 1950 년대에 더욱 개선되었습니다 (검토는 Lalley11 참조). 1980년대에는 이 방법을 더욱 개선하여 나노리터 범위(주로 리도카인12)의 양을 정의된 뇌 영역(13)에 전달하는 동시에 단일 세포 기록을 수행할 수 있습니다. 분출된 부피는 일반적으로 피펫(13)의 상부에 있는 반월판과 같은 마커의 움직임을 관찰함으로써 모니터링되었다. 압력 주입은 1990년대에 깨어 있는 동물에서 처음 사용되었으며, 세포 외에서는14, 세포 내에서는15,16입니다. 이러한 연구에서 얻은 누적된 전문 지식을 바탕으로 이제 약리학적 조작과 함께 다양한 뇌 구조를 안정적으로 기록할 수 있습니다(최근의 압력 주입 시스템 비교는17 참조).
두 약물 전달 방법 모두에 대한 지속적인 미해결 문제는 정확한 주입량을 결정하기 어렵다는 것입니다. 이것은 깨어 있고 행동하는 붉은털원숭이를 대상으로 하는 실험에서 훨씬 더 큰 도전이며, 동물은 별도의 방에서 실험 과제를 수행합니다. 이는 주입을 지속적으로 모니터링하기 위해 시각적 마커에 의존하는 대신 소프트웨어 제어 시스템을 사용하여 완화할 수 있습니다.
여기에 설명된 시스템은 잘 정립된 전기생리학적 기록 시스템(Mini Matrix System)의 확장으로, 사용자 정의 가능한 배열로 정의된 거리에서 주입 피펫과 여러 병렬 방향 기록 전극을 결합합니다. 기록 전극 근처의 조직에 대한 약리학적 조작은 소량의 물질만을 사용하여 가능하므로 빠른 회복을 보장하고 동물의 행동 작업이 제공하는 제한된 시간 창 내에서 여러 블록의 주입 및 제어/회복이 가능합니다.
프로토콜
동물 관리 및 모든 실험 절차는 독일어 법률에 적용 동물 보호에 따라 실시하고 브라운 슈 바이크, 니더 작센, 독일의 지방 정부에 의해 승인되었다.
참고 실험은 생체 내에서 수행 될 때, 가장 높은 위생 기준을 유지하는 것이 중요하다. 가능하면 멸균 조건에서 작동합니다.
1. 사출 / 촬영 시스템 준비
- 주사기와 마이크로 피펫 연결 관 소독. 분사 펌프 및 전기 생리 녹화 시스템의 실험 장치에 관 수의 짧은 길이를 사용합니다.
- 세정 와이어를 사용하여, 기록 시스템의 안내 관을 청소한다. 여러 번 살균 실리콘 오일을 찍어 개별 안내 관을 통해 공급.
- 기록 시스템의 하나의 가이드 튜브 내로 석영 유리 마이크로 피펫을 삽입한다. 도 1a를 참조하십시오.
- 에 마이크로 피펫을 고정 후기록 시스템은, 마이크로 피펫의 금속 핀 멸균 튜브를 부착. 주의; 마이크로 피펫이 시스템에서 고정되어 있지만, 튜브를 부착 할 때 쉽게 분해 할 수있다. 핀과 튜브에 동일한 압력을 적용하기 위해 두 멸균 핀셋을 사용합니다.
- 튜브와 마이크로 피펫 사이의 접합부를 밀봉 액체 슈퍼 접착제를 사용합니다. 접착제가 액체로 마이크로 피펫을 채우기 전에 경화 적어도 3 시간을 기다립니다.
- 전 또는 마이크로 피펫 삽입 후 기록 시스템의 다른 위치로 미소 전극 (예를 들면, 석영 유리 절연 텅스텐, 백금)를 삽입한다.
2. 물질 준비
- 오토 클레이브 또는 다른 신뢰할 수있는 절차를 사용하여 주입 용액의 저장 후에 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 소독.
