양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

요약

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

초록

생물학 및 임상 과학에서는 생물학을 밝히고, 경로를 정의하고, 치료를 개선하고, 질병을 이해하고, 바이오마커 발견을 돕기 위해 여러 종류의 생체 분자를 통합하고 상관시키려는 욕구가 증가하고 있습니다. N-linked glycosylation은 단백질에 대한 가장 중요하고 강력한 번역 후 변형 중 하나이며 신호전달, 접착 및 효소 기능과 같은 중요한 세포 기능을 조절합니다. N-글리칸을 정제하고 분석하기 위한 분석 기술은 지난 10년 동안 상대적으로 정적인 상태를 유지해 왔습니다. 정확하고 효과적이지만 일반적으로 상당한 전문 지식과 리소스가 필요합니다. 일부 고처리량 정제 계획이 개발되었지만 아직 널리 채택되지 않았으며 종종 글리코펩타이드의 농축에 의존합니다. Thomas-Oates 등이 개발한 한 가지 유망한 방법인 FANGS(Filter Aided N-Glycan Separation)가 조직에서 정성적으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분석법 및 향상된 전기 분무 이온화에 의한 정확한 상대 정량화를 달성하기 위해 FANGS를 플라즈마에 적용하고 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 개별성 정규화와 결합했습니다. 또한, 암탉 혈장에 대한 탠덤, 샷건 단백질체학 및 당화 부위 분석을 달성하여 프로토콜에 새로운 기능을 설계했습니다. 우리는 필터에서 정제되고 소수성 히드라지드 태그에 의해 유도체화된 N-글리칸이 고체상 추출(SPE)에 의한 것과 풍부도 및 등급 측면에서 유사하다는 것을 보여주었습니다. 후자는 이 분야에서 황금 표준으로 간주됩니다. 중요한 것은 두 프로토콜의 변동성이 통계적으로 다르지 않았다는 것입니다. 글리코믹 데이터와 인라인으로 수집된 단백질체학 데이터는 표준 트립신 다이제스트와 동일한 깊이를 가졌습니다. 프로토콜에서 펩타이드 탈아미드화(Peptide deamidation)가 최소화되어 글리코실화(glycosylation) 모티프에서 검출되는 비특이적 탈아미드화(deamidation)가 제한됩니다. 이를 통해 직접적인 당화(glycosylation) 부위 분석이 가능했지만, 이 프로토콜은 ¹⁸O 부위 라벨링도 수용할 수 있습니다. 전반적으로, 당사는 정량적 당체학 및 단백질체학 분석을 위한 새로운 인라인 고처리량, 비편향, 필터 기반 프로토콜을 시연했습니다.

서론

프로테오믹스 분야에서는, 필터를 이용한 시료 준비 (FASP)가 널리 출발 물질의 양을 최소화하는 샘플 준비 아티팩트를 감소시키고, 시료 처리 ^1을 최대화하는 기능을 채용하고있다. 그러나, 이러한 방법은 아직 나오고 글라 이코믹스의 필드 견인력을 얻을 수있다. 높은 처리량의 개발은 양적 워크 플로우 때문에 필수적인 생물학적 방어 당화의 역할과 암 또는 질병 ^2,3에 의해 그 변조의 필요하다. 포유 동물에서, N의 -glycans은 코어 구조를 장식 당 단위 (탄당 (육각), hexosamines (HexNac), 시알 산 (NeuAc의), 그리고 푸 코스 (FUC)), (육각 ₃ HexNac ₂₎ ⁴ 공유 결합을 반복으로 구성되어 아스파라긴합니다. 이성질체가 반영되면 glycospace 상당히 큰 것이지만 (> 10 ~ ^12)은, 그 조성에 기초하여 매우 작고, 전형적으로는 분자량 1,000-8,000 다 ^{5 <에서부터}/ SUP>. 클래스의 조성 균일 성 및 글리 칸의 친수성 정제 분리에 고유 한 문제를 제기하고, 질량 분석 (MS) ^(6)를 워크 플로우.

전통적으로, N의 -glycans는 F (MALDI 스펙트럼은 PNGase F)는 펩티드 - N으로 단백질 또는 펩티드의 글리코시다 제 분해 된 후 히드라 지드 비드 ^(8)에 의해, 렉틴 친 화성 크로마토 그래피 ^(7)에 의해 농후 포착, 또는 고체 상 추출 (SPE) ^9,10 통해 정제. 이들 방법은 모두 매우 효과적이지만, 이들은 탈염위한 추가 단계가 도입 된 샘플의 수는 동시에 처리 제한한다. 지난 10 년간, 글라 이코믹스에 대한 높은 처리량 플랫폼 다수 제안되어있다. 김 외. 진공 조작, SPE 96 웰 플레이트 ^(11)를 사용하여 반 - 자동화 된 방법을 발표 하였다. 또한, 친 화성 필터 방법 (N의 -glyco-FASP)는 파이의 초기 유도체를 필요로하는 맨 그룹에 의해 개발되었다렉틴 ^(12)의 합성과 LTER. 마지막으로, 토마스 - 오우 츠 그룹은 glycospace ^(13)의 좁은 조성 크기를 악용 반 정량적 방법, N -Glycan 분리 (송곳니)를 돕는 필터를 제안 하였다. 분자량 컷 - 오프 필터에 의존 작은 오염물 제 낭비 세척 한 다음 N의 -glycans는 분해 용출 하였다. 탈글 라이코 실화 된 단백질이 프로토콜에서 필터에 남아 인라인 FASP을 실시 할 수있다.

