뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

요약

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

초록

Photostimulation은 뛰어난 공간 및 시간 해상도로 생물학적 사건을 제어하는 비침습적 방법입니다. 본래 환경에서 발현되는 내인성 단백질을 광 조절하기 위한 새로운 방법이 요구되고 있습니다. 여기에서는 유전적으로 암호화된 비천연 아미노산(Uaa)을 사용하여 뉴런에서 직접 뉴런 단백질의 기능을 광학적으로 제어하는 접근 방식을 제시합니다. 호박색 코돈을 억제하기 위해 직교 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 사용함으로써, 광반응성 Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine(Cmn)은 내부로 정류하는 칼륨 채널인 신경 단백질 Kir2.1의 공극에 특이적으로 통합됩니다. 부피가 큰 Cmn은 채널 기공을 물리적으로 차단하여 Kir2.1을 비전도성으로 만듭니다. 광 조명은 Cmn을 더 작은 천연 아미노산 Cys로 즉시 변환하여 Kir2.1 채널 기능을 활성화합니다. 우리는 쥐의 해마 1차 뉴런에서 이러한 photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) 채널을 발현하고, PIRK의 광 활성화가 활성화된 Kir2.1 채널을 통한 K⁺ 전류의 유출로 인해 뉴런 발사를 중단한다는 것을 입증합니다. 자궁 전기천공법(in utero electroporation)을 사용하여 생체 내에서 배아 마우스 신피질에서 PIRK를 발현하여 신피질 뉴런에서 PIRK의 광 활성화를 보여줍니다. 유전적으로 인코딩하는 Uaa는 표적 단백질 유형이나 세포 위치에 제한을 두지 않으며, 광반응성 Uaas 계열은 다양한 천연 아미노산 잔류물을 조절하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 일반적으로 많은 신경 단백질에 적용하여 뇌의 다양한 과정에 대한 광학 조절을 달성할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 현재 프로토콜은 분자 수준에서 신경 세포 단백질 활성의 사진 제어를 달성하기 위해 체외 및 생체 내 뉴런에 복잡한 Uaa 통합을 위한 접근 가능한 절차를 제시합니다.

서론

종래의 전기 자극에 비해 photostimulation는 시편의 생리적 시스템에 최소한의 간섭이 큰 시간과 공간 분해능을 제공합니다. 1971 ¹ 뉴런을 자극하는 레이저를 사용하여 데모 때문에 많은 창의적인 방법은 외인성 광 신경 세포 활성도를 조절하도록 고안되었다. photocaged 작용제의 광 방출은 긴 리간드 ^2,3,4에 신경 네트워크의 생리적 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 기술로 인해 갇힌 작용제의 확산에 특이성을 제한하고있다. 유전 적 특이성은 ectopically 표현하는 빛에 민감한 옵신 채널에 의해 달성 ^{5,6,7 펌프,} 그리고 성공적으로 다양한 모델 생물에서 선택한 신경 네트워크를 조절하는 적용된된다. 그러나, 다른 단백질로 옵신 단백질로부터 photoresponsiveness 그래프트 때문에, 각종 광학 신경 단백질을 제어하기 위해이 방법을 적용하기 어렵다 woul연구중인 단백질의 고유 특성을 변경할 수 강렬한 공학 필요할 거라고. 화학적 단백질 외인성 감광성 리간드 채널 ^8,9,10 단백질의 기능을 제어하는 다른 방법을 설명했다 테 더링. 리간드 제시하거나 아조벤젠 부분의 광 이성화를 통해 단백질의 결합 부위로부터 배출된다. 더링 화학 세포 내 측면 및 세포 내 단백질을 제외하고, 주로 막 단백질의 세포 외 측 애플리케이션을 제한한다.

