방법 논문

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

DOI:

10.3791/53747

⸱

2016년 2월 19일

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

이 논문에서

요약

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기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

초록

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세포의 급속한 확산, 유전자의 조직 - 특이 적 발현 및 시그널링 네트워크의 출현은 모든 척추 동물의 초기 배아 발달의 특성. 심지어 하나의 셀 내에서 - - 반응 속도 및 신호의 위치 배아의 중요한 발달 유전자의 식별을 보완합니다. 면역 염색 기술이 차 섬모 작게 구조의 세포 내 및 전체 동물 신호의 동역학을 정의하기 위해 도시되었다는 것을 설명한다. 레이저 스캐닝 공 초점 복합 현미경을 사용하여 정착, 영상 및 이미지 처리 기술은 적은 36 시간 내에 완료 될 수있다.

제브라 피쉬 (다니오 레 리오)는 저렴하고 인간의 질병에 관련된 척추 동물 종에서 연구를 수행하고자 연구자를위한 바람직한 유기체이다. 유전자 녹아웃 또는 knockdowns는 실제 단백질 제품의 손실에 의해 확인되어야한다. 단백질 손실 이러한 확인여기에 설명 된 기술을 사용하여 달성 될 수있다. 신호 전달 경로에 대한 단서는 번역 후 인산화에 의해 변형 된 단백질과 반응하는 항체를 사용하여 해독 할 수 있습니다. 보존 및 에피토프의 인산화 상태를 최적화하는 것은이 결정하는 것이 중요하며,이 프로토콜에 의해 달성된다.

이 연구는 개발의 첫 72 시간 동안 배아를 해결하기 위해 기술을 설명 쿠퍼의 소포 (KV)의 섬모와 관련 항원의 다양한 신장과 내이 공동 현지화. 이러한 기술은 절개하지 않아도, 간단하고 비교적 짧은 시간에 완료 될 수있다. 하나의 이미지로 공 초점 이미지 스택을 투사하는 것은 이러한 데이터를 제시하는 유용한 수단이다.

서론

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여기에 설명된 기술은 수정, 위형성, 체세포 형성 및 몸통, 눈, 뇌 및 장기 형성을 포함하여 초기 발달 중에 발생하는 이벤트 동안 Ca2+ 신호의 다운스트림 대상을 정의하려는 연구의 결과입니다. 1-3 배아 Ca2+ 신호전달의 최초 발견은 aequorin4 및 fura-2와 같은 자연적이고 조작된 Ca2+ 지표의 사용에 의존했습니다. 5 현재의 기술로도 Ca2+의 과도 고도를 감지하려면 번거로운 분석 도구가 필요하며 이러한 Ca2+ 신호의 대상을 드러내지 않습니다.

이 실험실은 중추 신경계에서 풍부하며 원래 장기 강화의 조절자로 확인된 효소인 CaMK-II로 알려진 Ca2+/칼모듈린 의존성(다기능) 단백질 키나아제를 통해 작용하는 Ca2+ 신호를 조사합니다. 6 CaMK-II는 뇌 특이적이지 않으며, 무척추 동물을 포함한 동물계 전역의 종과 종의 전체 수명과 신체에 걸쳐 널리 발현되고 고도로 보존됩니다. 7,8 CaMK-II는 Thr287에서 자가인산화 능력으로 인해 Ca2+ 수치가 감소한 후에도 자체 활성을 유지할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있습니다. 이 자가인산화 상태에서 CaMK-II는 탈인산화될 때까지 Ca2+/CaM 독립적 방식으로 활성 상태를 유지합니다. 6 따라서, 인산화된 CaMK-II(Thr287)의 국소화는 자연스럽고 유의미한 Ca2+ 상승이 발생한 세포를 식별할 수 있습니다.