식별 및 전기 분무 이온화에 의해 글리 칸의 정량화 (ESI) MS는 저 풍부한 종의 검출을위한 이성체 및 유도체의 (부분) 해결을위한 오프라인 분리가 필요합니다. 개성 라벨링 당쇄 히드라 지드 태그 전략 정규화 역상 액체 크로마토 그래피 (역상) ^{(14, 15)과의} 호환성을 부여한다. 4- 펜 에틸 benzohydrazide (P2PGN)은 소수성 태그 ENH, 글리 칸의 친수성을 매개평균적으로 이온화 ancing ¹⁶ 4 배. 용이 한 조건에서 화학량 론적 1 ​​: 메틸화 예 ¹⁷ 아민 반응성 화학 태그 ^(18)과 같은 다른 기술은 유사한 이점을 제공하지만, 히드라 지드의 반응에 글리 칸은 (1) 반응한다. 상대 정량 네이티브 (NAT) 또는 ⁽¹³⁾ C ₍₆₎ 안정된 동위 원소 라벨 (SIL)로 유도 샘플의 직렬 분석에 의해 달성된다.

다음 방법은 정확한 상대 정량 P2GPN 소수성 태그에 플라즈마 응용 프로그램과 커플을위한 송곳니를 진화. 또한,이 분석의 무결성을 손상시키지 않고, 샘플의 단일 나누어지는에 총 총의 프로테오믹스, 탈 아미드 화 프로파일, 양적 글라 이코믹스을 수행하도록 설계되었습니다.

프로토콜

1. 단백질 및 당 단백질 변성 및 알킬화

1. 표준 준비, 부하 30 kDa의 상 당 단백질 (예 : Fetuin 또는의 RNase B)의 0.1 μg의 / μL 솔루션의 2.5 μl를 10 kDa의 분자량 (MW) 차단 필터하십시오.
   1. 생물학적 혈장 샘플의 경우, 브래드 포드 ⁽¹⁹⁾ 표준 또는 bicinchoninic 산 ²⁰ (BCA) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 확인합니다. 필요에 따라 10 ~ 100 ㎎ / ㎖의 총 단백질 사이 함유하는 ~ 7의 pH에서 H 100mm의 중탄산 암모늄 (NH ₄ HCO _{3) 2} O (MALDI 스펙트럼은 PNGase 다이제스트 버퍼)와, 플라즈마를 희석. 필터 상에로드 2.5 ㎕의 플라즈마 (25-250 μg의 단백질).
      주 :이 프로토콜은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 존재하에 수집 혈액 샘플로부터 혈장에서 테스트되었다.
2. 필터의 각 샘플에 1 M 디티 오 트레이 톨 솔루션 (DTT)의 2 μl를 추가합니다.
3. (20) 시료를 희석0 μL 버퍼를 소화 MALDI 스펙트럼은 PNGase.
4. 그 자리에서 필터를 방해하지 않도록주의, 필터 샘플 튜브 가볍게 소용돌이 캡. 30 분 단백질 및 당 단백질을 변성 56 ℃에서 샘플을 인큐베이션.
5. 샘플을 알킬화하기 위해, 50 ㎕의 1 M 요오도 아세트 아미드를 추가 ~ 200 mM의 최종 농도를 수득하고, 60 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
   주 : 단백질 체학 분석이 요구되지 않는 경우, 단계 150은 생략 될 수있다.
6. 40 분 동안 14,000 XG에 샘플을 원심 분리하여 필터 상에 변성 당 단백질을 집중. 을 통해 흐름을 폐기하십시오.

2. N은 ​​글리 칸 효소 소화를 -linked

1. 버퍼를 소화 MALDI 스펙트럼은 PNGase 100 μL로 샘플을 씻으십시오. 20 분 동안 14,000 XG에서 필터의 당 단백질을 집중하고 흐름을 통해 폐기하십시오.
   1. 필터 죽은 볼륨 (~ 5 μL)에 집중 산출, 세 번, 총 두 번 세척 및 농축 단계를 반복합니다. 모든 폐기흐름 -을 통해.
   2. 세척 한 번 취소 수집 병이 완료됩니다. 새 컬렉션 유리 병의 모든 미래 용리액 및 세척를 수집합니다.
      참고 : MALDI 스펙트럼은 PNGase 화학적 탈 아미드가 드 당화 아스파라긴 사이트의 안정 동위 원소 라벨의 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 소화 단계에서 사용될 수있는 H ₂ O ^(18)에 버퍼를 소화.
2. 신선한 컬렉션 유리 병에 전송 한 후 필터링 글리세롤없는 MALDI 스펙트럼은 PNGase F (75,000 X 단위 / ㎖)의 2 μl를 추가합니다. MALDI 스펙트럼은 PNGase의 98 μL 100 μL에 총 볼륨을 가져 오는 버퍼를 소화하고 부드럽게 혼합 아래로 필터 최대 피펫 및 추가합니다. 효소 단계 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR 조건 글리 칸 다이제스트.
   주 : 단백질의 탈 글리코 실화를위한 세 가지 방법이 사용될 수있다. 전적으로 글라 이코믹스 분석 (없음 프로테오믹스)의 경우, 단계 2.2.1에서 긴 배양하는 것이 좋습니다. 글라 이코믹스 및 프로테오믹스 연구의 경우, 2.2.2과 2.2.3은 최소한의 비 SP는 높은 품질의 펩타이드를 생성합니다 단계ecific 탈 아미드 화.
   1. 글라 이코믹스 전용 소화 프로토콜 (18hr)이 : 효소 모든 N -glycans을 절단하기 위해 18 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품어.
   2. 스파이크의 소화 프로토콜 (SPI) : 2 시간 동안 50 ° C에서 샘플을 인큐베이션. 빨리 작업, 글리세롤없는 MALDI 스펙트럼은 PNGase F (75,000 X 단위 / ㎖)의 추가 2 μL에서 샘플 및 스파이크를 제거합니다. 가볍게 1 ~ 2 초 혼합하기위한 샘플을 소용돌이. 추가로 2 시간 동안 50 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
   3. 전자 레인지 소화 프로토콜 (MD) : microcentrifuge 관 부동 랙에 배치 샘플. 1 L 비이커에 플로트 샘플은 탈 이온수 (DI) 물 1 L 가득합니다. 회전 접시와 전자 레인지 (950 W)의 중심에 비커를 놓습니다. 5 분 동안 60 %의 전력 (570 W)에서 전자 레인지. 냉각하기 위하여, 샘플을 제거하고, 2 분 동안 실온에서 유지. 이어서 60 % 전력에서 추가로 5 분 동안 전자 레인지.
      주 : 마이크로파 전력 설정은 마이크로파의 최대 전력 출력에 기초하여 조정해야한다.평균 전력은 모델 간의 일정하게 유지되어야한다.

