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방법 논문

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

11K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

2016년 3월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

이 논문에서

요약

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

초록

비강 상피 세포(NEC)는 공기 오염 물질에 반응하는 기도의 일부이며 호흡기 바이러스에 감염된 첫 번째 세포입니다. 또한 선천성 면역 반응과 면역 및 기도 기질 세포와의 상호 작용을 통해 많은 기도 질환에 관여합니다. NEC는 임상 방문 중 접근성이 높기 때문에 소아 연구에서 특히 관심이 많습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 여러 세포 유형에서 생성되었으며 인간 발달 및 질병을 모델링하고 재생 의학에서 잠재적인 응용 프로그램을 위한 강력한 도구입니다. 이것은 연구 목적으로 소아 참가자로부터 파생된 NEC에서 iPSC를 성공적으로 생성하기 위한 방법을 제시하는 최초의 프로토콜입니다. 어린이로부터 비강 상피 세포를 얻는 방법, 이러한 샘플에서 1차 NEC 배양을 생성하는 방법, 1차 NEC를 잘 특성화된 iPSC로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 코 점막 샘플은 어린이의 대기 오염의 영향과 관련된 역학 연구에 유용하며 기도 질환을 연구하는 데 중요한 도구를 제공합니다. 1차 비강 세포와 이로부터 유래한 iPSC는 천식 및 COPD 연구를 포함한 다양한 기도 상피 생물학 분야에서 환자별 연구를 위한 무제한의 자료를 제공하는 도구가 될 수 있습니다.

서론

인간의 샘플 (hiPSCs)에서 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 연구의 빠른 개발 기술입니다. 그들은 훨씬 적은 윤리적, 도덕적 결점의 1, 2와 배아 줄기 세포 (hESC의) 연구에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 hESCs는 3-5 성적으로 동일하지 않지만, hiPSCs 개발 및 질환 표현형을 모델링하는 독특한 방법을 제공하고이 질환 상태와 관련 5-8 조직 유래 될 수있다. 생성 hiPSCs 새로운 방법을 끊임없이 이식에 적합한 GMP 품질 iPSCs을 제조하고, 또한 리 프로그래밍 프로세스 6,9-11의 적시성 및 효율성을 증가시키는 방법으로, 시작하는 최적의 세포 유형을 식별하기 위해 탐색되고있다.

기도 상피 세포 알레르기 성 염증 (12)의 개발에 중요하며, 상피 immun와 상호 작용을 통해 알레르기 반응과기도 개형의 중요한 드라이버 인전자와 기질 세포. 기도 상피 기원과 천식과 같은 폐 질환의 지속성에 필수적인 역할을한다. 그러나, 낮은기도 상피 세포, 특히 건강 관리 환자와 어린이, 임상에서 얻을하기가 어렵습니다. 대기 오염 물질과 알레르기 항원에 대한 반응을 연구, 특히 여러 연구의 데이터는, 코 점막의 상피 세포가 낮은기도 상피 세포 13-20에 대한 유효하고 실질적인 프록시 있다는 전제를 지원합니다. 코 점막은 90 % 이상 섬모기도 상피 세포로 구성하고 다른 세포 / 조직 샘플링 기술보다 덜 침습적이고 같이이 코 점막 상피 세포 (NECs)를 샘플링하는 것은 쉽게, 연령 네다섯 한 어린 아이에서 수행 될 수있다 감염 20-23과 같은 부작용의 위험을 최소화과 관련. 그것은 긴 불필요한, ​​종종 고통스러운 기관지의 procedu없이 건강하고 병에 걸린 어린이 모두를 샘플링 할 수있는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다진정 작용을 필요로 입술. 이전의 연구는 천식 심각도 습관병 아형 비점막뿐만 아니라 천식 어린이로부터 취한 기관지 세포 샘플 모두에서 구별 될 수 있음을 발견하고, 두 조직 유형 간의 유전자 발현은 비 편재 유전자 (22)의 약 90 %에서 유사 24. iPSCs의 소스로, NECs 다른 자주 사용되는 세포 유형을 통해 이점을 제공합니다. 섬유 아세포는 종종 IPSC 생성을 위해 사용되지만, 이들 세포를 쉽게 피부 생검에서 배양 될 수 있지만,이 프로세스는 일반적으로 국소 마취, 절개 봉합을 필요로하고, 감염 될 위험과 관련된다. 따라서, 생검이 유형의 환자의 동의를 얻는 것은 25 어려울 수 있습니다. 섬유 아세포에 대한 한 대안은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 그러나, 소아에서 IPSC 생성을위한 충분한 혈액을 얻는 것이 어려울 수있다. 또한, 다운 스트림 액세스 포인트의 제한이있다섬유 아세포 및 혈액 세포 유래 iPSCs, 특정 세포 유형 5,26 특히 분화 능력에 대한 plications. 따라서, 상대의 접근성 및 컬렉션 다음 부작용의 낮은 위험을 주어 NECs 소아 인구에서 IPSC 생성을위한 이상적인 셀 소스를 나타낸다.

