방법 논문

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

DOI:

10.3791/53818

⸱

2016년 3월 28일

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

이 논문에서

요약

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여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

초록

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Photostimulation은 뛰어난 공간 및 시간 해상도로 생물학적 사건을 제어하는 비침습적 방법입니다. 본래 환경에서 발현되는 내인성 단백질을 광 조절하기 위한 새로운 방법이 요구되고 있습니다. 여기에서는 유전적으로 암호화된 비천연 아미노산(Uaa)을 사용하여 뉴런에서 직접 뉴런 단백질의 기능을 광학적으로 제어하는 접근 방식을 제시합니다. 호박색 코돈을 억제하기 위해 직교 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 사용함으로써, 광반응성 Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine(Cmn)은 내부로 정류하는 칼륨 채널인 신경 단백질 Kir2.1의 공극에 특이적으로 통합됩니다. 부피가 큰 Cmn은 채널 기공을 물리적으로 차단하여 Kir2.1을 비전도성으로 만듭니다. 광 조명은 Cmn을 더 작은 천연 아미노산 Cys로 즉시 변환하여 Kir2.1 채널 기능을 활성화합니다. 우리는 쥐의 해마 1차 뉴런에서 이러한 photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) 채널을 발현하고, PIRK의 광 활성화가 활성화된 Kir2.1 채널을 통한 K+ 전류의 유출로 인해 뉴런 발사를 중단한다는 것을 입증합니다. 자궁 전기천공법(in utero electroporation)을 사용하여 생체 내에서 배아 마우스 신피질에서 PIRK를 발현하여 신피질 뉴런에서 PIRK의 광 활성화를 보여줍니다. 유전적으로 인코딩하는 Uaa는 표적 단백질 유형이나 세포 위치에 제한을 두지 않으며, 광반응성 Uaas 계열은 다양한 천연 아미노산 잔류물을 조절하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 일반적으로 많은 신경 단백질에 적용하여 뇌의 다양한 과정에 대한 광학 조절을 달성할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 현재 프로토콜은 분자 수준에서 신경 세포 단백질 활성의 사진 제어를 달성하기 위해 체외 및 생체 내 뉴런에 복잡한 Uaa 통합을 위한 접근 가능한 절차를 제시합니다.

서론

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종래의 전기 자극에 비해 photostimulation는 시편의 생리적 시스템에 최소한의 간섭이 큰 시간과 공간 분해능을 제공합니다. 1971 1 뉴런을 자극하는 레이저를 사용하여 데모 때문에 많은 창의적인 방법은 외인성 광 신경 세포 활성도를 조절하도록 고안되었다. photocaged 작용제의 광 방출은 긴 리간드 2,3,4에 신경 네트워크의 생리적 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 기술로 인해 갇힌 작용제의 확산에 특이성을 제한하고있다. 유전 적 특이성은 ectopically 표현하는 빛에 민감한 옵신 채널에 의해 달성 5,6,7 펌프, 그리고 성공적으로 다양한 모델 생물에서 선택한 신경 네트워크를 조절하는 적용된된다. 그러나, 다른 단백질로 옵신 단백질로부터 photoresponsiveness 그래프트 때문에, 각종 광학 신경 단백질을 제어하기 위해이 방법을 적용하기 어렵다 woul연구중인 단백질의 고유 특성을 변경할 수 강렬한 공학 필요할 거라고. 화학적 단백질 외인성 감광성 리간드 채널 8,9,10 단백질의 기능을 제어하는 다른 방법을 설명했다 테 더링. 리간드 제시하거나 아조벤젠 부분의 광 이성화를 통해 단백질의 결합 부위로부터 배출된다. 더링 화학 세포 내 측면 및 세포 내 단백질을 제외하고, ....

