전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

요약

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

초록

세포의 급속한 확산, 유전자의 조직 - 특이 적 발현 및 시그널링 네트워크의 출현은 모든 척추 동물의 초기 배아 발달의 특성. 심지어 하나의 셀 내에서 - - 반응 속도 및 신호의 위치 배아의 중요한 발달 유전자의 식별을 보완합니다. 면역 염색 기술이 차 섬모 작게 구조의 세포 내 및 전체 동물 신호의 동역학을 정의하기 위해 도시되었다는 것을 설명한다. 레이저 스캐닝 공 초점 복합 현미경을 사용하여 정착, 영상 및 이미지 처리 기술은 적은 36 시간 내에 완료 될 수있다.

제브라 피쉬 (다니오 레 리오)는 저렴하고 인간의 질병에 관련된 척추 동물 종에서 연구를 수행하고자 연구자를위한 바람직한 유기체이다. 유전자 녹아웃 또는 knockdowns는 실제 단백질 제품의 손실에 의해 확인되어야한다. 단백질 손실 이러한 확인여기에 설명 된 기술을 사용하여 달성 될 수있다. 신호 전달 경로에 대한 단서는 번역 후 인산화에 의해 변형 된 단백질과 반응하는 항체를 사용하여 해독 할 수 있습니다. 보존 및 에피토프의 인산화 상태를 최적화하는 것은이 결정하는 것이 중요하며,이 프로토콜에 의해 달성된다.

이 연구는 개발의 첫 72 시간 동안 배아를 해결하기 위해 기술을 설명 쿠퍼의 소포 (KV)의 섬모와 관련 항원의 다양한 신장과 내이 공동 현지화. 이러한 기술은 절개하지 않아도, 간단하고 비교적 짧은 시간에 완료 될 수있다. 하나의 이미지로 공 초점 이미지 스택을 투사하는 것은 이러한 데이터를 제시하는 유용한 수단이다.

서론

여기에 설명된 기술은 수정, 위형성, 체세포 형성 및 몸통, 눈, 뇌 및 장기 형성을 포함하여 초기 발달 중에 발생하는 이벤트 동안 Ca²⁺ 신호의 다운스트림 대상을 정의하려는 연구의 결과입니다. ^1-3 배아 Ca²⁺ 신호전달의 최초 발견은 aequorin⁴ 및 fura-2와 같은 자연적이고 조작된 Ca²⁺ 지표의 사용에 의존했습니다. ⁵ 현재의 기술로도 Ca²⁺의 과도 고도를 감지하려면 번거로운 분석 도구가 필요하며 이러한 Ca²⁺ 신호의 대상을 드러내지 않습니다.

이 실험실은 중추 신경계에서 풍부하며 원래 장기 강화의 조절자로 확인된 효소인 CaMK-II로 알려진 Ca²⁺/칼모듈린 의존성(다기능) 단백질 키나아제를 통해 작용하는 Ca²⁺ 신호를 조사합니다. ⁶ CaMK-II는 뇌 특이적이지 않으며, 무척추 동물을 포함한 동물계 전역의 종과 종의 전체 수명과 신체에 걸쳐 널리 발현되고 고도로 보존됩니다. ^7,8 CaMK-II는 Thr²⁸⁷에서 자가인산화 능력으로 인해 Ca²⁺

프로토콜

이 프로토콜의 제브라 피쉬 절차는 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

시약 1. 준비

1. 4 % PFA / PBS. 흄 후드에서 파라 포름 알데히드의 8g (PFA)를 달아. 여전히 흄 후드에서, ~ 80 ml를 50 ° C로 교반 및 가열 증류수 H ₂ O를 건조 PFA를 용해하는 동안. PFA 완전히 용해되어 용액이 명확 할 때까지 신선한 1N NaOH를 10 방울 - 교반하면서, 3을 추가합니다. 열에서 제거하고 100 ml의 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 증류수 H ₂ O 200 ml의 부피를 가져와 실온으로 냉각하고 사용하기 전에 7.4의 산도를 확인합니다. 4 ° C에서 어둠에 보관하지만 1 주일 이내에 사용한다.
2. 어떤 보충없이 100 % 메탄올을 사용합니다. 어떤 보충없이 95 % 에탄올을 사용합니다.
3. 인산염 완충 트윈 (PBT)를 준비합니다. 0.1 % 트윈 -20으로 인산 완충 식염수 (PBS)를 보완. 0을 추가합니다.1X PBS 100 ㎖에 20 % 트윈 -20 스톡 용액 5 ㎖. 실온에서 보관하십시오.
4. 인산염 완충 트리톤-X (P....