- 0.1 몰 용액 5 ㎖를 제조 해당 물질 스코 폴라 민 하이드로 클로라이드를 단다. 멸균 식염수 (0.9 % NaCl을)에 용해.
- 멸균 조건의 난에서NA는 충분히 큰 공경 주사기 필터를 사용하여 용액, 예를 들면, 0.2 ㎛의 필터, 흄 후드.
- 흄 후드에서, 스코 폴라 민을 위해, 예를 들어 하나의 실험에 대한 충분한 볼륨에 솔루션 나누어지는 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 500 μL. 빛으로부터 물질을 보호하기 위해 어두운 튜브를 사용하여; 대안 적으로, 알루미늄 박에 튜브를 감싸는. 스코 폴라 민 들어, 4 ° C에서 최대 14 일 동안 솔루션을 저장합니다.
사출 / 촬영 시스템 3. 매일 준비
주 : 기록 시스템에 장착 할 때, 전극은 마이크로 피펫 레코딩 간의 효소 용액 (Tergazyme, 탈 이온수로 1 % 용액)에 저장된다. 다음 단계는 모든 녹음하기 전에 수행해야합니다.
- 물질의 튜브를 수집하는 주입한다. 냉장 경우는 RT에 도달 할 수 있습니다.
- 효소를 용액으로부터 주입 / 기록 시스템을 제거하고 전극 린스탈 이온수로 마이크로 피펫 효소 용액을 완전히 세척한다.
- 시각적으로 마이크로 피펫 및 튜브 사이의 밀봉을 확인하기 위해 기록 시스템의 전면 커버를 제거합니다.
- 원활한 이동을 위해 시스템을 윤활하기 위해 안내 튜브 갭 (도 1a 참조) 및 전극과 마이크로 피펫의 선단을 무균 실리콘 오일을 적용한다.
- 그들은 그대로 보장하기 위해 현미경을 사용하여 전극과 마이크로 피펫의 팁을 확인하십시오. 동일한 길이의 안내 관 밖으로 연장되도록 현미경 전극 및 마이크로 피펫 정렬. 즉시 더 이상 볼 수 있습니다로 중지, 가이드 튜브로 드라이브. 이것은 전극 위치 0으로 정의된다. 소프트웨어에서 0으로 전극의 깊이와 마이크로 피펫을 설정합니다.
- 멸균 생리 식염수와 멸균 주사기를 입력하고 튜브의 벽을 관통하지 않도록주의하면서 튜브에 바늘을 삽입합니다. VISU에 대한 가이드 튜브에서 마이크로 피펫 드라이브물질 흐름의 알 제어 할 수 있습니다.
- 공기 없도록하는 튜브와 마이크로 피펫을 통해 세척 적어도 2 ml의 멸균 생리 식염수는 주사기 나 튜브에 남아 있습니다. 주사기의 플런저에 너무 많은 압력을 가하지 마십시오. 튜브와 마이크로 피펫 사이의 연결을 확인하는 밀봉된다. 누설이 보이면 접합부 (단계 1.5 참조) 재 및 접착제 기록 연기.
- 솔루션 새로운 멸균 주사기 주입 할 채우고 식염수 주사기 배럴로 교환, 즉, 튜브 식염수 채워진 주사기의 바늘을 유지. 공기가 시스템에 전송되지되어 있는지 확인합니다. 이것은, 식염수로 채워진 배럴을 제거한 후 생리 식염수로 바늘 허브를 충전함으로써 달성된다.
- 용액을 250 ㎕의 완전 튜브로부터 염분을 제거하기 위해 주입하는 시스템으로 플러시.
- 모터 제어 소프트웨어를 사용 guidetubesto에 적어도 -500 ㎛의 깊이를 마이크로 피펫 전극 후퇴. 그들의 상대 위치를 고정 유지하는 가이드 튜브의 하단에 가이드 튜브 링 (도 1a)을 내린다.