3. N의 용출이 -glycans

1. 20 ° C에서 20 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 원심 분리하여 용출이 글리 칸.
2. MALDI 스펙트럼은 PNGase 100 ㎕를 20 ℃에서 20 분 동안 14,000 XG에서 필터 및 원심 분리로 버퍼를 추가 다이제스트. 나머지 N 함유 수집 세척 용리액으로서 동일한 수집 병으로 당쇄 -linked. 두 번 반복합니다. 새 컬렉션 유리 병에 필터와 장소를 제거합니다.
3. 냉동 (30 ~ 60 분)까지 -80 ° C 냉장고에 글리 칸 샘플을 품어. 진공 농축기 (4-6 시간) 실온에서 완료에 건조.
   주 : N -glycans 전에 유도체에 최대 6 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

4. 단백질 FASP 소화

주 : 단백질 체학 또는 탈 아미드 화 부위 분석이 요구되지 않는 경우, 프로토콜 부 (4)는 생략 될 수있다.

1. t을 씻어그 8 M 우레아 완충액 400 μL와 탈 아미드를 포함하는 펩티드, 필터. 컬렉션 유리 병 및 혼합하는 가볍게 소용돌이 캡. 15 분 동안 14,000 XG에서 필터에 집중한다. 모든 흐름을 통해 폐기하십시오.
   1. 세 가지 요소 버퍼 세척의 전체 단계를 반복 4.1 두 개의 추가 시간.
2. 2 M 우레아, 10 mM의 _CaCl2를 400 ㎕의 완충액 (완충액 트립신 소화)와 탈 아미드 펩티드를 함유하는 필터를 헹군다. 컬렉션 유리 병 및 혼합하는 가볍게 소용돌이 캡. 15 분 동안 14,000 XG에서 필터에 집중한다. 모든 흐름을 통해 폐기하십시오.
   1. 단계를 반복 4.1 두 개의 추가 시간, 세 트립신 총 버퍼 세척을 소화.
   2. 세척 한 번 취소 수집 병이 완료됩니다. 새 컬렉션 유리 병의 모든 미래 용리액 및 세척를 수집합니다.
3. 5 트립신 :시 50 분 또는 1에서 50 ㎕의 돼지 수정 트립신 추가 단백질 (w / w), 검색 또는 정량 프로테오믹스 실험에 대한 비율이 각각.컬렉션 유리 병 및 혼합하는 가볍게 소용돌이 캡.
4. 2 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. 5 트립신 : 단백질의 비율이 빠르게 작업, 1시 50분 또는 1 트립신의 추가 50 μL의 샘플 및 스파이크를 제거합니다. 가볍게 1 ~ 2 초 혼합하기위한 샘플을 소용돌이. 추가로 2 시간 동안 50 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
5. 15 분 동안 14,000 XG에서 회전하여 펩티드를 용출시켰다.
6. 400 ㎕의 1 % 포름산 0.001 % 쯔 비터 제 3-16 (급냉 버퍼)와 필터에 남아있는 펩티드를 씻어. 15 분 동안 14,000 × g으로 회전에 의해 상기 필터를 용출.
7. 브래드 ¹⁹ BCA 분석 ^(20)에 의해 시료에서 펩티드 농도를 정량화.
8. (30 ~ 60 분) 냉동 때까지 C 냉동고 °에서 -80 펩타이드 샘플을 품어. 진공 농축기 (4-6 시간) 실온에서 완료에 건조.
   주 : 건조 된 펩티드 최대 3 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
9. LIQUI 할 트립신 단백질 직전에 재현 탁D 크로마토 그래피 질량 분석 2 % 아세토 니트릴 (LC-MS) 분석을, 98 %의 H ₂ O, 및 목적하는 농도의 0.1 % 포름산 (이동상 A). 2.5 ㎕의 플라즈마 범위에서 트립신 펩타이드 농도 100-300 NG / μL.

