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방법 논문

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

9.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

2016년 3월 3일

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

이 논문에서

요약

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

초록

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 정상 및 질병 조건 모두에서 인간 발달을 in vitro에서 연구할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 연구자들은 배양 조건을 조작하여 개발 중에 나타난 신호를 요약함으로써 hPSC를 관심 세포 유형으로 분화시킬 수 있습니다. 이러한 세포 유형 중 하나는 멜라닌 세포(melanocyte)로, 자외선 조사로부터 피부를 보호하는 신경능선(NC) 기원의 색소 생성 세포입니다. 이 프로토콜은 NC를 완전히 색소화된 멜라닌 세포로 더욱 분화하기 위해 hPSC에서 현재 사용 가능한 체외 신경 능선 분화 프로토콜의 확장을 제시합니다. 멜라닌 세포 전구체는 이중 SMAD 억제 조건에서 WNT, BMP 및 EDN3 신호의 활성제에 대한 시간 노출을 통해 Neural Crest 프로토콜에서 농축될 수 있습니다. 그 결과 생성된 멜라닌 세포 전구체는 정제되고 선택적 배지에서 배양에 의해 완전히 착색된 멜라닌 세포로 성숙됩니다. 그 결과 생성된 멜라닌 세포는 완전히 착색되고 성숙한 멜라닌 세포의 특징인 단백질에 적절하게 염색됩니다.

서론

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 세포 대체 요법 1-6 대한 확장 형태로 정상적인 분화를 모방하는 플랫폼을 제공한다. 특히 관심, hPSCs은 분리하기 어렵거나 환자 샘플이 부족하다 희귀 / 과도 세포 유형 공부 길을 엽니 다. 또한, 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 고유의 메커니즘 1,2,7-11을 해명하기 위해 환자 특정 방식으로 개발 및 질병 모델링을 연구하는 연구자 수 있습니다. hPSCs에서 멜라닌 세포의 분화 이전에 발행 된 프로토콜은 차별화 6 주 정도가 필요하며 L-Wnt3a 세포 (12)로부터의 조건화 된 배지로 배양 세포를 포함한다. 이 프로토콜은 처음 운모 등 제시.과 설명 여기에 3 주 색소 세포를 생산하고 모호함과 컨디셔닝 매체와 관련된 불일치를 제거합니다.

멜라닌 세포 아칸소신경 크레스트, 척추 동물에 고유 한 세포의 이주 인구에서 파생 된 전자. 신경 크레스트 낭배 동안 정의 신경 및 비 신경 외배엽 간의 접경 신경 판의 가장자리 세포 집단을 나타내고있다. neurulation 동안, 신경 조직은 신경 튜브 13, 14의 결과 지느러미 중간 선에서 수렴 신경 주름을 형성 신경 판에서 진화.

신경 능선 세포는 척색 맞은 편에 신경 튜브의 지붕 판에서 등장하고 분화 된 세포의 다양한 인구 증가를 제공 멀리 이주하기 전에 중간 엽 전이에 상피를 받아야. 크레스트 세포의 운명은 배아 체 축을 따라 지붕 판의 해부학 적 위치에 의해 부분적으로 정의된다. 신경 능선 세포 유도체 모두 중배엽 계통의 특성 (평활근 세포, 골아 세포, 지방 세포, 연골 세포) 및 외배엽 세포를 포함한다 (멜라닌 세포, 슈반 CELL 학생, 뉴런) 14. 신경 크레스트 줄기 세포는 전사 인자 SOX10을 상향 조절 및 P75 및 HNK1에 대한 항체로 정렬 형광 활성화 세포에 의해 분리 될 수있다.

멜라닌 세포가 멜라닌 단계를 통과 6,21 MITF은 멜라닌 세포 개발의 마스터 레귤레이터 및 전사 인자가 멜라닌 세포 개발의 많은 부분을 제어해야하는 KIT와 MITF (소안 구증 관련 전사 인자)를 상향 조절 될 운명 신경 능선 세포 22- 24. 인간 melanoblasts는 머리 팽창 또는 표피에서 각질 형성 세포에 의해 둘러싸여 성숙, 멜라닌 색소에 대한 전구체로서 기능 할 (색소 형성 단위) 중있는 표피의 기저층에 이동한다. 착색 멜라닌 세포에 melanoblasts의 분화와 성숙은 머리 전구의 식민지와 표현 멜라닌 생성 경로 (TYRP1, TYR, OCA2와 함께 수반 발생PMEL) 25, 26.