- 이 원숭이의 기록 챔버를 터치합니다 특히 에탄올로 시스템의 기반을 청소합니다.
- 전면 커버를 교체하고 나사를 조여 기록 시스템을 닫습니다.
분사 시스템 4. 유효성
주 : 기업 시스템을 보정하지만,이 (튜브, 주사기 등) 실험 장치에 사용되는 재료 토출 양을 검증 할 것을 권장한다.
- 안내 관 밖으로 연장 전극 및 마이크로 피펫을 유지, 3 단계에서 설명 된 바와 같이 시스템을 준비한다. 적어도 7,000 ㎛의 깊이로 인해 마이크로 피펫 전극의 외면을 따라 접착력 측정 량의 감소를 피해야한다.
- 이 실험시에 사용되는 위치에 기록 시스템을 배치하고 syrin 넣어마이크로 인젝션 펌프에 GE. 고무 밴드와 조정 손잡이를 사용하여 제자리에 주사기를 고정 (도 1a 참조). 이 주사기의 플런저 뒤에 자리에 단단히 때까지 펌프의 가동 부분을 밀어 넣습니다.
- 소프트웨어 제어형 모터 유닛을 사용하여 정확하게 측정 할 수있을만큼 큰 볼륨을 추출 등., 1000 NL. 마이크로 피펫 표면을 따라 모세관 작용의 영향을 피하기 위해 전체 볼륨을 추출하는 하나의 공정을 사용하는 것이 바람직하다. 매우 낮은 속도 (1 NL / S)도 검증 절차를 수행하는 동안이 효과로 이어질 수 있습니다.
- 마이크로 피펫 아래에 배치 용기의 총 부피를 수집하거나 조심스럽게 마이크로 피펫의 끝에서 직접 배출 감소를 수집합니다. 피펫을 사용하여 배출 양을 추정 또는 정밀 규모와 무게에 의해.
- 절차를 측정을 확인하는 여러 번 반복합니다.
5. 급성 녹음
- XY 위치를 설정기록 시스템. 이 가이드 튜브가 만성 이식 기록 챔버 내의 뇌경막에 도달하는 지점을 정의합니다. 가이드 튜브가 완전히 (가이드 튜브 Z 위치 0) 수축되어 있는지 확인합니다.
- 위치로 기록 시스템을 가져오고 미세 주입 펌프에 주사기를 놓습니다. 고무 밴드와 조정 손잡이를 사용하여 제자리에 주사기를 고정 (도 1a 참조). 이 주사기의 플런저 뒤에 자리에 단단히 때까지 펌프의 가동 부분을 밀어 넣습니다. 물질의 강하가 가이드 튜브의 끝에서 볼 경우, 신중하게 멸균 면봉을 사용하여 제거합니다.
- 실험실의 절차에 따라 (예를 들어, 가이드 라인 18 참조) 기록에 대한 동물을 준비합니다.
- 안전하게 원숭이의 기록 챔버에 기록 시스템을 마운트합니다.
- 천천히 수동 경질에 도달 할 때까지 기록 챔버로 안내 관을 저하하고, 모터를 사용하여 공동 전극을 구동ntrol 소프트웨어.
- 그것은, 마이크로 피펫의 임피던스를 측정 할 수 없기 때문에 제 1 전극과 구동과 다른 깊이에서 정기적으로 임피던스를 확인합니다. 경질의 침투가 성공적 전극을 손상시키지 않고 수행 된 후, 마이크로 피펫을 전진.
- 전극 관심 뇌 영역이 발견 될 것으로 예상되는 타깃 전극 깊이까지 마이크로 피펫을 구동한다. 기록 신호 양호한 신호 대 잡음비에 의해 입증은 단일 유닛의 활동을 기록하기에 충분 부근까지 천천히 전진 전극. 중요한 것은, 전극과 마이크로 피펫 간의 최소 거리를 보장하는 동일한 깊이의 기록 전극과의 위치를 마이크로 피펫.