N 5. 유도체 화는 소수성 히드라 지드 태그 글리 칸을 -linked

1. 0.25 mg / ml의 최종 농도를 위해, 아세트산 (유도체 화 용액) 75:25 메탄올 1 ml의 건조 중량 (SIL) 또는 광 (NAT) P2GPN 시약 재구성. 시약 완전히 용해 10 분 소요됩니다. 광범위 소용돌이가 완료 가용화을 보장합니다.
   경우이 유도체 프로토콜은 표준 N의 -glycans, 대 정화 글리 칸, P2GPN의 몰 비율로 사용됩니다 : 참고 글리 칸 정도 (더 이하) 17 이하 여야한다 : 1.
2. 태그 건조 N은 SIL 또는 NAT P2GPN 시약 200 μL (50 μg의)와 -glycans. 건조 글리 칸을 재현 탁 아래로 피펫합니다. 소용돌이 사mples 다음은 벤치 탑 원심 분리기에 ~ 5 초 동안 샘플을 스핀 다운.
3. 56 ° C에서 3 시간 동안 시약과 반응 글리 칸.
4. 즉시 진공 농축기로 인큐베이터에서 글리 칸을 이동합니다. 55 ° C (3-5 시간)에 완료 건조.
   참고 :이 단계는 유도체 화 반응을 소멸; 샘플은 다음 단계에서 교차 반응을 방지하기 위해 완전히 건조해야합니다.
   주 : 건조, 태그 샘플은 최대 6 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
5. 재현 탁 직전 LC-MS 분석에 H ₂ O의 25 ~ 50 μL에서 N의 -glycans 태그. N의 -glycans가 완전히 용해되도록 아래로 피펫합니다.
   주 : 부유위한 볼륨 출발 단백질 농도로부터 추정 될 수있다 당 단백질의 출발 농도에 의존한다. 그러나, 범위는 샘플 유형에 따라 달라집니다 개별적으로 최적화해야한다.
6. 5 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 샘플. supern를 제거atant, 조심 피펫의 끝이 원심 분리기 튜브의 바닥에 접촉하지.
   참고 초과 태그 눈에 보이지 않을 수 있지만, 원심 분리에 의해 감소​​ 될 것이다.
7. 탠덤 분석 : 1 비율 (1)에 상대적인 정량 원한다면 NAT와 SIL 샘플 쌍을 결합한다.

6. 초고압 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석 분석

참고 : 쉬운 NLC-1000 및 Q Exactive 높은 필드에 대한 설명 LC와 MS 조건은 각각 사내 단백질 체학 분석 및 당쇄 분석 ^(21)에 최적화되었다. 이러한 조건은 다른 초고 내압 또는 나노 LC 시스템 및 기타 고 분해능 질량 분석기에 적용 할 수 있지만, 약간의 수정을 요구할 수있다. 고분해능 질량 분광법의 사용은 식별 및 탈 아미드 화 글리 칸 분석 ^22,23 필요하다.

참고 :의 6.1-6.3이 될 수 단계적합한 역상 크로마토 그래피 또는 친수성 ​​상호 상용 트랩 컬럼이 사용되는 경우 kipped.

1. Meiring 등. 트랩으로 사용하기 위해 ^(24)에 따라 100 μM의 ID 모세관에서 프릿을 합성.
2. , 2.6 μM 100 Å, C ₍₁₈₎ 포장 재료, 5 cm의 길이로 절단을 압력 트랩을 포장합니다.
3. 2.6 μM, 100 Å, C ₍₁₈₎ 포장 재료와 압력 하에서 75 μm의 ID 방출 열을 포장 30 cm의 길이로 절단.
4. 프로테오믹스 (6.4.1)와 글라 이코믹스 (6.4.2) 워크 플로우에 대한 두 개의 서로 다른 LC-MS 방법을 준비합니다.
   참고 : 단백질과 글리 칸 샘플은 순서에 상관없이 동일한 트랩 / 열 설정에 실행할 수 있습니다.
   1. 단백질 분석을 위해, 이동상 A (MPA)의 컬럼 상 단백질 ~ 400 ng의 주입. 1 ㎕를 사전에 열 평형 (500 줄) 및 5 ㎕를 분석 열 평형으로, 표 1 항에있어서, 300 NL / 분에서 샘플을 실행(500 줄). 표 2에 제공된 MS 조건 하에서 단백질 이온화.
   2. 글리 칸 분석을 위해 재현 탁의 5 μl를 주입, P2GPN 컬럼에 NAT / SIL 몰 샘플 태그. 2 μL 사전에 열 평형 (500 줄) 및 5 ㎕를 분석 열 평형 (500 줄)로, 표 3 항에있어서, 300 NL / 분에서 샘플을 실행합니다. 표 4에 제공된 MS 조건 하에서 이온화 글리 칸.

시각	%의 MPA	%의 MPB
0	(100)	0
(5)	98	(2)
(105)	(80)	(20)
(135)	(68)	(32)
(136)	(5)	(95)
(151)	(5)	(95)
(152)	(100)	0
167	(100)	0

프로테옴 분석을 표 1 LC 조건. 이동상 B (MPB, 98 % 아세토 니트릴, 2 % H ₂ O, 0.1 % 포름산)로 구배 용출은 총 총 프로테오믹스 데이터 의존 취득을위한 펩티드를 용출 하였다 , MS 실험.