광 감응성 Uaas는 단백질에 통합 된 후, 광 단백질을 조작 할 수있는 일반적인 전략을 제공합니다. photocaged Uaas 그들의 구조 - 기능 관계 ^12,13,14 이해를 고급 막 수용체 이온 채널 ^(11)로 Uaas를 통합하는 제노 푸스 난 모세포에 미세 주입 하였다 이른 노력에서 tRNA를 화학적 실화.이 미세 주입 방식은 주로 큰 난자로 제한됩니다. UAA 유전 혼입 생균 ^{15,16,17,18에서} 내인성 단백질 번역을 통해 UAA를 포함하는 직교의 tRNA / 합성 쌍을 사용하여 아실 tRNA에 미세 주입 및 기술적 도전을 우회. 신경 세포의 단백질로 UAA의 통합은 기본 신경 세포와 신경 줄기 세포 ^{(19, 20)에서} 입증되었다. 최근 광 감응성 UAA 유전자 처음 ²¹ 생체 내에서 포유 동물의 뇌에서 신경 세포 단백질에 통합되었다. 이러한 발전은 그 나라의 셀룰러 환경에서 Uaas와의 연결 단백질을 연구하는 것이 가능합니다.

내향 정류 칼륨 채널 Kir2.1 셀 중 이상으로보다 용이 K ⁺ 전류를 통과 강한 정류기이며, 흥분성 세포, 혈관 톤, 심박수, 재를 포함한 생리 과정 조절에 필수적인최종 소금 흐름과 인슐린 ^(22)를 놓습니다. Kir2.1 과발현 이하 흥분성 ^23,24된다 표적 뉴런의 막전위를 hyperpolarizes. 광학의 기본 세포에서 Kir2.1를 제어하려면, 강 등은. 유전자 Kir2.1에 사진 응답 UAA는 포유 동물 세포, 신경 세포 및 배아 마우스의 뇌 ^(21)로 표현 된 통합. 빛의 짧은 펄스 따라서 목표 Kir2.1 단백질의 활성화, 천연 아미노산을 시스테인으로 변환 UAA 수 있었다. 이 사진 - 유도 내향 정류 칼륨 (PIRK) 채널 단백질 래트 해마 뉴런의 기본 발현되면, 광 활성화에 응답 신경원 발화를 억제 하였다. 또한 PIRK 채널은 마우스 배아 신피질로 표현하고, 대뇌 피질의 신경 세포에 광 활성화 PIRK 전류를 측정 하였다. 포유 동물 뇌의 생체 내에서 UAA 기술의 성공적인 구현은 광학 신경 단백질을 제어하는 문을 열어그 나라의 환경에서, 분자 레벨에서의 연결 프로세스 및 메커니즘 광 박리를 가능하게한다.

이 프로토콜에서 우리는 문화와 생체 내에서 배아 마우스 뇌의 기본 뉴런에 Uaas의 유전 설립을위한 절차를 설명합니다. 감응성 UAA CMN 및 Kir2.1 과정을 설명하기 위해 사용된다. 방법 성공 UAA의 통합 및 제공되는 신경 세포의 단백질 활성의 광학 제어를 평가합니다. 이 프로토콜은 유전자 신경 세포와 생체 내에서 Uaas를 인코딩 및 광학적 광 감응성 UAA를 통해 신경 세포의 단백질 기능을 조절하는 데에 명확한 지침을 제공합니다. 우리는이 프로토콜은 신경 과학 및 optogenetic 생물학적 연구를위한 생체 UAA 기술의 채택을 촉진 할 전망이다.

프로토콜

본 연구의 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 생물학적 연구 솔크 연구소, 라호야, 캘리포니아에서 동물 처리를위한 프로토콜을 승인하여 수행 하였다