- 가능하면 전체 기록이 깊이 전극과 마이크로 피펫을 유지합니다. 기록 셀의 신호 품질을 유지하기위한 유일한 방법은 전극을 이동시키는 경우, 그 전극 및 마이크로 피펫을 이용시동시에 이들 사이의 거리를 유지한다.
6. 공간주의 작업
- 화면 시험 시리즈 본 움직이는 두 도트 패턴에있어서, 하나 함께 동물마다 재판 (19)에 걸쳐 foveate하는 중앙되게 고정 점과, 기록 뉴런과 다른 외부의 수용 필드 내에 위치, 20.
참고 : 원숭이가 큐 도트 패턴의 방향 변화에 대응하는 훈련 (대상 이벤트) 다른 도트 패턴으로 어떤 방향으로 변화를 무시하고 재판 (19)의 모든 성공적으로 완료 액체 한 방울로 보상을하는 동안, 20. 지각 제어 조건으로서, 원숭이 모두 이동 도트 패턴 (태스크에 대한 자세한 설명은도 2 참조)를 무시하면서 정착 점의 휘도 변화를보고한다.
7. 약리 조작 녹음하는 동안
참고 : 원숭이가 작업을 수행하는 동안, 블록 현명한 방식으로 물질을 주입. 세 개의 연속적인 블록이 정의되어 기준 역할을 제어; 물질이 토출되는 동안 주입; 및 복구는이 기간 동안 세포는베이스 라인에 주입 반환의 대상.
- 분사 블록 중에 정기적으로 물질의 양을 미리 주입 등., 2 NL 2 NL / s의 속도로 분당. 예를 들어, 스코 폴라 민 하이드로 클로라이드를 사용한다. 주입 프로세스는 다양한 옵션을 제공하는 소프트웨어를 이용하여 제어된다. 예를 들어, 주입 볼륨을 정의하고, 기록 소프트웨어 클럭에 따른 분사 버튼 매분 누르면 스텝 함수를 사용한다.
사출 블록의 정확한 기간은 물질이며, 의존 실험 예를 들어, 스코 폴라 민 사용을 위해 2 NL 주사 각 분 10 분 (총 20 NL)에 대한 참고 :.. 이는 전극 및 마이크로 피펫 두리 발전을하지 않는 것이 바람직하다사출 블록을 ng를. - 시간과 물질이 주입되는 동안 시험, 전극 및 마이크로 피펫의 깊이뿐만 아니라 배출 물질의 양을 참고.
- 어떤 물질이 주입되지 않는 복구 블록으로 주입 블록을 따릅니다. 복원 블록의 지속 기간은 특정 물질 및 사전 테스트에 정의 될 필요가있다. 모니터 및 복원 블록의 끝까지 선택된 단일 단위의 기록 품질을 유지한다.
- 한 원숭이의 기록 품질과 동기가 허용하는 한 세 개의 블록을 반복합니다.
8. 포스트 녹화 절차
- 데이터의 기록 후, 상기 가이드 튜브에 전극 및 마이크로 피펫을 철회하고 직접 안내 관 후퇴. 원숭이의 기록 챔버로부터 기록 시스템을 제거한다. 분사 펌프에서 주사기를 해제하고 청소 준비 영역 전송 시스템.
- 동물을 처리(기록 챔버 (18)의 청소를 포함)의 표준 실험실 절차에 따라 상기 하우징 설비에 반환.
- 탈 이온수 후 과산화수소 (3 %)과 함께 상기 가이드 튜브의 외부를 씻어. 가이드 튜브 밖으로 드라이브 전극과 마이크로 피펫은, 과산화수소 다음 탈 물로 씻어.