MS 1 매개 변수
질량 범위 (목)	375-1500
해결	120,000
AGC	1 × 10 (6)
최대 이온화 시간	(30)
S-렌즈 FR 수준	(55)
모세관 Tem의P (° C)	(300)
전압 스프레이	1.75
MS 2 매개 변수
인수 유형	TOP20
해결	15,000
AGC	1 × 10 5
최대 이온화 시간	(30)
언더필 비율	2 %
격리 창 (목)	1.4
충전 상태 제외	+1
정규화 충돌 에너지	(27)
제외 시간 (들)	(20)

표 2 : orbitrap 기기에서 MS의 단백체 분석을위한 조건 전기 분무 이온화에 대한 매개 변수, MS ¹ 취득하고, MS ⁽²⁾ 취득 높은 에너지 dissociatio를 사용하여.N (HCD)가 제공됩니다.

시각	%의 MPA	%의 MPB
0	(95)	(5)
1	(70)	(30)
(41)	(60)	(40)
(46)	(37)	(63)
47	(10)	(90)
(55)	(10)	(90)
(56)	(95)	(5)
(66)	(95)	(5)

표 3 :. 글리 칸 분석을위한 LC 조건 구배 용출 하이 드라 지드는 N이 MS 분석을 위해 -glycans 태그 용출 하였다.

MS 1 매개 변수
질량 범위 (목)	600-1900
해결	60,000
AGC	5 × 10 5
최대 이온화 시간	(64)
S-렌즈 FR 수준	(65)
모세관 온도 (° C)	(325)
전압 스프레이	1.75
MS 2 매개 변수
인수 유형	Top12
해결	15,000
AGC	5 × 10 (4)
최대 이온화 시간	(100)
언더필 비율	1%
격리 창 (목)	1.4
고정 우선 질량
계단 표준화 충돌 에너지	10/20/30
제외 시간 (초)	(15)

(125)

표 4 : 하이 드라 지드에 대한 MS 조건은 N -glycan 분석 태그 전기 분무 이온화를위한 매개 변수, 높은 에너지 해리 (HCD)를 사용하여 orbitrap 기기에서 MS ¹ 취득하고, MS ⁽²⁾ 인수가 주어진다..

7. 단백질 체학 및 탈 아미드 화 분석

1. 표준 생물 정보학 검색 도구를 사용하여 단백질 / 펩티드를 확인합니다.
   주 : 다음 분석 프로토콜 UniprotKB에 스위스 보호 해주는 / TrEMBL 데이터베이스를 사용하고 프로테옴 Discoverer는 1.4 소프트웨어 SEQUEST 통해 검색 설계하였으나 프로토콜 직접 GUI 소프트웨어를 사용하여 단백질을 검색하고 채점 엔진으로 번역 될 수있다. 아래에 주어진 모든 명령은 드롭 다운 메뉴를 통해 소프트웨어 인터페이스에 액세스 할 수 있습니다.
   <리>를 만들거나 Apweiler 등에 의해 설명 된 바와 같이 게놈 데이터 또는 사용할 수 프로테옴 데이터베이스에서 유기체 적절한 단백질 서열 데이터베이스를 다운로드합니다. ⁽²⁵⁾
   참고 : 일반 프로테옴 데이터베이스는 스위스 보호 해주는, TrEMBL, 그리고 NCBI을 포함하지만,뿐만 아니라 사내 데이터에서 구축 할 수있다.
2. 퍼킨스 등에 의해 기술 된 바와 같이 소프트웨어 내에서 획득 된 데이터의 품질과 원하는 검색 rigorousness에 따른 데이터베이스 검색 엔진을 선택 파라미터를 선택한다. 마스코트 ⁽²⁶⁾ 또는 영어 등. SEQUEST ^27합니다.
   1. 높은 질량 정확도 데이터의 경우, 소프트웨어의 검색 설정 매개 변수는 다음과 같이 최대 2 놓친 분열, 5 ppm의 전구체 물질 허용 오차, 0.02 다 절편 질량 허용 오차 (최적화 된 정확한 탈 아미드 화 검출 ²²⁾ 및 다음 트립신 펩타이드 수정을 포함 "carbamidomethyl (C)"정적 변형 및 "탈 아미드 (N / Q)"과 "소전문화는 (M) "동적 수정. ⁽¹⁸⁾ O 소화 라벨을 사용하는 경우로는,"탈 아미드 화 ⁽¹⁸⁾ O (1) "추가 동적 변형있다.
   2. 검색 엔진 선택된 단백질 데이터베이스 (7.1.1)에 대한 원시 펩티드 정보를 사용.
      참고 : 질량 허용 오차가 사용 기기에 적합한 임의로 부족하지 있어야한다.
      주 : 검색 기능은 다양한 검색 엔진의 특정 알고리즘을 이용하여 소프트웨어에 의해 자동적으로 종료된다. 여과기 알고리즘 (마스코트), SEQUEST, 또는 알고리즘의 다른 조합은 펩타이드에서 단백질을 식별하고 히트의 유효성을 점수로 사용된다; 사용할 수있는 도구에 대한 자세한 정보는 곤잘레스 - Galarza 등. ^{(28, 29)에서} 리뷰에서 설명합니다. 소프트웨어에 따라 추가 검색 파라미터는 사용자의 판단에 따라 선택 될 필요가있다.
3. 수동 큐 레이션과 푸르트에 대해 확인 된 펩티드를 내보내기어 분석.