iPSCs 소설 질병 모델을 인간 개발 연구 생성 플랫폼으로 최근에 많은 주목을 받아 맞춤 치료를위한 세포의 잠재적 인 소스로했다. 이 기술의 잠재력이 실현 될 수 있기 전에, 프로그래밍 과정의 분자 토대가 설명 될 필요가 있지만, 지금이 프로토콜 내에서 설명 된 절차를기도 노출에 집중 조사 연구 해명 것임은 물론위한 플랫폼을 제공하는 iPSCs 관련된 개인화 된 의약품의 효과를 연구.

여러 연구소의 공동 작업은 generatio하게되었다코 점막을 샘플링뿐만 아니라, NECs를 배양하고, iPSCs (23)이 세포를 재 프로그램뿐만 아니라에 대한 성공적인 기술의 N. 이 문서에서는 최적의 샘플링, 배양 및 프로그래밍 환경을위한 프로토콜의 개요를 제공합니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 기관 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 코 점막을 샘플링

참고 : 호흡기 바이러스 감염의 흔적이없는 피사체에서 샘플을 얻습니다.

  1. 참가자 방문하기 전에 15 ML 원뿔 신선한를 준비하고 2 ml의 BEGM (기관지 상피 세포 성장 배지) 플러스 20 ㎕를 멸균 펜 / 패 혈성 / Fungizone (P / S / F) (0.01 %)를 추가합니다.
  2. 열기 세포학 단지 샘플을 복용하기 전에 브러시 및 살균 브러시를 유지해야하고, 코 표면 이외의 모든 표면을 만지지 마십시오.
  3. 가만히 앉아 천장을 향해 머리를 기울 참가자를 요청합니다. 작은이 이상 불안 아이들은 그들의 손에 앉아 및 / 또는 멀리 브러시를 때리는 등 모욕적 피하기 위해 누워.
  4. 통로가 좁아 (작은 블랙홀처럼 보이는) 코의 뒤쪽에 브러시를 목표로하고 있습니다. 아래로 브러시를 밀어 브러시가 nostri에서 제거 될 때 손목을 비틀엘.
  5. 원뿔에서 브러시를 놓고 BEGM에 잠수함. 여분의 브러쉬를 잘라 튜브에 뚜껑을 교체합니다. VORTEX하지 않습니다.
    주 : 참가자 용의 경우와 동일한 방식으로했지만 제 콧 구멍에 제 브러쉬 얻었다. 양쪽 콧 구멍의 칫솔질을 얻는 것은 샘플링이 성공하는 높은 가능성이 발생합니다. 같은 콧 구멍을 샘플링 출혈이 발생할 수 가능성 샘플을 향상되지 않습니다.
  6. 따뜻한 물로 비이커를 사용하여 운송 중 가능한 37 ° C에 가까운 샘플을 보관하십시오.

2. 세포 수와 Cytospin

  1. 부드럽게 BEGM에 브러시를 교반하고 hemacytometer를 사용하여 세포 수의 샘플 10 μL를 취할. 라이브 / 죽은 얼룩의 10 μl를 추가 만 현미경으로 세포를 살고 계산합니다.
  2. 샘플의 50 μl를 타고 1X PBS 200 μL에 희석. 2 분 동안 300 rpm에서 유리 슬라이드와 스핀에 부착 cytospin 깔때기에 추가합니다. 따라와 건조 O / N 및 얼룩 슬라이드를 밀어 보자g 제조업체의 지침. 바람직하게는 어둠 속에서, O / N을 건조하도록 허용합니다.
  3. 헤마 3 얼룩 얼룩 슬라이드
    1. 각 솔루션 (; 헤마 3 솔루션 I, 핑크, 헤마 정착액, 밝은 파란색과 헤마 3 솔루션 II, 푸른 깊이)로 이동시켜 염색 접시에; 사용하지 않을 때는 커버하십시오. 슬라이드 염색 보트에 슬라이드를 삽입
    2. 딥 슬라이드는 지속적으로 30 초 동안 정착에 다음 과잉 배출 할 수 있습니다. 딥 내가 30 초 동안, 다음 과잉 배출 할 수 있도록 솔루션에 지속적으로 슬라이드. 딥은 과잉 배출 할 수 있도록 30 초 동안 지속적으로 솔루션 II에 슬라이드
    3. 물이 맑은 실행까지 탈 이온수로 씻어. 어둠 속에서 바람직하게는, O / N을 건조하도록 허용
  4. 상피 세포의 비율을 결정, 현미경 카운트 세포에서 슬라이드 봐. 샘플링이 좋은 경우 90 % 이상이어야합니다.