- 튜브에 바늘을 유지, 멸균 생리 식염수로 채워진 주사기의 배럴 주사기의 배럴을 교환한다. 튜브 및 식염수 1-2 mL를 마이크로 피펫을 플래시합니다. 세척 한 후, 배럴을 제거하고 공기를 채운다. 바늘에 배럴을 다시 삽입 튜브 부드럽게 통해 공기를 밀어 내에서 마이크로 피펫을 건조.
- 건조를 방지 할뿐만 아니라 유기 재료의 분해를 확인하기 위해 효소 용액에 침지 안내 관 확장 전극 및 마이크로 피펫을 저장한다.
결과
도 2는 사출 공정을 진행하면서 원숭이 수행 공간의 주목 태스크를 나타낸다. 원숭이는 (참석-)에 기록 된 신경 세포의 수용 필드에 위치한 중 자극에 수용 필드의 외부에있는 자극에 참석하기 위해 훈련 된 또는 고정 점 (아웃 참석) (참석-수정). 이러한 조건은 다른 주의력 상태에서 신경 활성의 비교를 할 수 있습니다.
도 3은 스코 폴라 민, 무스 카린 콜린성 길항제를 사용한 실험 샘플 뉴런 조갑 자극 시간 히스토그램을 나타낸다. 줄거리는 세포의 기본 방향으로 이동 패턴이 신경 세포의 수용 필드 내에서 제시하고 동물들이 참석 아니 주사, 대 스코 폴라 민 주입하는 동안 반응 억제를 보여줍니다. 이 첫 번째 피크는 신경 세포를 나타냅니다9;의 온에 대한 응답과 수용 필드 내부에 표시되는 공간 큐,의 오프셋 (offset)입니다. 이것은 500 밀리 큐 발병 후 화면에 표시되는 이동 패턴에 대응 따른다. 회색 음영 영역은 모든 시험의 평균 연소 속도를 계산하는 데 사용되는 분석 시간을 나타낸다. 녹색 영역은 셀의 연소율에 스코 폴라 민 주입 억제 영향을 강조한다. 진한 녹색 영역은 분석 기간 내 억제를 나타낸다.
도 4a는 세 주의력 각 조건에서 샘플 뉴런의 평균 연소율에 스코 폴라 민의 효과를 나타낸다. 뉴런의 소성 개의 공간의 주목 조건 속도 (기록 뉴런 수용 필드의 내부 또는 외부주의)뿐만 아니라 대 (고정 점에주의) 감각 조건 분사 블록의 첫 번째 주입 (회색 음영 직후 삭제 아르a) 및 주입 전과 동일한 수준으로 증가 지연 후에 복원 블록 중에.
도 4b는 생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨)에 스코 폴라 민 주입과 동일한 프로토콜을 사용하여, 주입되는 제 2 샘플 뉴런에서 기록 제어를 나타낸다. 주입 동안의 뉴런 발사 속도의 변화가 제어 블록에 비해 관찰되지 않았다 블록.