1. UAA Kir2.1의 설립 및 기본 신경 문화의 결과 PIRK의 발현

1. DNA 건설
   1. UAA 법인에 대한 Kir2.1의 대상 사이트를 선택합니다. 광 감응성 UAA 법인으로 선택한 사이트 Kir2.1 기능 ^(21)의 광 변조를 할 수 있도록, Kir2.1의 구조와 기능에 대한 사전 지식과 정보를 이용한다.
   2. 태그 황색 정지 코돈에 돌연변이 선택한 사이트와 재조합 DNA 인코딩 Kir2.1 유전자를 구축합니다. 포유 동물 발현 플라스미드에 Kir2.1-TAG의 DNA를 복제하는 표준 복제 기술 ^{(25)를 사용합니다.}
   3. UAA 특정하고 응답하여 UAA 통합 클론의 tRNA / 합성 유전자다른 포유 동물 발현에 TAG 정지 코돈 ^{21 플라스미드.}
      주 : 최적 UAA의 혼입 (tRNA에, 합성 및 Kir2.1에 대한) 다른 프로모터 및 유전자 카세트의 조합은 서로 다른 플라스미드에서 시험 할 수있다.
   4. 미니 프렙을 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 확보 또는 제조사의 프로토콜에 따라 상업 키트를 maxiprep. 280 분의 260 비율의 1.9 주위에 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우 상기 DNA 수험 공부 ^(25)의 순도를 확인하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다. 고순도 수퍼 코일 플라스미드 DNA는 신경 세포의 형질 전환을위한 최고입니다.
2. 문화 쥐 해마 차 뉴런
   1. 장소 커버 글라스 (원, 12 직경 mm) 24 웰 플레이트의 각 웰에 하나 coverslip에, 코트 각 웰 0.5 mg을 250 μL / ㎖ 폴리 D 라이신 (100 밀리미터의 붕산 완충액 : 1.24 g의 붕산 증류 된 탈 이온수 400 ㎖ 중의 산 1.90 g 소듐 테트라 보레이트 또는 H ₂ O ₂ DDH O)를, 밀봉. 강아지 당 약 10 ~ 12 코팅 된 커버를 준비합니다.
   2. 해부의 날, 이소 플루 란으로 그들을 마취하고, 목이 이후 출생 쥐 새끼 (1-4 출생 후의 일)에서 신생아의 뇌를 수집합니다. 이소 플루 란 (2-4%)를 포함하는 마취 챔버 새끼 마취. 그들은 의식을 잃고 촉각 자극에와 발의 곤란에 응답하지 않을 때까지 기다립니다.
   3. 표준 기술 ^{(26)을 사용하여} (~ 37 ° C) 식염수 (10 mM의 HEPES 및 행크의 균형 잡힌 염 용액에 첨가하는 20 mM D- 글루코오스) 따뜻한 뇌로부터 해마를 해부하고, 4.5 ㎖의 따뜻한 염수 원뿔형 튜브 해마 수집 .
   4. 해마 (0.25 % 최종 트립신 농도) 2.5 %의 트립신의 500 μl를 추가하고 37 ° C에서 물을 욕조에 10 분 동안 품어.
   5. 철저히 식염수 (3 × 10 mL) 및 씹다와 조직을 헹군다.
   6. 1 ml의 w에있는 해리 신경 세포를 복구5 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충 된 최소 필수 매체 (MEM)를 포함하는 암 성장 배지, 21.2 mM의 D- 글루코오스, 2 mM L- 글루타민, 2 % B-27, 및 0.1 % 혈장 증량제.
      참고 : 신선한 성장 미디어를 준비하기 위해 절개의 날에 L 글루타민 및 B-27를 추가합니다.
   7. 혈구와 신경 세포를 계산하고, 1.0-1.5 × 10 ⁵ 세포에서 24 웰 플레이트에 커버 슬립에 그들을 판 / 잘 500 μl의 성장 미디어와 밀도 후 40 μm의 나일론 메쉬로 여과.
   8. 5 % CO _2에서 35 ° C에서 신경 세포 문화를 품어 : 95 % 공기 가습 인큐베이터를 2-3주 위해. 최상의 결과를 위해, 배양 중에 최대한 배양을 방해하지 않도록.
3. 기본의 연결을 문화의 인산 칼슘 (칼슘-P) 형질
   1. 39 ° C에서 원액 저장을 0.5 M BES를 (N은, N은 비스 [2- 히드 록시 에틸] -2- 아미노 에탄 술폰산) 버퍼 (10 배); 150 밀리미터 나 ₂ HPO ₄ (100 배) 2.8 M의 NaCl (10X); 멸균 DDH ₂ O; 멸균 1 N NaOH를.
   2. 형질의 날, 0.22 μm의 필터 DDH ₂ O에 신선한 2.5 M _CaCl2를 솔루션과 살균 필터를 확인합니다. 0.22 μm의 필터로 pH 7.00 (NaOH를 사용하여 pH를 조절) 및 살균 필터에서 50 밀리미터의 BES 1.5 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 280 mM의 NaCl을 함유하는 신선한 배의 BES 완충 식염수 (BBS) 버퍼를 확인합니다.
      주 : 형질 할 _CaCl2를 용액 및 커버 슬립의 수에 따라 BBS 버퍼의 양을 계산한다. 또한 1.3.4 봐.
   3. 500 μL 신선한 사전 예열 형질 전환 성장 미디어 문화 성장 미디어를 교체합니다. (형질 미디어는 MEM 플러스 21.2 mM의 D-포도당으로 만들어 질 수있다).
      참고 : 기존의 미디어를 버리지 마십시오.