3. 시드 셀

주 : 적절한 인증 조직 문화의 모든 세포 배양 과정을 수행후드 무균 기술을 사용.

  1. 소 피부 콜라겐 (BDC)와 코트 판, 유형 1. 49.5 ㎖의 1X PBS에 희석 3 ㎎ / ㎖ BDC의 0.5 ML을 추가합니다. 몇 판을 사용할 경우 더 적은을 준비합니다. 코트 2 시간 동안 37 ° C에서 T25의 2 ml의 BDC와 플라스크 및 멸균 후드 O에 품어 / N 또는 필요한 경우.
  2. 배양 후, 남아있는 액체를 대기음. 멸균 후드에서 30 분 동안 자외선에 플라스크를 노출. 하지만 1 개월까지 4 °에서 C에 대한 저장소 플라스크, 세포를 파종하기 전에 C를 RT로 가져 또는 37 °.
  3. 시드 할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 BEGM에 브러시와 세포를 유지합니다. 조심스럽게 휙 원뿔 내부 브러시,하지만 소용돌이하지 않습니다.
    1. 플레이트 T25 플라스크에 7 × 10 5 세포. 이하이 있으면 작은 컨테이너 6 웰 플레이트 중 하나와 같은 잘 사용한다. 이 크기의 플레이트는 약 3 × 10 5 세포를 필요로한다.
      참고 :이 많은 세포가없는 경우, 계속하지 않는 것이 좋습니다.
  4. 멸균 후드 아래, 튜브 및 GE에서 브러시을ntly 코팅이 긁히지 않도록주의하면서, 코팅 된 플라스크의 표면에 브러시를 회전 할 수 있습니다. 적절한 생물 학적 용기에 브러시를 폐기하십시오.
  5. 천천히 원뿔에서 그리고 T25 플라스크에 BEGM에 남아있는 세포를 피펫. 현미경으로 세포를 관찰한다. 부유 세포의 숫자가 관찰되며이 단계 (도 3a)에서 허용되는 코 일부 파편이있을 수있다.

4. 세포 배양

  1. 세포를 파종 한 후,이를 중단없이 48 시간 (그림 3)에 안주 할 수 있습니다. 48 시간 후, 천천히 그리고 부드럽게 2 ml의 따뜻한 BEGM 및 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Fungizone (P / S / F) 20 μl를 추가합니다.
    참고 : 미디어의 원래 2 ml에 대기음하지 마십시오.
  2. 파종 후 4 번째 날, 신중하게 모든 액체를 대기음, 신선한 4 ㎖로 교체 BEGM 플러스 1X 펜 / 연쇄상 구균이 (fungizone가 더 이상 필요하지 않습니다) 가온. 이틀 미디어를 변경하고 연결에 대한 세포를 평가, 표준, 성장과 합류. 세포에 도달하면 ~ 80 %의 합류, 일반적으로 2-3 주 내에, 그들은 계대 할 준비가 된 것입니다.
  3. 하나 T25 플라스크 (약 2.5 × 10 6 세포 때 합류) 세 T25 플라스크 또는 1 T75 플라스크에 계대 수 있습니다. 제 1 통로 후, 세포는 약 3 일 합류에게 도달 튼튼하고 건강해야한다.