기록하는 동안 약리 조작에 사용도 1 셋업. (A)는 미세 주입 펌프 및 마이크로 피펫 전극과 장착 전기 생리 학적 기록 시스템을 도시한다. 실리콘 오일이 전극과 마이크로 피펫을 윤활 삽입되는 guidetube 격차는 확대 표시됩니다. (B)는 (상기)의 예를 표시 마이크로 피펫기록 전극 (아래). 크기 비교를 위해, 유로 센트 (직경 16mm)가. 아래에 배치 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 작업 디자인 공간주의를 안내한다. 원숭이 큐 도트 패턴의 운동 방향의 변화를 검출하도록 훈련시켰다. 큐가 하나의 뉴런 수용 필드 내에 배치 된 도면에 도시 된 바와 같이, (- 출석), 또는 외부 (참석 아웃). 감각 제어로, 원숭이는 고정 점의 휘도 변화를 감지하는 훈련을했다 (참석-수정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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속도를 발사에 대한 길항제 스코 폴라 민 그림 3. 영향. 샘플 신경 세포의 요정 - 자극 시간 히스토그램은 분사 블록 중 및 제어 블록 동안 참석-의 조건 (기록 된 신경 세포의 수용 필드 내주의)에 대해 표시됩니다. x 축은 스파이크 연소율 / 초를 나타낸다 큐 발병 및 Y 축 후의 시간 (밀리 초)을 나타낸다. 회색 영역은 시험 평균 소성 속도를 계산하는 데 사용되는 분석 기간 (자극 발병 후 300-800 MS) 나타낸다. 녹색 음영 영역은 두 가지 조건에서 속도를 발사의 억제를 보여줍니다. 어두운 녹색은 분석 기간 내에 억제를 강조한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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속도를 발사에 스코 폴라 민과 식염수 그림 4. 효과. (A) 길항제 스코 폴라 민 주입입니다. 실험 과정을 통해도 3에서 시료 셀의 시험 평균 소성 속도는 세 주의력 조건 바람직한 자극에 대해 도시된다. x 축은 분 시험 시작 시간을 도시하고, Y 축은 초당 스파이크 유닛의 발사 속도를 나타낸다. 기호 ( 
참석-에서, 
- 참석 수정 
) 아웃에 참석마다 성공적으로 수행 재판에서 분석 기간 내에서 신경 세포의 발사 속도를 나타내며, 수평 라인 (실선 : 참석-에서, 점선 : 참석-수정, 점선 : 참석 아웃) 평균 발사 속도를 표시 세 가지 다른 실험 BLocks (제어, 사출, 복구). 회색 음영 지역은 제 주사로 시작하는 마지막 주사 후 1 분 종료, 사출 블록을 보여줍니다. 주입하는 동안 블록 2시 NL 0.1 몰 스코 폴라 민의 2 NL / s의의 주입 속도로 매 순간을 주입 하였다. (B) 식염수 주입입니다. 대조 실험에 걸쳐 샘플 셀의 소성 속도는 세 주의력 조건 바람직한 자극에 대해 도시된다. 회색 음영 지역은 식염수 주입 블록을 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
여기서 우리는 "기성품"압입 시스템을 안정적이고 정확한 주사 고품질 단일 셀 녹화를 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 약물 전달이 방법은 이전에 (17 평가) 원숭이 행동에 이용되었지만, 여기에 제시된 시스템 아래 검토 장점을 갖는다.
도 4a에 도시 된 바와 같이, 여기에 설명 된 시스템과, 기록 위치의 바로 근방의 약물 주입없이 단일 신경 세포 활성의 측정을 안정적으로 제공 할 수있다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조 물질, 생리 식염수의 주입은, 소성 속도의 변화로 이어질 않았다. 이 컨트롤은 사출 공정 자체가 기록 된 뉴런의 소성 측정 가능한 특성에 영향이 없음을 보여준다.
뉴런 기록 전극과, 마이크로 피펫의 공간적 구성은 매우 중요하다 이 실험의 중요성. 촬영하는 동안 조직에서의 상대적 위치의 정확한 측정이 불가능하지만, 우리는 고려하고 분산 가능한 소스 제어 할 수 있습니다. 첫째, 주입 부피 중에 관심 뉴런 기록 신호의 안정성에 영향을 미치는, 기록 전극으로부터 멀리 변위 될 우려가있다. 그 이유는 이전에 신호의 안정성을 확인하기 위해 분사 블록 후 소성 속도를 비교 신중하다. 둘째, 기록 시스템의 가이드 튜브 구성은 마이크로 피펫 전극 사이의 거리를 정의 (예.,이 실험에 사용 된 동심의 3 채널 시스템에서 305 μm의). 시스템 조직의 전극과 마이크로 피펫의 깊이에 대한 정밀한 위치 제어를 제공하기 때문에, 이들 사이의 거리가 신중하게 (단계 3.5에게) 기록하기 전에 상대 깊이를 보정하고, 녹화 중에 공통 깊이들을 유지함으로써 최소화 될 수있다.