   4. DDH ₂ O의 양을 계산하고 1.65 μL _CaCl2를 0.7 μg의 DNA, 및 16.5을 포함하는 형질 감염 용액 (각 커버 슬립 당 33 μL)를 확인하기 위해 추가 제조# 181; 리터 2 배 BBS.
   5. 문화에 추가하기 전에 즉시 형질 솔루션을 준비합니다. 천천히 튜브를 교반하면서 준비하려면, 먼저 염화칼슘 ₂ DDH ₂ O를 결합한다. 용액에 DNA를 추가 천천히 교반을 계속합니다. 교반하면서 마지막으로, 배 BBS 버퍼가 드롭 현명 추가 할 수 있습니다.
   6. 바로 신경 세포 배양의 각 coverslip에로 형질 전환 솔루션의 30 μl를 추가합니다.
   7. 45 분 - 1 시간 동안 95 %의 공기 가습 인큐베이터 : 용액을 혼합하고 5 % CO _2에서 35 ° C에서 배양하는 배양 접시를 몇 번 바위. 신경 세포는 형질 감염 용액과 함께 배양 한 후, 미세한 CA-P 석출물 뉴런을 덮는 층을 형성한다.
   8. 500 ㎕를 미리 예열 세척 완충액 (135 mM의 염화나트륨, 20 mM의 HEPES, 4 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 _2, 1 밀리미터의 MgCl _2, 1 mM의 나 ₂ HPO _4, pH가 7.3에서 10 mM의 포도당, 멸균에게로 형질 미디어를 교체 0.22 μm의 필터로 여과) 35 부화6; C 5 % CO ₂ : 15 ~ 20 분 동안 95 %의 공기 가습 인큐베이터. CA-P 석출물의 세척 단계 후에 사라질 것이다.
   9. 500 ㎕를 새로운 성장 배지로 세척 버퍼를 교체합니다. 다시 말하지만, 저장된 원본 미디어와 성장 미디어를 교체합니다.
   10. 1 mM의 최종 농도에 도달하는 문화 (50 μl의 따뜻한 성장 미디어의 사전 혼합)를 UAA CMN을 추가합니다.
   11. 5 % CO _2에서 35 ° C에서 형질 문화를 품어 : 95 % 공기 가습 인큐베이터를 분석하기 전에 12-48 시간 동안.
4. 빛 활성화와 전체 셀 녹음
   1. 추가 / 세포 내 솔루션을 준비합니다. 세포 내 솔루션은 135 MM의 칼륨, 글루 콘산, 10 mM의 NaCl을, 2 밀리미터의 MgCl _2, 10 mM의 HEPES, 1mM의 EGTA, 2.56 mM의 K ₂ ATP, pH를 7.4에서 0.3 mM의 리튬 ₂ GTP가 포함되어 있습니다. 세포 외 기록 용액은 150 mM의 NaCl을 3 밀리미터의 KCl을 포함하고 5 밀리미터의 MgCl _2, 0.5 mM의 _CaCl2를 5 mM의 포도당 및 pH 7.4의 10 mM의 HEPES.
   2. 전체 셀 패치 클램프의 전기 생리학 장비를 설정 : 현미경은 4 배 및 20 배 목표, 미분 간섭 대비 (DIC) 및 mCitrine 필터 장착 (: 10분의 495 nm의, 방출 : 여기 25분의 525 ㎚); 속이는 사람; 패치 클램프 증폭기; 디지타이저; 데이터 수집 및 분석 소프트웨어.
      1. 45 ° 각도에서 1cm 거리에서 초점이 광을 전달하기 위해 장비에 현미경으로 385 nm의 방출을 가진 발광 다이오드 (LED)를 설치한다. 광 파워 미터와 LED의 전원이 켜져 있는지 확인하십시오.
   3. 3-6 MΩ 피펫 저항을 가지고 상업 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 전극에서 패치 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫 풀러를 설정하는 제조업체의 지시 사항을 따르십시오.
      1. 피펫 저항을 테스트하기 위해, 먼저 세포 용액을 피펫을 채우고 전극 홀더에 위치. 현미경 페이지에 배치 된 세포 외 용액으로 가득 35mm 배양 접시에 피펫을 찍어latform. 회로를 완료하기 위해 음식에 접지 전극을 담근다.
      2. 앰프 / 디지타이저를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 막 시험 프로토콜 피펫 저항을 모니터링한다.
   4. 인큐베이터에서 신경 세포 문화의 커버 슬립을 가지고 세포 외 용액에 한 번 헹군다. 진공 그리스를 사용하여 신선한 세포 외 용액으로 가득 35mm 배양 접시의 중간에 커버 슬립을 누르고 있습니다.
   5. 전기 생리학 현미경 플랫폼에서 커버 슬립 / 접시를 놓습니다.
   6. 표준 패치 클램프 기술을 이용하여 형광 mCitrine ²⁷ 뉴런 패치. 현재 클램프 (I-클램프) 방법을 사용하여 녹음 신경 활동. 첫째, 작은 전류를 주입하여 약 -72 MV에 휴식 잠재력을 조정합니다. 그리고, 활동 전위의 연속 소성 (5-15 Hz에서)를 유도하는 단계 전류 (10-200 펜실바니아) 주사.
   7. 수동 또는 상기 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여 펄스를 플래시 (죄신경 세포에 LED 빛을 100 밀리 초 ^-1 초 기간)의 GLE 펄스는 기록 및 활동 전위이 영향을 받는지 볼 수있다.
   8. 목욕에 0.5 mM의 BaCl _2를 추가하고 활동 전위를 복구하는 경우 확인합니다.