환자에서 인간의 멜라닌 세포와 melanoblasts을 분리하는 것은 비용이 어렵고 수량에 제한입니다. 이 프로토콜은 셀 정렬없이 잘 정의 된, 신속하고, 재생 가능한 확장 성, 저렴한 방법으로 멜라닌 세포 또는 멜라닌 세포 전구체에 hPSCs을 (유도 또는 배아) 구별하기 위해 연구자 수 있습니다. 프로토콜은 색소 질환 환자 iPSCs 차별화 때 질병 특정한 결함을 식별하는 데 이전에 사용 하였다.

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프로토콜

참고 : 여기에 설명 된 멜라닌 세포 프로토콜은 처음 운모 등의 알에 의해 입증되었다.

1. 문화 매체의 제조, 코팅 요리와 hPSCs의 유지 보수

  1. 중간 준비
    주 : 저장소를 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 모든 매체. 살균에 대한 모든 매체를 필터링합니다.
    1. DMEM / 10 % FBS를 준비합니다. 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ml의 펜 / 연쇄상 구균, 5 ml의 L-글루타민을 섞는다. 살균 필터.
    2. hESC의 매체를 준비합니다. 800 ㎖의 DMEM / F12, 200㎖의 KSR, 5 ㎖ L 글루타민, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액, β 머 캅토 에탄올 1 ㎖, 5 ㎖의 펜 / 스트렙토 섞는다. 10 NG / ㎖의 FGF-2 추가 필터링 후.
    3. KSR-차별화 매체를 준비 : 820 ml의 마네 DMEM, 150 ml의 KSR, 10 ml의 L 글루타민, 10 ml의 펜 / 연쇄상 구균, 10 ml의 MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ml의 β-머 캅토 에탄올을 혼합. 살균 필터.
    4. N2-차별화 매체를 준비합니다. 12g DMEM / F12 분말 난을 녹여n은 980 ml의 DH 2 O. 1.55 g 포도당, 2g의 중탄산 나트륨 100 mg의 아포 인간 트랜스페린을 추가합니다. 2 ml의 DH 2 O 25 mg의 인간 인슐린와 40 ㎕의 1 N NaOH를 혼합; 용해되면, 매체에 혼합물을 추가합니다. 100 ㎕의 퓨 트레 신 염산염, 60 μL 셀렌, 100 ㎕의 프로게스테론을 추가합니다. 필터링하기 전에 DH 2 O와 1리터에 최종 볼륨을 가져와.
    5. 전체 멜라닌 세포 매체를 준비합니다. 50 %로 Neurobasal 배지, 30 % 낮은 글루코스 DMEM, 20 %의 결합 MCDB201. 이 추가하려면 : 0.8 % ITS +, 250 nM의 L- 글루타민, 100 μM 아스 코르 산 (L-AA), 50 NG / ㎖ 콜레라 독소, 50 NG / ㎖ SCF, 0.05 μM 덱사메타손, 100 nm의 EDN3, 4 NG / ㎖ FGF2 . 2 % B27 보충, 25 NG / ㎖ BMP4, 3 μM의 CHIR99021, 500 μM의 캠프 : 살균 필터는 남아있는 시약을 추가합니다.
  2. 문화 요리의 코팅
    1. 같은 마트 리겔로 젤라틴 단백질을 사용하여 코팅 수행합니다. 1 ml의 부분으로 개방, 나누어지는 및 동결 마트 리겔에 반복적 인 동결 융해 C를 피하기 위해ycles. 해동 및 19 ml의 DMEM / F12와 함께 1 ml의 냉동 나누어 다시는 일시 중지합니다. 10cm 접시 위에 접시 5 ml의. 실온에서 1 시간 동안 요리를 품어. 즉시 세포를 도금하기 전에 젤라틴 단백질을 기음과 DMEM / F12 씻어.
    2. 폴리-L ornithin 브롬화 수소 산염 / 마우스 라미닌-I / 피브로넥틴 (PO / 램 / FN)를 사용하여 코팅을 실시하고 있습니다. PBS가 포함 된 코트 요리 15 μg의 / ㎖ 폴리-L ornithin 브롬화 수소 산염. 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 O / N을 품어. 용액을 흡인 및 1 μg의 PBS / ㎖ 마우스 라미닌 2 μg의 I / ㎖의 피브로넥틴을 함유하는 코팅 전에 PBS로 3 회 플레이트를 세척한다. 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 요리 O / N을 품어.
      1. 전에 세포를 도금에 솔루션을 기음과 플레이트 조직 문화 후드에 뚜껑없이 완전히 건조 할 수 있습니다. 판은 약 10 ~ 15 분 동안 건조하도록 허용합니다.
        참고 : 결정 구조가 눈에 의해 표면에 나타날 때 요리 건조하고 세포 도금 준비가되어 있습니다. 작은지면ES는 PBS만큼 액체가 증발하지 않기 때문에, 2 주 동안 인큐베이터에서 LAM / FN 함유하여 유지할 수있다. 판은 몇 시간 동안 실온에서 건조하게 유지 될 수있다.
  3. hPSCs의 유지 보수
    참고 : hPSCs는 hESC의 매체에서 0.1 % 젤라틴 및 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 유지된다. 셀마다 6~8일 분할한다.
    1. 코트 5 분 동안 실온에서 PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 10cm 접시.
    2. 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 냉동 MEFs에 해동.
    3. 젤라틴을 기음과 세포를 접시. DMEM / 10 % FBS에서 ~ 50,000 세포 / ㎠의 밀도로 플레이트 MEFs에. 이전 hPSCs를 추가로 37 ° CO / N에서 MEFs에 품어.
    4. 준비 MEF 플레이트에서 DMEM / 10 % FBS를 대기음, PBS로 접시를 씻어 hPSCs 10 ml의 hESC의 매체를 추가합니다. 유로 (1)의 비율로 hPSCs : 이전에 계대 밀도에 따라 5/10.
      참고 : hPSCs가 해동 또는 단일 세포로 계대되는 경우, SUP제 1 통로까지 10 μM Y-27632 디 하이드로 클로라이드 (ROCKi)와 영양 보충제.
    5. ml의 10 신선한 hESC의 중간 매일 세포를 공급.
    6. 분화는 분화 된 세포, 불규칙한 경계, 또는 투명 센터 (28)를 포함 할 나타나는 만능 식민지를 제거 시작하기 전에. 기계적시키다 및 해부 현미경으로 층류 후드 피펫 불규칙 콜로니 대기음.