엔트 "> 잠재적 인 제한제조사 내부 품질 관리에 더하여, 시스템은 튜브의 다른 브랜드로 실험실 조건에서 검증 될 필요가 주사기 등이 사용될 수 있고, 토출 양의 차이가 발생할 수있다. 시스템은 여기에 도시 된 실험에서 매우 소량을 주입하는데 사용될 수 있지만, 이들은 정상적인 실험실 환경에서 실제 측정 한계로 인해 확인 될 수있는 최소한의 양 이하이다. 그러나,보다 큰 주입량은 소프트웨어 정의 된 볼륨 하드웨어 토출 용적의 관계를 추측 할 수있다. 투명한 튜브를 사용하는 경우, 사출 공정의 추가 비주얼 검사 시각적 마커의 변위를 측정 할 수있다.
마이크로 피펫의 직경이 약간 큰 재료와 더 깨지기으로 시스템에 마이크로 피펫을 삽입하면, 전극 삽입보다 더 요구된다. 게다가,이 마이크로 피펫의 상단 부분이 파손될 위험을 수반로서 마이크로 피펫의 핀 튜브를 접합하는 것은 어려운 것이다. 그러나, 성공적으로로드 마이크로 피펫의 수명은 심지어 매일 사용하여, 수개월이다.
실제로, 우리는 아직 시스템의 포스트 레코딩 동안 세정 분사 시스템의 차단을 발생하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 어떤 "온라인"검사가 불가능하고, (예컨대, 마이크로 피펫 팁의 조직과 같은) 물리적 방해물이 물질을 주입하지 못할 수있는 위험이있다. 따라서 이러한 실험의 제어 및 주입 블록 사이의 요금 발사에 상당한 변화를 보여 추가 분석에서 만 셀을 포함하는 것으로, 보수적으로 데이터를 분석하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
그들의 작은 직경에도 불구하고, 미소 전극과 피펫은 뇌 조직을 대체하고 일부 지방 조직 손상의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 수동 번째의 팁을 위치시킴으로써 최소화 될 수있다다만 경막 위의 전자 안내 관. 전극은 경질 침투 및 intactness는 온라인으로 임피던스를 측정하여 추정된다. 그 후, 마이크로 피펫이 삽입됩니다. 이 방법을 사용할 때, 상기 경질 조직의 규칙적인 제거는 상기 전극 피펫 또는 파손의 위험을 최소화하기 위해 추천된다.
다른 방법에 비해
여기에 사용 된 시스템은 다른 압력 분사 시스템에 비해 분명한 장점을 나타낸다. 하나의 강력한 이점은 가능한 다른 프로브 (17)의 절반 크기 인 마이크로 피펫 (약 100 μm의)의 직경이고, 따라서 신경 조직의 손상을 최소화한다. 이전의 설계와 대조적으로, 현재의 시스템은 공간적으로 기록 전극과 마이크로 피펫을 분리 이용한다. 다른 시스템 전극과 피펫 사이의 작은 거리를 제공하지만, 여기에 설명 된 시스템은 전극과 피펫, 따라서 permi의 독립 깊이 변경을 할 수 있습니다기록 세션 내의 상대 거리를 가변 tting. 분사 시스템이 구축 기록 장치의 연장이기 때문에 중요한 녹화 품질 대한 타협이 이루어질 필요가 없다. 하나의 마이크로 피펫 따라서 하나의 물질이 프로토콜에서 사용되는 반면, 하나의 실험 절차 내에 여러 물질을 주입 할 수있다. 이를 위해 여러 가지 마이크로 피펫 별도의 안내 관에 나사 개별 분사 펌프에 장착 된 주사기에 연결될 수있다. 하나의 컴퓨터 프로그램은 전극 및 마이크로 피펫을 진행하고, 실험 기간 동안 압력 분사를 수행하는데 필요한 마지막으로, 시스템을 제어하는 것은 용이하다.