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프로토콜

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본 연구의 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 생물학적 연구 솔크 연구소, 라호야, 캘리포니아에서 동물 처리를위한 프로토콜을 승인하여 수행 하였다

1. UAA Kir2.1의 설립 및 기본 신경 문화의 결과 PIRK의 발현

  1. DNA 건설
    1. UAA 법인에 대한 Kir2.1의 대상 사이트를 선택합니다. 광 감응성 UAA 법인으로 선택한 사이트 Kir2.1 기능 (21)의 광 변조를 할 수 있도록, Kir2.1의 구조와 기능에 대한 사전 지식과 정보를 이용한다.
    2. 태그 황색 정지 코돈에 돌연변이 선택한 사이트와 재조합 DNA 인코딩 Kir2.1 유전자를 구축합니다. 포유 동물 발현 플라스미드에 Kir2.1-TAG의 DNA를 복제하는 표준 복제 기술 (25)를 사용합니다.
    3. UAA 특정하고 응답하여 UAA 통합 클론의 tRNA / 합성 유전자다른 포유 동물 발현에 TAG 정지 코돈 21 플라스미드.
      주 : 최적 UAA의 혼입 (tRNA에, 합성 및 Kir2.1에 대한) 다른 프로모터 및 유전자 카세트의 조합은 서로 다른 플라스미드에서 시험 할 수있다.
    4. 미니 프렙을 사용하여 ....

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결과

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유전자 신경 세포에서 단백질로 UAA를 통합하려면 첫 번째 중요한 단계는 적절한 유전자 전달 및 신경 세포에 효율적으로 유전자를 표현하기 위해 구축 설계하는 것입니다. UAA 혼입 세 유전 요소가있다 : (1) UAA 혼입 (2) 돌연변이 TAG 정지 코돈을 인식하는 직교 tRNA는, (3), 직교 아미노 아실 대하여 선택된 사이트에 도입 TAG 앰버 정지 코돈과 표적 유전자 -tRNA 합성 효소는 직교 tRNA의 상 UAA를 충전합니다. 각 구성 요소는 적절한 프로모터에 의해 구동 될 필요가있다. 이러한 세 가지 유전자 카세트는 하나의 플라스미드를 포함하거나 여러 플라스미드를 분리 할 수​​있다. 신경 세포에서 PIRK을 표현하기 위해, 광 반응성 UAA CMN은 직교 tRNA에 레우 CUA / CmnRS (CMN-의 tRNA 합성 효소) CMN 21,29에 대해 구체적으로 진화 쌍을 사용하여 Kir2.1에 .......

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토론

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효율적인 광 변조를 달성하기 위해, 중요한 초기 단계 여기서 표적 단백질의 감응성 UAA를 통합하기로 결정한다. 표적 단백질의 구조 및 기능 정보는 후보 위치의 선택을 안내하기 위해 매우 유용하다. 동시에, 광 조절의 목적은 최적 인 위치를 결정한다. 후보 사이트를 선택한 후, 우리는 차 신경 세포와 생체 내에서 진행하기 전에 이러한 인간 배아 신장 (HEK) 쉽게 문화와 조작을위한 세포와 같은 포유 동물 세포 라인의 사이트를 테스트하는 것이 좋습니다. Kir2.1 photoactivati​​on에 대한 사이트를 확인하려면, Kir2.1의 기공을 따라 여러 사이트는 처음 HEK 세포에서 테스트되었습니다. CMN 측쇄는 이온 통로를 차단하는 C169 상주 Kir2.1 공경 CMN 측쇄를 수용 할 수있을만큼 충분히 크지 만 작기 때문에 Kir2.1의 C169은 최적 발견되었다. CMN은 Kir2.1에 C169에 통합 될 때 HEK 세포에서 발현, t그는 돌연변이 Kir2.1가 비활성 상태였다 결과 만 성공 PIRK.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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뉴런 배양 및 Ca-P 형질 주입에 대한 유익한 토론을 해 주신 S. Szobota 박사님께 감사드립니다. L.W.는 Salk Innovation Grant, California Institute for Regenerative Medicine(RN1-00577-1) 및 National Institutes of Health(1DP2OD004744)의 지원을

인정합니다.....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
커버 안경, 원, 12mm, 두께 0.13-0.17mmCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D-(+)-포도당 용액Sigma-AldrichG8769
Iris Spatula-curvedFine Science Tool10092-12
해부 칼 - 미세 각도 팁Fine Science Tool10056-12
GlutaMAX-I SupplementLife Technologies35050-061
MITO+ 혈청 확장기BD Biosciences355006
Falcon 40 µ m 세포 스트레이너Corning Life Sciences352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)Sigma-AldrichB6420
LED 광원 – 블랙 LED 385Prizmatix Ltd.
아가로스, 저융점, 분석 등급PromegaV2111

참고문헌

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  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90....

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Kir2 1PIRK

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