차별화를위한 hPSCs 2. 도금

참고 : 차별화 조건이 10cm 요리에 대해 설명합니다.

  1. 단계 1.3.1에 ​​설명 된대로 분화를 시작하기 전에 10cm 마트 리겔 요리를 준비합니다.
  2. 차별화를위한 도금 hPSCs는 통과를 위해 준비 밀도 (~ 80 %의 합류), hESC의 매체를 대기음 PBS로 세척하고 세포를 0.05 % 트립신 EDTA 3 ㎖를 추가로 hPSCs의 접시로 시작합니다.
  3. 적극적으로 접시 수평 보링을 흔들MEFs에 단일 세포로 들어 올립니다 때까지 y를 2 분 동안 현미경으로 시각화있다. hPSC 식민지는 식민지로 부착 된 상태를 유지해야합니다.
  4. MEFs에이 올린 후 트립신을 대기음하지만 hPSCs의 콜로니를 분리하기 전에.
  5. 추가 판에 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함 hESC의 중간 10 ㎖와 식민지 이상까지 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 분리.
  6. 2.1 단계에서 제조 된 10cm 접시에서 마트 리겔 솔루션을 기음과 덩어리를 제거하는 DMEM / F12 씻어. 마트 리겔 플레이트 상에 2 비율 : 1의 hPSCs 플레이트. 10ml의 최대 10 μM Y-27632 디 하이드로 클로라이드를 포함 hESC의 매체를 추가합니다. 37 CO / N에 품어.
    참고 :이 도금 / ㎠에서 약 10 만 셀을 초래한다.

신경 분화 3. 유도

참고 : hPSCs 80 %의 합류 때 분화 (0 일) 시작되어야한다. 세포 hESC의 매체로 매일 공급 될 수있다분화를 개시 할 때까지 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함.