자가인산화(P-Thr287) 포유류 CaMK-II에 대한 항체는 특성이 잘 규명되어 있으며 초기에는 뇌 조직에서 활성화된 CaMK-II를 국소화하는 데 사용되었습니다. 9 제브라피시(Danio rerio)는 7개의 CaMK-II 유전자10,11을 가지고 있으며, 이 유전자의 단백질 산물은 이 영역에서 MHRQE[pT287]VECLK 서열을 포함하고 있습니다. 10,11 이 염기서열은 이 토끼 다클론 항체를 생성하는 데 사용되는 인산펩티드 항원(MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore)에 의해 확인되었기 때문에 이 항체가 제브라피시 CaMK-II와 교차 반응한 것은 전혀 놀라운 일이 아니었습니다. 이 실험실은 이 항체가 자가인산화 및 Ca2+/CaM 독립적 활성에 비례하여 제브라피시 CaMK-II와 반응한다는 것을 보여주었습니다. 12 추가적인 팬 특이적 CaMK-II 항체도 제브라피시 CaMK-II와 교차 반응하는 것으로 나타났습니다. 13

세

이 항체는 제브라피시 CaMK-II가 좌우 비대칭을 확립하는 데 필요한 섬모 기관인 제브라피시 쿠퍼 소포(KV)의 한쪽 면에 있는 세포에서 우선적으로 활성화된다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 12 이 항체는 CaMK-II가 장기 위치가 결정되는 것과 정확히 동일한 발달 단계 동안 KV의 왼쪽에 있는 4개의 인접한 세포에서 일시적으로 활성화된다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 12 Kupffer's Vesicle(KV) 외에도 자가인산화(P-T287)는 신장, 신경마스트 및 내이를 포함한 다른 섬모 조직의 특정 세포 내 부위에도 위치했습니다. 12,13 제브라피시 신장에서 P-T287-CaMK-II는 섬모 관 세포의 정점 경계를 따라 그리고 배설 섬모 내에서 농축되어 그 조립에 영향을 미칩니다. 13 마지막으로, 발달 중인 내이에서 P-T287-CaMK-II는 섬모 기저부에 집중되어 있으며 Delta-Notch 신호 경로를 통해 세포 분화에 영향을 미칩니다. 14 요약하면, 활성화된 CaMK-II의 검출은 세포 내 Ca2+ 방출 부위를 정확히 찾아내고 잠재적인 새로운 신호 경로를 밝혔습니다.

이러한 발견은 활성화된(P-T287-자가인산화) CaMK-II를 국소화하기 위한 민감하고 정확한 방법 개발에 전적으로 의존했습니다. 제브라피시 KV, 신장 및 내이를 고정하고 면역 염색하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술의 한계에 대해서도 설명합니다. 이러한 기술은 초기 척추동물 발달 과정에서 인산-항원결정기뿐만 아니라 모든 항원결정기의 두 가지 형광 채널에서 고해상도 이미지를 얻으려는 모든 연구자에게 유용할 것입니다.

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프로토콜

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이 프로토콜의 제브라 피쉬 절차는 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

시약 1. 준비

  1. 4 % PFA / PBS. 흄 후드에서 파라 포름 알데히드의 8g (PFA)를 달아. 여전히 흄 후드에서, ~ 80 ml를 50 ° C로 교반 및 가열 증류수 H 2 O를 건조 PFA를 용해하는 동안. PFA 완전히 용해되어 용액이 명확 할 때까지 신선한 1N NaOH를 10 방울 - 교반하면서, 3을 추가합니다. 열에서 제거하고 100 ml의 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 증류수 H 2 O 200 ml의 부피를 가져와 실온으로 냉각하고 사용하기 전에 7.4의 산도를 확인합니다. 4 ° C에서 어둠에 보관하지만 1 주일 이내에 사용한다.
  2. 어떤 보충없이 100 % 메탄올을 사용합니다. 어떤 보충없이 95 % 에탄올을 사용합니다.
  3. 인산염 완충 트윈 (PBT)를 준비합니다. 0.1 % 트윈 -20으로 인산 완충 식염수 (PBS)를 보완. 0을 추가합니다.1X PBS 100 ㎖에 20 % 트윈 -20 스톡 용액 5 ㎖. 실온에서 보관하십시오.
  4. 인산염 완충 트리톤-X (PBTx)를 준비합니다. 0.1 % 트리톤 X-100으로 PBS를 보충합니다. PBS 100 ㎖에 20 % 트리톤 X-100 주식의 0.5 ML을 추가합니다. 실온에서 보관하십시오.
  5. 10 % NGS / PBTx를 준비합니다. 정상 염소 혈청 (NGS) 블록은 비 - 특이 적 결합 부위. -20 ° C에서 분취에 보관 NGS. 사용 9 ml의 PBTx 1 ml에 추가합니다.
  6. 50 % 글리세롤 / PBS를 준비합니다. 배 PBS 100 % 글리세롤의 완전히 동일한 부분을 섞는다. 실온에서 보관하십시오.