5.과 Passaging 세포

  1. 부드럽게 접시에서 미디어를 대기음. 약 4 분 동안 인큐베이터에있는 접시와 장소 T25 플라스크 당 1 ml의 0.05 % 트립신 솔루션을 추가하거나 세포를 플레이트에서 분리 될 때까지. 세포마다 2 분의 분리의 수준을 확인하고 이상 10 분에 트립신을 두지 마십시오.
  2. 효소를 중화 5 ㎖의 트립신 중화 솔루션 (TNS), 또는 혈청 함유 미디어를 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 플라스크 장소에서 모든 액체 및 세포를 제거합니다.
  3. 5 분 동안 200 XG (감속 가속도 0 0)에서 원심 분리 세포 펠렛을 얻었다. 기음 superna새로운 플라스크에 필요한 볼륨 S BEGM에서 + P / 중대장과에 resuspend 세포 (T75 플라스크에 대한 T25 플라스크 4 ml의 10 ㎖)
  4. (2.1) 전술 한 바와 같이 라이브 / 죽은 얼룩 세포 수를 수행합니다. 코팅 된 플라스크에 BEGM 세포의 적절한 금액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 상기 상세한 유지 또는 용액 당 0.5 × 106 세포의 농도로 배지 (70 % BEGM, 20 % FBS와 10 % DMSO)를 동결 cryopreserve.

iPSCs 6. 재 프로그래밍

참고 : iPSCs를 생성하기 전에 생성과 인간 iPSCs의 사용을 규제하는 모든 기관 규정 준수를 보장합니다. 배양 배지는 통상적으로 항생제를 함유하지 않는 멸균 기술은 IPSC 배양에 특히 중요하다. NECs 건강 표시하고 견고 성공적인 프로그래밍에 대한 증식있는 것이 중요합니다.

  1. 판 6 잘 조직 배양 플레이트의 웰 당 5 × 10 5 NECs. 24 시간 후, 폴리 브렌 추가BEGM에 매체 인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 발현 렌티 바이러스 입자를 첨가하여 8 μg의 / ㎖ 및 형질 도입 NECs 최종 농도. 5 ~ 27의 감염 (MOI)의 다양성을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다.
    1. MOI를 결정하는 것과, 농축 - 렌티 바이러스 스톡의 희석액을 제조하고 이들로 희석 HT1080 세포를 형질 도입. HT1080 세포에서 발현 dTomato 제 명백하게 검출 후 dTomato 양성 세포 / 희석 각 셀의 작은 덩어​​리의 수를 기록하여 "형질 도입 단위 용액 /"의 수를 계산한다.
      참고 : 일반적으로 너무 높은 희석 (모든 dTomato 긍정적이다) 너무 낮은 (없음 또는 양성 세포의 커플)이있을 것이다.
    2. 세포의 분리 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 확인되는 희석에서 득점을 수행합니다. 적절한 희석 인자 단위 / ㎖ 열 변환 수를 보정함으로써 역가를 결정한다. MOI는 수의 비율의 바이러스 입자 (27)의 수를 셀 형질.
      참고 : 각 dTomato 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 하나의 바이러스 입자에서 발생하는 가정한다.
  2. 약 3 시간 후 전달 매체를 제거하고 신선한 BEGM로 교체합니다. 제도적 승인 절차를 사용하여 렌티 바이러스 함유 미디어를 폐기하십시오. 3 일간 인큐베이터에 형질 NECs를 돌려줍니다.
  3. 3 일에, 신선한 BEGM와 미디어를 교체 한 다음 다른 3 일간 배양한다. 기음 미디어는 1X PBS로 세포를 씻어 잘 1 ml를 0.05 % 트립신 솔루션을 추가 보냈다. 트립신과 통로 세포 (섹션 5) 위의 기록으로. 조심스럽게 4 ml의 BEGM + P / S에 뜨는 및에 resuspend 세포를 대기음. 세포를 준비하는 경우 (다음 단계 참조) BDC 코팅 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 계대 또는 MEF 배양에 첨가 될 수있다.
  4. MEF 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 4 일에 () +/- Thiazovivin (SPT를 수행 단계 6.6를 참조)도 6의 2 웰 (1 ㎖ / 잘) 0.1 % 젤라틴 용액을 추가합니다. 다음에하루는 불 활성화 MEFs에 28 병을 해동.
  5. MEF 미디어 (DMEM + 1 배 NEAA + 10 % DFCS) 10 ㎖로 MEFs에 배치합니다. 5 분 200 XG에 스핀 펠렛합니다. MEF 미디어를 Resuspend. 대기음 6 웰 플레이트에서 젤라틴과 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 웰 당 1.87 × 10 5 MEFs에 추가합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, 또는 24 시간의 최소.
  6. BEGM의 양도 2 ㎖를 이전에 코팅 된 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 당 세포를 형질 도입 및 / N을 O를 품어 함유. 다음날 4 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 표준 hESC의 미디어 웰 당 2.5 ㎖로 교체 BEGM. 신선한 hESC의 매체와 세포를 공급 +/- SPT를 매일 10 일 동안
    참고 : NECs (23)에 대한 효율성과 프로그래밍의 반응 속도를 향상시키기 위해 작은 분자 (SB431542, PD0325901 및 Thiazovivin (SPT) 칵테일)의 칵테일을 추가 할 수 있습니다.
  7. 십일 후, SPT없이 hESC의 미디어를 사용하여 매일 먹이를 계속합니다. hESC의 같은 식민지 때까지 매일 문화를 피드(그림 5A, P0 식민지)를 나타납니다. 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체 : 높은 핵으로 추정 iPSCs을 품고 식민지를 확인합니다.
  8. hESC의 같은 형태를 가진 수동 소비세 및 전송 식민지 공급 장치가없는 시스템에서 별도의 선으로 문화와 확​​장을 위해 우물을 분리합니다. 절제 식민지는 이러한 조건에 빠르게 적응해야한다.
    1. 도금 절제 식민지 후이 이산 추정 IPSC 라인은 지금 통로 1 (P1)으로 간주됩니다. 매일 mTeSR1와 피드 문화. 통로 및 표준 절차를 사용하여 IPSC 라인을 확장합니다. P1의 식민지들은 계대되어야하는 크기에 도달하는 것은 일주일에 며칠이 걸릴 수 있습니다.