수동 N의 아스파라긴에 확인 탈 아미드 화를 포함하는 펩티드의 목록을 선별하는 글리코 실화를 모티브로 -linked (NX-(S / T)를 여기서 X ≠ P). 문헌에서 알려진 글리코 실화 모티브이 사이트를 교차 검증 및 결과의 두 가지 풀을 생성 (검증 및 이론).

탈 아미드 비 탈 아미드 형태의 풍부함과 비교하여 소정의 글리코 실화 부위의 퍼센트 점유율과 비교하기 위해 스펙트럼 계수 ^(30)를 사용한다.

8. 글리 칸 상대 정량

참고 : 다음 식별 및 정량은 XCalibur 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. 그러나, 자동으로 원시 데이터를 분석하는 소프트웨어는 크로마토 그래피 피크가 치환 될 수있다 통합합니다.

1. 탄당, 데 옥시 탄당, hexosamines, 시알 산의 생물학적으로 가능한 조합에서 글리 칸 작곡 이론 목록 및 기타 사를 생성ccharides. 이를 위해, 인간 당쇄 데이터베이스 워커 외. ^(15)에 의해 발행되었으며, 그대로 사용할 수있다. 이론적 데이터베이스의 경우, 종 특이 생물 제약 조합 공간에 부과되어야하며, 이러한 규칙은 Kronewitter 등. ^(31)에 의해 설명되어 있습니다.
2. 양성자 충전 상태 + 1-3 각 조성물에 원자 질량의 글리 칸 모노 이소 ​​토픽 질량 (M)을 계산합니다. NAT (254.14191 g / 몰) 또는 SIL (260.162042 g / mol)을 P2GPN 태그의 추가를 포함하는 모노 이소 ​​토픽 질량을 수정합니다.
3. XCalibur의 로드맵보기에서 "처리 설정"프로그램을 엽니 다. 정확히 보행자 등으로부터 보충 재에 기재된 처리 방법 설정한다. ^(15)에 대한 이론적 인 모노 이소 토픽 질량을 포함하는 단계 8.2에서 생성 목록을 사용하는 [M + H] ¹⁺ [M + 2H] ²⁺ 및 [ M + 3H] ³⁺ 종.
   참고 : 정확한 넘어 글리 칸의 신원을 확인하려면NAT / SIL은 실행을 양면 인쇄에 대한 질량, 확인 동일한 머무름 시간이 NAT 및 SIL N -glycan 쌍의 공동 용출 그. 질적, 옥소 늄 이온 시리즈 ^(32)에 속하는 피크를 포함해야하는, MS ⁽²⁾ 스펙트럼과 식별을 교차 확인합니다.
4. 정확히 워커 등으로부터 보충 자료에 설명 된대로 SIL 및 NAT 존재비를 얻기 위해 Excel로 영역을 통합, 추출 된 이온 크로마토 그램 (XIC)를 내 보냅니다. ⁽¹⁵⁾
5. 엑셀에서, 프로그램 새로운 열의 셀 워커 등에 의해 발표 식에 따라 SIL 존재 량을 조절함으로써 분자량 오버랩에 대한 보정을 계산 ^{한 5.} :
   ,
   이 모노 이소 ​​토픽 피크와 이론적 동위체 오버랩이고, 독립적 성분마다 계산 될 수있다.
6. 보행자 등에 의해 기술 된 바와 같이 두 번째 열에서, 프로그램 셀은, 스펙트럼 당 총 글리 칸 정규화 인자 (TGNF)에 대한 식을 이용하여 NAT와 SIL 채널을 정상화 ^{한 5.} :
   ,
   N이고 N의 수는 정량 한계 이상 -glycans.
7. 두 샘플 사이의 농도 접이식 변화를 계산하기 위해 NAT 글리 칸 (또는 그 반대) : 새 열에서 프로그램 세포는 SIL의 비율을 촬영합니다.

결과

그림 1 :. 결합 단백질 체학 및 글라 이코믹스 분석을위한 송곳니 - P2GPN 소수성 태그 결합 방법의 체계 (방법)이 주어 당화 사이트 식별과 글라 이코믹스 전용 처리 및 직렬 글라 이코믹스 및 프로테오믹스 분석,이 서로 다른 단계, 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 인라인 프로테오믹스 및 글라 이코믹스 필터 기반 P2GPN 소수성 태깅 방법 (방법 A)는 풀링 암탉 혈장 샘플 (도 1)를 이용하여 식별, 정량 및 분자량 바이어스 검증 하였다. 전적으로 글라 이코믹스 실험의 경우, N의 존재비에 간 비교는 방법에 의해 추출 -glycans이 SPE (금 표준, 방법 B) 만들어졌다 (그림 2) carbograph합니다. 두 가지 방법 사이의 글리 칸의 존재비에서 유의 한 차이가 없었다. 동일한 방법에 의해 추출 된 글리 칸의 NAT 비율 내 변동은 SIL을 정량함으로써 측정 하였다. 두 방법의 로그 ₂ -distributions 제로를 중심으로, 가우스했고, (그림 3A-B) 유의 한 차이가. 분자량은 필터가 N이 분자량 범위 및 친수성 (도 4)에 기초 -glycans 구별하지 않았다 시사 완전히 겹쳐진 두 프로토콜 사이의 범위이다.