2. 배아 고정

  1. . (. 예를 들어, β - 굴지 : CAAX-GFP) 사육 구하는 야생형 (AB 및 WIK) 또는 형질 전환 자연 교배를 통해 배아. 원하는 경우 설명 된대로, 구조 또는 morpholinos와 배아를 주입. (15, 16)
  2. . 배아 증액 배아 모아서 바와 같이 염색을 차단하기 위해 0.003 %, 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)의 존재하에 28.5 ℃에서 배양한다. 17 P>
  3. 배아가 원하는 발달 단계, 18에 도달하면. 수정,   , MESAB를 이용하여 배아 마취 최대한 시스템의 물을 제거하고 신선한 3 4 % PFA / PBS를 추가 - RT에서 4 시간. 참고 : 20 시간 게시물 수정 (HPF)보다 적은 시간에, dechorionation하기 전에 수정합니다. HPF (20) 이후에 때때로, 해부 현미경 하에서 미세 점 두 쌍의 집게를 이용하여 고정하기 전에 dechorionate.
  4. 솔루션을 변경. 넓은 구멍 피펫을 사용하여 배아로 이동 한 바와 같이.의 microcentrifuge 튜브 덮인 1.5 ml의 17 변경 솔루션, 단순히 배아가 원심 분리하지 않고 중력에 의해 정착 할 수 있도록하여.
  5. 후 정착액 3 후 -. 4 시간, 최소 48 시간 동안 -20 ° C에서 100 % 메탄올 저장 교체, PFA / PBS를 제거합니다. 참고 : 최대 P-CaMK-II 면역를 들어, 일주일 총 메탄올 저장 시간을 제한 할 수 있습니다.
"> 3. 면역 염색 항목의 태아

  1. 출장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 각 실험 조건 10 배아의 최소 배치하고 레이블을 붙입니다.
  2. 배아가 정착하도록 허용합니다. 메탄올을 제거하고 폐기하고 다음 단계에서 나타낸 바와 같이, 에탄올의 농도를 감소 0.5ml를 함유 프로그레시브 세척하여 재수. 각 단계는 락과 5 분 세척입니다.
  3. 점진적이 5 솔루션 재수 : 66 % 에탄올 / 33 % PBTx, 33 % 에탄올 / PBTx은 100 % PBTx 100 % PBTx (이 PBTx 첫 반복이다), 100 % PBTx (이 두 번째 반복 인 66 % PBTx).
  4. 마지막 PBTx 세척을 제거합니다. 0.5 ml의 10 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드러운 락과 실온에서 적어도 1 시간 동안 품어 후 제거 솔루션을 폐기합니다.
  5. 10 % NGS / PBTx에 희석 차 항체 솔루션을 준비합니다. 공동 면역 염색 경우, 먼저 높은 친 화성 항체를 사용합니다. 500 : 본 연구를 위해, 1 희석 마우스 항 아세틸 튜 불린 단클론 항체로 배양한다. exampl에 대한즉, 10 개의 샘플이 10 % NGS / PBTx 3 ml의 스톡 항체 용액 6 ㎕를 결합하고,이 각 튜브에 0.3 ㎖에 분산이있는 경우.
  6. 모든 배아를 체험하기 위해 각 튜브에 희석 차 항체 0.5 ml의 - 0.2을 추가합니다. 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어.
  7. 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 초과 일차 항체를 씻어 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다.
  8. 머리 위의 조명을 어둡게하고 각 조건이 적어도 0.5 ml에 포함되도록 10 % NGS / PBTx에서 적절한 형광 접합 된 이차 항체를 희석. (500) 희석 : 마우스 항 - 아세틸 화 튜 불린 차 항체로, 1에서 녹색 형광 염료 염소 항 - 마우스 IgG를 사용합니다.
  9. 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 차 항체를 품어. 희미하게 불빛 아래 어두운 용기에 배양 또는 알루미늄 호일에 포장하여 샘플 프로세스, 지금부터.
  10. 인큐베이션의 끝에, 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx 세탁에 추가. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다.
  11. 공동 면역 경우 제 차 항체보다는 다른 종으로부터 제 차 항체를 얻었다. 이 연구에서 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체에 의해 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체를 따릅니다.
  12. 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체 1:20 희석. 배아의 각 튜브를 들어, 다음, 0.3 ml의 10 % NGS / PBTx에 중단 주식 항체 용액 15 μl를 추가합니다.
  13. 배아가 몰입과 조명이 희미하게되어 있는지 확인합니다. 어둠 속에서 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어.
  14. 희미한 불빛 아래에서 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다.
  15. 희미한 간접 조명을 유지하고 적절한 형광 conju 충분히 희석문이 이차 항체 있도록 각 조건은 적어도 0.5 ml에 포함되어 있습니다. 500 10 % NGS / PBTx : 본 연구에서는 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체 (적색 채널) 1을 희석.
  16. 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 제 2의 2 차 항체를 품어.
  17. 이 배양 희미한 조명 아래 끝에서 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 PBTx을 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. 쇼핑몰 PBTx 50 % 글리세롤 / PBS 하나로 촬상 절차에 따라.