7. 문화 iPSCs 유지

  1. 피드 및 일일 문화를 평가합니다. 수동 소비세 지역은 멸균 유리 피펫 또는 마이크로 피펫 팁으로 긁어에 의해 명백한 차별화를 전시. 매일 수확 후 미디어를 변경합니다.
  2. 통로 세포 approxima 후tely 4 일마다 : 부드럽게 흡인 미디어, 6 웰 플레이트 (하프 공급 볼륨)의 웰 당 1 ml의 따뜻한 스파 아제 (Dispase) (1 ㎎ / ㎖)을 추가 한 후 약 4 분 동안 37 ° C에서 품어. 식민지의 가장자리는 식민지 주위에 흰색 테두리처럼 보이는, 리프트 시작합니다. 조심스럽게 스파 아제 (Dispase)를 대기음 및 예열 DMEM / F12와 함께 배를 씻는다.
  3. 2 ml의 mTeSR1를 추가하고 판에서 식민지를 들어 올릴 셀 리프터를 사용합니다. 식민지가 작은 클러스터로 분할 될 때까지 부드럽게 세포를 씹다에 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 또는 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다.
    1. 생존 후속 증식 차선 바와 같이, 매우 작은 클러스터 또는 단일 셀의 제조 피. 콜로니를 다시 도금하면, 1 : 4 내지 1 : 6 분할 최적 콜로니 밀도를 유지한다. 부드럽게 판에서 식민지와 미디어를 제거하고 새로운, 마트 리겔 코팅 된 웰에 추가 할 수 있습니다.

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결과

코 전정 불리는 코 초기 부분, 연골 조직 (29)으로 둘러싸인 영역이다. 브러쉬 코 밸브 (소공의 internum 또는 비공 뒷면에서 본 "블랙홀") 이상, 코이 영역을지나 원활하게 진행해야하고, 시료 비갑개 (도 1)로부터 얻어진다. 비강 비갑개은 코 (29)의 표면적을 증가 샘플링 그들에게 최적 위치를 결정 뼈 구조이다. 이 지역은 또한 밀접하게 하부기도의 라이닝과 유사한 환경 노출에 대한 면역 반응 또한 활성화되어 혈관 점막 조직에 의해 줄 지어있다.

올바른 조직을 샘플링 재 프로그램 된 세포가 상피 세포임을 보장합니다. 이것은, 또한 배양 세포를 관찰하여 초기 셀 카운트 및 cytospin 의해 평가 될 수있다. 그만큼cytospin가 한 번, 스핀 다운 건조하고,...

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토론

코 점막 상피 세포 (NECs)는기도 질환 연구를위한 액세스 플랫폼, 그리고 NEC-iPSCs 질병 개발, 치료 및 치료 1,31,32을 탐구하는 흥미로운 수단을 제공합니다. NECs 쉽게 스트레스 또는 잠재적으로 유해한 절차 6,23없이 얻을 수있다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜에 설명 된대로 코 점막의 샘플링은 스트레스를 덜하고 더 나은 어린이를위한 채혈보다 인식이 나타납니다. 따라서,이 방법은기도 질환 연구에 특히 소아 환자 집단에서 유용하고 관련이있을 수 있습니다. NECs의 또 다른 장점은 문화에 한 번, 상피 세포는 미디어와 문화 조건으로 선택하고 균일하게된다는 것이다. 이는 혈액 세포로 복합 조직을 사용하는 것보다 유리하고 쉽게 transcriptomic 및 후생 유전 학적 방법을 사용하여 IPSC 라인 얻어진 세포 기원의 영향을 평가한다.