그림 2 :. NAT 및 SIL N의 몰 혼합물 방법 또는 방법 B에 의해 추출 -glycans 2.5 암탉 플라즈마의 μL (N = 4) 샘플이었다 항문 제조 하였다각 NAT / SIL의 채널 부 (6) 각각의 당쇄에 대한 존재비 제안 추천 파라미터에 따른 UPLC-MS에 의해 yzed 분자를 보정 추출 된 이온 크로마토 그램 (MMA = 3 PPM) 아래의 면적을 적분하여 계산 하였다 TGNF 중량 중복 및 조정. 이 비율은 표준 오류가 표시됩니다. 방법 B의 존재비 :. 방법 N의 -glycans은 (p> 0.05) 유의 한 차이가 없었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 (A) 방법 인트라 변이 (N = 133) 또는 (B) 방법은 B (N = 123) 전략을 비교 하였다. 같은 추출 방식에서 N의 -glycans의 NAT 및 SIL 몰 혼합물세 가지 기술 복제 통해 분석 하였다. 로그 ₂ -distributions 제로를 중심으로 두 흐름 사이. 유의 한 차이가 없었다 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 각 전략 글리 칸에서의 분자량 범위를 비교 하였다. 이 워크 플로는 동일한 분자량 범위에 걸쳐 글리 칸을 얻었다. N은 다른 단지 검출 (1 × 10 ⁵ 풍부)의 한도를 초과 하락에 비해 하나의 프로토콜에서 검출 -glycans하고 체계적인 편견을 반영하지 않습니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

(표 5)가없는 전통 FASP 제제를 비교 하였다. FASP 트립신 다이제스트 (표준 프로토콜) 다음에 우리의 일반적인 18 시간 필터를 기반으로 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 소화는 glycosites의 식별을 방해 할 수 비특이적 탈 아미드 화 상당한 수준의 결과. 따라서, 높은 온도 (50 °의 C)와 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 스파이크 - 단계 (SPI 프로토콜)에서 짧은 배양 시간을 이용하는 방법은 마이크로파 분해 프로토콜 (MD 프로토콜)와 함께 대안으로 탐구하고, 비 최소화 특정 탈 아미드 화. 새로운 소화 방법에서 관찰 글리 칸은 표준 18 시간에서 조성물 또는 존재비에서 유의 한 차이가 없었다 37 ° C 필터 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 다이제스트 ( (표 5)에 대한 거짓 긍정적 인 속도로 감소 하였다.

		단백질					펩티드					탈 아미드 펩티드					Glycosites					당 단백질
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					(5)					(5)
18hr		(217)		(304)			6013		5086			1,029		733			257		(24)			(112)		(18)
MD		(270)		(266)			5190		5125			465		(455)			(254)		8			(102)		(7)
SPI		281		288			4729		4,482			(602)		573			(232)		(10)			(145)		8

. 표 5 : 표준 트립신에서 단백체 데이터의 비교는 인라인 송곳-P2GPN 태깅 방법 만들었다 대 소화 물질을 사용하여 수행 하였다 (+) 및하지 (-) MALDI 스펙트럼은 PNGase F는 비특이적 탈 아미드 화 및 추정의 배경 요금을 결정 거짓 긍정적 인 요금 glycosite. 단백질을 1 % 거짓 검색 속도 (FDR)로 확인되었다; 펩타이드는 프로테옴 Discoverer는 1.4 "높은"펩타이드의 신뢰를 기반으로 여과 (Q <0.01); glycosites는 identifi했다에드 보존 글리코 실화를 모티브로 (NXS / T)의 탈 아미드 화를 포함하는 고유 한 시퀀스에 기초 및 당 단백질은 적어도 하나의 식별 glycosite 확인 된 단백질을 함유하는 것으로 정의 하였다.

그림 5 : 글리 칸에 대한 단축 프로토콜은 샘플 탈 아미 노화를 최소화하기 위해 개발 18hr 송곳니 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 다이제스트에 비교 하였다. 존재비의 평균 차이는 10 % 각각 MD (2.2.3) 및 SPI (2.2.2) 프로토콜, 5 %였다. 확인 된 48 글리 칸 중 90 % 이하 1.5 배의 변화보다. 표시 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

일상적인 글리칸 분석을 용이하게 하기 위해서는 처리량이 많은 정량적 분석법이 필요합니다. 지난 30년 동안 글리코믹스 분석은 질병, 임상 응용 및 제약에서 중요성에도 불구하고 연구 그룹의 하위 집합으로 제한되었습니다. 글리코믹스 및 단백질체학을 위한 FANGS-P2GPN 정제 및 태깅 방법은 단일 분취량 샘플에 대해 동일한 분석을 수행하여 공급 비용과 필요한 재료의 양을 줄입니다(특히 인간 및 마우스 연구에서 중요). 또한, 모든 추가 단계가 오류에 기여하고 잠재적으로 환자-대조군 연구에서 중요하지만 풍부도가 낮은 변화를 가릴 수 있기 때문에 준비의 가변성을 최소화하려는 노력이 매우 중요합니다. FANGS를 소수성 히드라지드 태깅에 결합하면 단백질 및 글리칸 샘플을 동일한 RPLC 컬럼에서 실행할 수 있고, 글리칸 이온화를 향상시키며, 상대적인 정량화를 제공하며, 혈장에 정량적으로 적용할 수 있습니다.