4. 공 촛점 이미징 및 처리

  1. 마운트 이미징 배아. 유리 슬라이드에 5 배아 - 1을 배치합니다. 메인 커버 슬립 및 챔버의 각각의 측면 상에 커버 슬립 단편을 사용하여 슬라이드 사이에 챔버를 만든다. 일반적으로, 네 # 1 커버 슬립은 밀봉하지 않고 이러한 스페이서 스택을 만드는 데 사용됩니다.
    참고 : 설치 매체가 필요하지 않습니다.
  2. 100X 기름 침지를 사용하여목적은 전송 된 빛을 사용하여 초점 단일 배아를 가지고 있습니다. 빛을 끕니다. 공 초점 현미경을 켭니다. 적절한 레이저 (녹색 및 / 또는 적색) 켜져 있고 원격 포커스 악세사리가 종사을 확인합니다.
  3. 공 초점 프로그램을 켭니다. 에서 "획득 바,"적절한 목표를 선택합니다. "XY 기본"줄에 1,024 버튼을 클릭하여 1,024에 이미지 크기를 설정합니다.
  4. "레이저 및 감지기"줄에서 각 채널에 대한 레이저 및 검출기를 켭 빨간색 488 상자와 녹색 568 상자를 클릭합니다. 매체에 핀홀 설정하고 시각화하는 각 채널의 "게인"줄의 게인을 조정합니다.
  5. "취득 설정"줄에서 이미지를 획득 시작 "라이브"를 클릭합니다. "보기 설정"줄에서 "라이브"창에서 가운데​​로 "일체형 줌을 강제로"상자를 선택 취소합니다.
  6. "설정 획득"줄에서 "Z"탭에서, 이미지의 레이어를 통해 단계. 뉴를 선택한 후광학 섹션의 mber, 이미지에 통합 Z-평면의 "중심"의 어느 시점으로 이동합니다.
  7. "Z"탭에서 작은 빨간 "참조"상자를 클릭합니다. 이 "중앙"으로서 선택 시점 RFA 영점 것이다. "스텝 크기"라고 표시된 상자에 (이상적입니다 μm의 μm의 0.25 내지 2.0) 층의 두께를 선택합니다. "파일 크기"상자에 주목하고 1GB로 제한하려고합니다.
    주 : 일반적으로 0.5 내지 40 부까지의 광학 - 1.0 μm의 수득되지만, 섹션들의 수는 실험적으로 결정될 수있다.
  8. 이미지의 상단 극단적 인을 찾으려면 "최고"옆에있는 원을 클릭하고 Z 층을 통해 이동합니다. 이제 다음 "바닥"에 동그라미를 누르면 컴퓨터는 중심으로 층으로 다시 이미지를 취할 것입니다. 다시 이미지의 하단 극단적 인을 찾기 위해 레이어를 통해 이동합니다.
  9. 레이저를 중지 상자 "취득 설정"에서 다시 "라이브"를 클릭취득. 이 패널에서 빨간 평균 표시 박스와 Z-스택을 클릭합니다. 이 상자는 녹색으로 바뀝니다.
  10. "취득 설정"상자에서 이미지의 전체 시리즈를 취득하는 "싱글"을 클릭합니다. 이 두 채널에서 전체 Z - 스택을 통해 검색과 같이 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다.
  11. 저장 볼륨 창을 클릭 클릭 "다른 이름으로 저장"및 파일 이름을 지정합니다. ".ids"파일로 저장합니다. 볼륨 Z-스택이 열려있는 동안, 파일을 렌더링 데이터 풀다운 메뉴에서 "렌더링 볼륨"을 클릭 선택합니다. TIFF 파일로 렌더링 된 파일을 저장합니다. 현재 문서는 인쇄물에 표시됩니다 투사 된 이미지입니다.