  1. 제 0 일과 1 일에, 100 나노 LDN193189 10 μM SB431542 함유 KSR 분화 배지 10 mL로 세포를 공급.
  2. 제 2 일에, 100 나노 LDN193189 10 μM SB431542 3 μM의 CHIR99021 함유 KSR 분화 배지 10 mL로 세포를 공급.
  3. 제 3 일에 10 μM SB431542 3 μM의 CHIR99021 함유 KSR 분화 배지 10 mL로 세포를 공급.
  4. 4 일 및 5 피드 15 75 % KSR 분화 배지 ㎖의 3 μM의 CHIR99021 함유 25 % N2 분화 배지 세포.
    참고 : 부동 세포의 관점에서 세포 죽음의 많은 양을보고 놀라지 마십시오. 이는 정상적인 예상 할 수 있습니다.
  5. 일 6 7 15 50 % 공급 KSR 분화 배지 ㎖의 모두 3 μM C​​HIR99021 25 NG / ㎖ BMP4, 100 nM의 EDN3 함유 50 % N2 분화 배지 세포.
  6. 일 8 일및 공급 구 (20)의 25 % KSR 분화 배지 ㎖의 모두 3 μM C​​HIR99021 25 NG / ㎖ BMP4, 100 nM의 EDN3 함유 75 % N2 분화 배지 세포.
  7. 하루 11 세포의 재 도금 1.2.2에 표시된 일 9, 10 일 PO / 램 / FN 요리를 준비합니다.
  8. 3 μM C​​HIR99021 25 NG / ㎖ BMP4, 100 nM의 EDN3 함유 N2 분화 배지 20 ㎖와 10 일째 공급 세포.

NC 사양에 대한 방울 4. Replating

  1. 하루 11 대기음 램에 / 완전히 준비 PO / LAM / FN 판과 건조로부터 FN.
  2. 하루 11 세포에서 매체를 제거 PBS로 세척 및 10cm 접시 당 Accutase로 4 ml의 세포 분리 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 25 분 동안 품어.
  3. 접시에 전체 멜라닌 세포 매체의 5 ML을 추가하고 모든 세포가 판을 해제 할 때까지 10 ml를 피펫으로 수동으로 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 재현 탁. 15 ML 튜브에 현탁액을 전송합니다.
  4. 스핀다운 200 XG에서 5 분 동안 세포와 멜라노 전체 배지 용액에 2 × 106 세포에서 세포를 재현 탁. 혈구 또는 이에 상응하는 기술에 트리 판 블루 배제를 사용하여 세포를 계산합니다.
  5. 건조 PO / 램 / FN 10cm 요리 상 (그들을 건드리지 않고) 서로 가까이 판 (10) μL 방울. 플레이트가 충분히 건조되지 않은 경우, 물방울이 잘 에지를 정의 실행하지 않은 것이다.
    참고 :이 확장을위한 요리 내 공간을 유지하면서 세포를 replating 때 중요한 세포에 대한 고밀도 지역의 환경을 만듭니다.
  6. 천천히 (첨부 된 세포를 방해하지) 전체 멜라닌 세포 배지 10 ㎖를 추가, 방울 세포가 부착 할 수 있도록 10 ~ 20 분 동안 실온에서 방치한다. 인큐베이터에 접시를 이동합니다.

5. 멜라닌 세포 전구 세포를 확장

  1. 모든 2~3일 전체 멜라닌 세포 배지로 먹이를 계속합니다.
    참고 : 색소 침착이 w 볼 수 있도록 시작해야첫 주 말까지 세포의 클러스터를 ithin와 두 번째 주에 의해 명확하게된다. 이들 초기의 작은, 어두운 클러스터를 식별하기 위해 종이로 흰색 배경 위에 접시를 볼 수 있습니다. 전체 판 (그림 2B 참조) 균일하게 착색 될 때까지 세포는 시간이 지남에 따라 점차적으로 착색 될 것입니다.
  2. ~ 1의 비율로 한번에 주 통로 셀 6 (액적으로서 도금이 단계에서 더 이상 필요하지 않다). 세포를 떼어 놓다 및 전체 멜라닌 세포 배지에서 다시 도금하기 전에 일반로 Neurobasal 매체로 두 번 씻어 Accutase를 사용합니다. PO / LAM / FN 접시에 세포를 유지한다.
    참고 : 우리는 전체 멜라닌 세포 매체는 유지하고 hESC의 및 IPSC 파생 된 멜라닌 세포 확장을위한 가장 적합한 것으로 나타났습니다. 그러나, 세포는 시판 M254 배지에서 배양 간략 수 있지만 간단 미디어 죽어 플레이트를 올려 셀의 위험을 증가시킨다.