N-글리칸 분석의 경우 완전한 탈글리코실화를 달성하기 위해 제안된 수준의 PNGase F를 사용하는 것이 중요합니다. 글리칸은 용매에 노출되지만 단백질의 변성과 과도한 효소는 효율적이고 완전한 절단을 보장하는 데 도움이 됩니다. 글리칸의 정확한 정량을 위해서는 유도체화 후 글리칸이 완전히 건조되어 반응을 담금질하고 NAT와 SIL 종을 혼합할 때 교차 반응을 방지해야 합니다. 마지막으로, 워크플로우를 글리코사이트 분석으로 확장할 때 비특이적 탈아미드화를 최소화하기 위해 단계의 타이밍이 중요합니다. 결합된 글리코믹스 및 단백질체학 분석을 위해 제공된 수정된 프로토콜은 그에 따라 수행될 때 일관되게 작동합니다.

이 워크플로우는 골드 스탠다드인 SPE 분석법과 비교하여 혈장에서 N-글리칸의 정확한 상대 정량을 달성합니다. 분자량, 친수성 및 조성 구조 측면에서 추출된 글리칸의 유형에는 명백한 편향이 없습니다. O-결합 글리칸의 정성적 분석을 탐색하지는 않았지만 FANGS가 N-결합 글리칸의 PNGase F 분해 후 β-제거 단계의 추가를 수용할 수 있을 것으로 기대합니다. 그러나 질량 분석 전에 시약 세척을 위해 절차를 크게 수정해야 하며 펩타이드 분석은 상당한 영향을 미칩니다. 단백질체학의 경우 기존 FASP 방법과 비교하여 동일한 깊이의 단백질체 커버리지가 달성됩니다. 중요한 것은 분석법이 N-글리칸 탈아미드화에 대한 최소한의 잘못된 발견률을 달성한다는 것입니다. 이 방법은 PNGase 분해 단계^22,23 동안 Asn의 ^18O표지와 호환되지만, 낮은 글리코실화 부위 거짓 발견률은 필요하지 않을 수 있음을 시사하여 비용과 복잡성을 더욱 줄입니다.

프로테옴은 이 방법에서 당단백질에 대해 풍부하지 않으며 이는 장점과 단점을 모두 가지고 있습니다. 특정 저풍부 당단백질은 분석에서 검출되지 않을 수 있습니다. 그러나 단백질당 당화된 부위의 점유율은 생물학적 샘플 간에 비교할 수 있습니다. 또한 렉틴 친화성 정제 또는 화학적 농축으로 인해 발생하는 오류와 편향이 제거됩니다. 결론적으로, 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 FANGS를 개별성 정규화에 결합하면 글리콤 및 프로테옴의 탠덤 분석을 위한 단순화되고 정량적이며 처리량이 많은 방법이 생성되며 임상 환자-대조군 연구에 적용할 수 있는 큰 잠재력이 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세트산 (50%)	시그마 알드리치	45754
아세토니트릴, HPLC 등급	Burdick & 잭슨	AH015-4
암모늄 바이카보네이	시그마 Aldrich	A6141
브래드포드 시약	시그마 알드리치	B6916	대안: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016
원심분리기	Eppendorf	5804 R	14,000 x g에 이르는 대체 원심분리기가 적합합니다.
DL-Dithiothreitol, 1  용액 중 M	시그마 알드리치
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	대체 나노 또는 초고압 LC는 다음과 같은 유사한 데이터를 생성합니다: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC(Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC(Waters).
플로팅 튜브 랙	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp 표준 실험실 오븐	Fisher Scientific	11-690-625F	56 에 이르는 대체 인큐베이터; &데그; C는
적합한 포름산	시그마 Aldrich입니다	56302
GE 전자레인지 오븐	General Electric	57B5 E82904	조절 가능한 전력 설정이 있는 모든 전자레인지가 적합합니다
INLIGHT Glycan 태깅 키트	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	INLIGHT 키트는 P2GPN 시약의 NAT 및 SIL 버전을 제공합니다.
요오도아세트아미드	시그마 알드리치	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 벌크 고정상	Phenomenex	벌크 미디어	대안: 모든 C18 고정상 5  mM
Mascot Daemon 소프트웨어 및 서버	매트릭스 과학		대안: Proteome Discoverer Software(Thermo Scientific)
메탄올, HPLC 등급	Burdick & 잭슨	AH230-4
PicoFrit 자체 팩 열: 360  μ m, OD 75  μ m ID, 15  μ m 팁, 비코팅, 박스당 5개, 50 cm	새로운 목표	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (글리세롤 프리), 75,000  단위/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량	Thermo Scientific		대체 고질량 정확도 (5  ppm) 질량 분석기는 유사한 데이터를 제공합니다
RNase B	New England Biolabs	P7817S
트립신	시그마 알드리치	T6567-5X
요소	시그마 알드리치	51456
진공 집중기Savant SPD131DDA SpeedVac 집중기	Thermo Scientific	SPD131DDA	대체 진공 농축기가 적합합니다
. Vivacon 500 30 kDa 필터	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	대안: Amicon Ultra 0.5 원심 필터 유닛과 Ultracel-10  kDa 멤브레인 (Millipore UFC501096)
물, HPLC 등급	Burdick & 잭슨	AH365-4
물, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	PNGase F 다이제스트 단계에서 18O를 추가하는 것은 선택 사항이며 95% 신뢰도로 완료된 탈아미드화 연구에는 필요하지 않을 수 있습니다
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent 테스트 키트	Merck Millipore	693030