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결과

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포스 에피토프를 시각화하기위한 최적의 조건

제브라 피쉬 배아에서 단백질 항원 결정기의의 면역을 설명하는 방법은 현장 하이브리드의 mRNA를 통해 현지화에 대한에 비해 상대적으로 드문 드문 있었다. 제브라 피쉬 배아의 섬모 세포에서 단백질 에피토프를 로컬 라이즈에 사용되는 고정 제 4 % PFA / PBS 및 메탄올과 현장 하이브리드의 전체 마운트에 의해 RNA의 DMSO. 19 현지화 (WISH)의 혼합물이다 덴트의 정착을 포함했다 일반적으로 PFA를 사용하여 달성 100 % 메탄올에 저장 하였다. 20,21 우리의 연구는 두 내지 7 일 메탄올 시간을 제한 할 때 WISH 정착액 조합, P-CaMK-II 항체의 면역을위한 다른 정착에 크게 우수한 것을 알았다...

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토론

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PFA / 메탄올 방법은 제브라 피쉬 개발하는 동안 포스-T 287 -CaMK-II 에피토프의의 면역을 최적화의 주요 목적이 실험실에서 개발되었다. 이 방법은 성공적으로 제브라 피쉬의 KV, 14, 특히 KV 단계에서 신장. (13),이 기술이 필요했다 (12) 내이 등 여러 기관 섬모의 형성 동안 P-CaMK-II를 현지화. 이러한 방법의 성공으로 인해자가 형광의) 최소화, 포스 CaMK-II 에피토프 b) 보존 항체 에피토프 c) 향상된 접근성 조합 쉽다.

이 접근법의 주요 한계는 메탄올 저장 시간이다. P-CaMK-II의 면역 반응은 -20 ° C에서 메탄올 두 일 후 최대하지만,이 에피토프의 반응은 메탄올 저장 일주일 후 손실됩니다. 또한이 때 포스페이트 기가 HY인지 명확하지 않다drolyzed 또는 추가 변성은 그 면역 반응을 감소 발생합니다. -20 ° C에서 메탄올 / EGTA 초기 ...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 IOS-0817658에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-페닐-2-티오우레아(PTU)시그마P-76290.12% 원액. 시스템 물에 1:40 희석
Alexa488 안티 마우스 IgGLife TechnologiesA11001염소 다클론성, 1:500
Alexa488 안티 토끼 IgGLife TechnologiesA11008염소 다클론성, 1:500
Alexa488 phalloidinLife TechnologiesA12379F-actin
Alexa568 안티 마우스 IgGLife TechnologiesA11004에 우선적으로 결합염소 다클론성, 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgGLife TechnologiesA11011염소 다클론성, 1:500
anti-acetylated α-tubulinSigmaT7451Mouse monoclonal, 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Rabbit polyclonal, 1:20
anti-total CaMK-IIBD Biosciences에서 사용611292마우스 단클론, 1:20
에탄올FisherS96857실험실 등급, 95% 변성
펜치파인 사이언스 도구11252-20Dumont #5
유리 커버슬립VWR16004-330#1  두께
유리 현미경 슬라이드Fisher12-550-15표준 유리 슬라이드
메탄올FisherA411냉동실에 보관
마이크로 원심 분리기 튜브VWR20170-038뚜껑이 달린 튜브, 멸균되지 않음
일반 염소 혈청Life Technologies16210-064부분 표본 1ml 튜브, 냉동실에 보관
파라포름알데히드SigmaP-6148시약 등급, 결정질
인산염 완충 식염수(PBS)품질 생물학119-069-13110x 재고 용액 또는 실험실에서 만든
Triton X-100SigmaBP-15110% 용액을 물에 저장, RT
Tween-20Life Technologies8511310% 용액을 물에 저장, RT
복합 현미경NikonE-600보관 무진동 테이블
C1 플러스 2레이저 스캐닝 컨포칼NikonC1 PlusEZ-C1 프로그램으로 실행되지만 업그레이드는 " 요소"
에서 사용 에 에 장착

참고문헌

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  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
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