결과

포스 에피토프를 시각화하기위한 최적의 조건

제브라 피쉬 배아에서 단백질 항원 결정기의의 면역을 설명하는 방법은 현장 하이브리드의 mRNA를 통해 현지화에 대한에 비해 상대적으로 드문 드문 있었다. 제브라 피쉬 배아의 섬모 세포에서 단백질 에피토프를 로컬 라이즈에 사용되는 고정 제 4 % PFA / PBS 및 메탄올과 현장 하이브리드의 전체 마운트에 의해 RNA의 DMSO. ¹⁹ 현지화 (WISH)의 혼합물이다 덴트의 정착을 포함했다 일반적으로 PFA를 사용하여 달성 100 % 메탄올에 저장 하였다. ^20,21 우리의 연구는 두 내지 7 일 메탄올 시간을 제한 할 때 WISH 정착액 조합, P-CaMK-II 항체의 면역을위한 다른 정착에 크게 우수한 것을 알았다.......

토론

PFA / 메탄올 방법은 제브라 피쉬 개발하는 동안 포스-T ²⁸⁷ -CaMK-II 에피토프의의 면역을 최적화의 주요 목적이 실험실에서 개발되었다. 이 방법은 성공적으로 제브라 피쉬의 KV, ^14, 특히 KV 단계에서 신장. ^(13),이 기술이 필요했다 ⁽¹²⁾ 내이 등 여러 기관 섬모의 형성 동안 P-CaMK-II를 현지화. 이러한 방법의 성공으로 인해자가 형광의) 최소화, 포스 CaMK-II 에피토프 b) 보존 항체 에피토프 c) 향상된 접근성 조합 쉽다.

이 접근법의 주요 한계는 메탄올 저장 시간이다. P-CaMK-II의 면역 반응은 -20 ° C에서 메탄올 두 일 후 최대하지만,이 에피토프의 반응은 메탄올 저장 일주일 후 손실됩니다. 또한이 때 포스페이트 기가 HY인지 명확하지 않다drolyzed 또는 추가 변성은 그 면역 반응을 감소 발생합니다. -20 ° C에서 메탄올 / EGTA 초기 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1-페닐-2-티오우레아(PTU)	시그마	P-7629	0.12% 원액. 시스템 물에 1:40 희석
Alexa488 안티 마우스 IgG	Life Technologies	A11001	염소 다클론성, 1:500
Alexa488 안티 토끼 IgG	Life Technologies	A11008	염소 다클론성, 1:500
Alexa488 phalloidin	Life Technologies	A12379	F-actin
Alexa568 안티 마우스 IgG	Life Technologies	A11004	에 우선적으로 결합염소 다클론성, 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11011	염소 다클론성, 1:500
anti-acetylated α-tubulin	Sigma	T7451	Mouse monoclonal, 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	Rabbit polyclonal, 1:20
anti-total CaMK-II	BD Biosciences에서 사용	611292	마우스 단클론, 1:20
에탄올	Fisher	S96857	실험실 등급, 95% 변성
펜치	파인 사이언스 도구	11252-20	Dumont #5
유리 커버슬립	VWR	16004-330	#1  두께
유리 현미경 슬라이드	Fisher	12-550-15	표준 유리 슬라이드
메탄올	Fisher	A411	냉동실에 보관
마이크로 원심 분리기 튜브	VWR	20170-038	뚜껑이 달린 튜브, 멸균되지 않음
일반 염소 혈청	Life Technologies	16210-064	부분 표본 1ml 튜브, 냉동실에 보관
파라포름알데히드	Sigma	P-6148	시약 등급, 결정질
인산염 완충 식염수(PBS)	품질 생물학	119-069-131	10x 재고 용액 또는 실험실에서 만든
Triton X-100	Sigma	BP-151	10% 용액을 물에 저장, RT
Tween-20	Life Technologies	85113	10% 용액을 물에 저장, RT
복합 현미경	Nikon	E-600	보관 무진동 테이블
C1 플러스 2레이저 스캐닝 컨포칼	Nikon	C1 Plus	EZ-C1 프로그램으로 실행되지만 업그레이드는 " 요소"

에서 사용 에 에 장착