이온 삼투압에 압입 비교 상대적인 장점과 단점이있다. 예를 들면, 압입, 따라서 신경 변위의 위험을 증가시키는, 이온 삼투압보다 조직에 도입하는 큰 부피를 필요로한다. 현재 프로토COL은 내셔널 리그 범위에서 볼륨을 사용하고, 우리는 거의 기록 세포의 신호 품질에 눈에 띄는 변화를 경험하지. 이 시스템은 또한 행동 조작에 대한 잠재적으로 유용하지만 신경 기록의 안정성에 영향을 미칠 수있는 더 큰 볼륨을 주입 할 수 있습니다. 충전 물질을 사용 할 필요가 없기 때문에 이온 삼투압 이상의 압력 분사의 분명한 이점은 유용한 물질을 더 다양하다. 그러나, pH 값을 체크해야하며, 실험 및 제어 물질을 비교 (예., 식염수).
문제는 신경 활동을 조작하는 등 optogenetics 대신에 새로운 기술의 가압 주입의 전통 방법을 사용하는 이유를 발생할 수있다. 잘 설치류 년에 설립했지만, optogenetics은 아직 확실하게 붉은 털 원숭이 년에 설립되어 있지 않습니다. 특히, 또 특정한 신경 전달 물질에 대한 선택적 세포 유형의 로컬 조작을 허용하지 않는다. 긴 안목으로 보면, 우리는 참조인지 기능의 신경 기초를 해명에 optogentic 조작의 장점과 약리 조작의 장점의 조합에 대한 큰 잠재력.
여기에서는 압력 주입 붉은 털 원숭이 행동 약리학 깨어 뇌 국소 제한 지역을 조작하는 방법을 도시하고있다. 우리는이 방법은 신경 활동의 역학에 neuromodulatory 기여를 조사하기 위해 다른 과학자들에게 영감을 바랍니다.
공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 ST가 "감각 처리의 셀룰러 메커니즘"공동 연구 센터 889 (프로젝트 C04)를 통해 독일 연구 협회의 보조금에 의해 지원되었다. 우리의 기술 지원을, 독일 영장류 센터, 박사 카타리나 Debowski 안나 Magerhans의 줄기 세포 단위에서시나 플러머, 레오노레 Burchardt, 더크 Prüsse, 클라우스 Heisig 기술 및 동물 관련 지원 랄프 Brockhausen 우리의 협력자 감사합니다 여과 공정.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (-)-스코폴라민 하이드로클로라이드 | 시그마-알드리치 | 55-16-3 | 씨 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | 효소 억제제 |
| 과산화수소 | Roth | 탈이온수가 포함된 3% 용액에 사용 | |
| 에탄올 | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| 탈이온수 | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | 주사기 및 바늘 |
| Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 호박 | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass 마이크로 피펫 | 토마스 녹음 | ||
| 녹음 전극 | 토마스 녹음 | 석영 / 백금-텅스텐 섬유 전극; 임피던스 값 1-2 M & 오메가; 및 0.3-0.5 M & 오메가; | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain 성능 플라스틱 | 3702003 | 크기 : 0,25 x 2,05 mm (Wd : 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| 실리콘 오일 | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761----------R | 주사기 필터 |
| 다중 채널 마이크로 분사 시스템 | Thomas Recording | 다채널 마이크로 전극 매니퓰레이터 " 시스템 에크혼" 미세 전극 및 마이크로 피펫과 정밀 다중 채널 마이크로 주입 펌프가 장착되어 | |
| McLab | 맞춤형 | 내부 실험실 소프트웨어를 통해 자극 프레젠테이션을 제어합니다 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