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결과

이 프로토콜은 체외 피더없이, 비용 효율적이고 재현 방식 hPSCs에서 완전히 착색 된, 성숙한 멜라닌 세포를 유도하는 방법을 제공한다. hPSC 유래 멜라닌 세포에 대해 이전에 확립 팡 등. 프로토콜 달리 명시된 프로토콜 조정 배지를 필요 시간 요건을 감소하지 않는다. 팡 등. 프로토콜은 WNT3A 생산 쥐의 세포 라인에서 조절 된 매체를 사용하고 색소 침착 6,12를 시각화 6 주까지했다. 바이어스 멜라닌 세포의 운명을 향해 신경 능선 줄기 세포 (melanoblasts)에, 우리는 회보 서 (Criminal) 초기 펄스 후 BMP와 TGFβ 억제제 (각각 LDN 및 SB)를 제거하고 이후의 Wnt 활성화를 유지하면서 하루 6시에 신호 외생 BMP4 및 EDN3를 소개합니다 6. 그 결과 melanoblasts은 물론 SOX10의 EXPR의 유지 보수로, KIT와 MITF의 발현...

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토론

hPSCs에서 멜라닌의 성공적인 분화 다음 방법이 고려되어야한다. 무엇보다도, 항상 무균 배양 조건에서 동작하는 것이 필수적이다. 또한,이 다 능성 완전히 분화 hPSCs 시작하는 것이 중요하다; 시작 인구가 분화 세포를 포함하는 경우 수익률은 변함없이 오염 물질이 멜라닌 세포 지향 할 수 없으며 더욱 제대로 분화 세포를 방해 할 수 있으므로 삭제합니다.

세포가 만능 줄기 세포의 유지 보수를 위해 잘 확립 된 규칙을 따라야하는데주의를 기울여야 남아 보장하기 위해; 먹이 통로 정기적으로 계대 전에 분화 세포를 제거하는 문화를 신랑. 분화 젤라틴 단백질에 계대 때 접시 적절히 분화 동안 리프트 오프에서 셀을 방지하기 위해 도포하는 것이 중요하다.

멜라닌은 다르다entiation 80 %의 세포 밀도 주위 개시한다; 너무 낮은 밀도 부정적인 분화에 영향을주는 반면 너무 높은 밀도는 증가 된 세포의 죽음으로 이어질 것입니다. 계대 ...

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공개 사항

저자는 공개 충돌하는 이익을 더이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 조안나 M. NICOLAY 재단 흑색 종 연구를위한 친교에 의해 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 F31에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다. 이 작품은 더 NYSTEM 및 트라이 기관 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)에서 보조금을 통해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo human transferrinSigmaT1147
Ascorbic Acid (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (B27 Supplement)Invitrogen17504044
β-MercaptoethanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D 시스템314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
콜레라 독소SigmaC805250 mg/ml
cAMP (cyclicAMP)SigmaD0627100 mM
덱사메타손SigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - Dulbecco의 변형 독수리 매체Gibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Dulbecco의 변형 독수리 매체: 영양 혼합물 F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 분말Invitrogen12500-096
EDN3 (Endothelin-3, human)American Peptide Company88-5-10B100 μ M
피브로넥틴BD 생명과학356008200 μ g/ml
젤라틴 (Mg/Ca가 없는 PBS)은
Human insulinSigmaI2643
ITS+ Universal Culture Supplement Premix에서BD Biosciences354352
KSR (녹아웃 세럼 대체물)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-글루타민Gibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
저혈당 DMEMInvitrogen11885-084
Matrigel matrixBD Biosciences354234DMEM/F12 MCDB201
MediumSigmaM6770
MEM 최소 필수 아미노산 용액에Gibco-Life Technologies11140-080
마우스 배아 섬유아세포(700만 세포/바이알)GlobalStemGSC-8105M
마우스 라미닌-IR& D Systems3400-010-011 mg/ml
Neurobasal mediumInvitrogen21103049
Penicilin/StreptomycinGibco-Life Technologies15140-12210,000 U/ml
Poly-L Omithin hydrobromideSigmaP365515 mg/ml 
프로게스테론시그마P8783100ml 100% 에탄올 중 0.032g
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
FGF2(재조합 인간 FGF 기본)R& D 시스템233-FB-001MG/CF10mg/ml
SB431542Tocris-R& D 시스템181410 mM
셀레나이트시그마S5261
소듐 바이카보네이시그마S5761
SCF (줄기세포 인자, 재조합 인간) (주)페프로텍300-0750 &뮤; g/ml
TYRP1 (G-17) 항체Santa Cruz104431:200
TYRP2 항체Abcam740731:200
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dihydrochlorideTocris-R& D 시스템125410 mM
PBS Glucose Sigma G7021 0.1%를 함유하고 있습니다. 1:20 용해 트

참고문헌

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