언제비점막 샘플링, 대부분의 상피 세포가 검색되도록 현미경 (도 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 다 능성 줄기 세포 시설 신시내티 아동 병원에서 공 촛점 이미징 코어를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) 및 2U19AI70235 (GKKH)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15ml 원뿔Fisher Scientific14-959-49D프로토콜 단계 1.1.
BEGMLonzaCC-3170프로토콜 1.1단계.
Penn/Strep/FungicideLife Technologies15240-062프로토콜 단계 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122프로토콜 단계 4.a.
cytosoft cytology brushFisher Scientific22-263-357프로토콜 단계 1.2.
trypan 블루피셔 사이언티픽MT-25-900-CI프로토콜 단계 2.1.
혈구계Fisher Scientific02-671-54프로토콜 단계 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4프로토콜 2.2단계.
세포학 깔때기 클립Fisher Scientific10-357프로토콜 단계 2.2.
사이토스핀 깔때기Fisher Scientific23-640-320프로토콜 단계 2.2.
사이토스핀 4Fisher ScientificA78300003프로토콜 2.2단계.
블랭크 슬라이드Fisher ScientificS95933프로토콜 단계 2.2.
hema 3 stain kitFisher Scientific22-122-911프로토콜 단계 2.2.
소 진피 콜라겐, 유형 1생명 기술A1064401프로토콜 단계 3.2.
T25 플라스크Fisher Scientific08-772-45프로토콜 단계 3.3.
TrypsinLonzaCC-5012프로토콜 5.2 단계.
트립신 중화 용액LonzaCC-5002프로토콜 5.2단계.
소 태아 혈청 (FBS), 65 °에서 열 살균; C 30분 동안Sigma-AldrichF2442프로토콜 5.5단계.
디메틸 설폭사이드 Hybri-Max™, 멸균 여과, BioReagent, 하이브리도마에 적합, ≥ 99.7%Sigma-AldrichD2650프로토콜 5.5단계.
폴리시스톤 렌티바이러스*예: MilliporeSCR511프로토콜 단계 6.4. 
reprogramming vector의 상업적 소스가 나열되어 있습니다. 당사는 Voelkel 등(PMID: 20385817)이 보고한 4-in-1 플라스미드를 일상적으로 사용하여 사내에서 VSV-G pseudotyped polycistronic 재프로그래밍 렌티바이러스를 생성합니다. 이 플라스미드는  
polybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220프로토콜 단계 6.4.
방사선 조사된 CF1 MEFsGlobalStem GSC-6301G프로토콜 6.4단계.
hESC media프로토콜 단계 6.11에 포함된 레시피를 참조하십시오
SB431542Stemgent04-0010프로토콜 단계 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006프로토콜 단계 6.11.
티아조비빈 형태소04-0017프로토콜 6.11단계.
hESC 인증 MatrigelBD Biosciences354277프로토콜 Step 6.13.
코닝 플레이트, 6웰피셔 사이언티픽08-772-1B프로토콜 단계 6.13.
mTeSR1StemCell5850프로토콜 6.13단계.
250ml 일회용 필터 플라스크(0.22 &마이크로; m)피셔SCGP-U02-RE 
StemCell7923프로토콜 배포 7.3단계.
DMEM/F12Life Technologies11320-033프로토콜 7.3단계.
세포 리프터Fisher Scientific08-100-240프로토콜 7.4단계.
hESC Media**프로토콜 Step 6.11.
성분을 혼합한 후 필터 멸균해야 합니다. 미디어는 4 °로 유지할 수 있습니다. C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 매체를 데울 때 37°C로 두지 마십시오. C 15분 이상
DMEM-F12 50/50 미디어Invitrogen  11330-032최종 농축
KO 교체 혈청 (KO-SR)Invitrogen10828-0280.2
200 mM L-glutamineInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoethanolInvitrogen21985-0230.1 mM
100x 비필수 아미노산Invitrogen11140-0501x
2 µ g/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml
형 프로토콜 .

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