2. UAA Kir2.1의 설립 및 생체 내에서 마우스 배아 뇌에서 생성 된 PIRK의 발현

1. DNA 건설
   1. 단계 1.1에서와 마찬가지로 플라스미드 DNA를 디자인합니다. 생체 내 발현를 들어, CAG (CMV 증강 치킨 베타 - 액틴 프로모터) 등의 강력한 프로모터를 사용합니다.
   2. 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신 무 maxiprep 상업용 키트 DNA를 정제 하였다. (2-5 μg의 / μL에 응축) 매우 높은 품질의 DNA를 취득 에탄올 침전 ⁽²⁵⁾ 다음에 페놀 - 클로로포름 추출을 수행합니다.
2. 마우스 배아 신피질에 자궁 Electroporation에에서
   참고 : 기본 TECHNI을자궁 내 전기에 대한 케는 이전에 ²⁸ 설명 하였다.
   1. 나트륨 펜토 바르 비탈 (복강 내 주사, g 체중 당 50 μg의) 또는 이소 플루 란 (흡입 2-4 %)와 배아 일 14.5 (E14.5)에서 초과 임신 한 마우스를 마취. 의식의 손실과 촉각 자극에 전혀 반응을 확인하여과 발의 곤란에 마취 깊이를 모니터링합니다.
   2. 복부 정중선에 작은 절개를합니다. 부드럽게 집게와 손가락으로 자궁 뿔이 노출됩니다.
   3. 자궁 벽을 통해 삽입 된 유리 피펫 각 한배의 새끼의 측면 뇌실에 약 1 ㎕의 DNA 용액 (각 플라스미드의 2-5 μg의 / μL, 구조물에 따라)을 주입한다. 대부분의 경우, 총 배아의 약 60-80%가 주입된다.
   4. electroporator (33-35 V, 50 밀리 초 지속 시간 950 밀리 초 간격, 4-8 펄스)로 배아를 Electroporate.
   5. 대한 부드럽게 복강에 자궁 뿔을 돌려줍니다CEPS와 손가락. 근육 벽 봉합 수술 후 봉합으로 피부는 배아 발달을 계속하도록.
3. UAA 미세 주입
   1. E16.5 다시 복부 정중선에 작은 절개를하고, 부드럽게 집게와 손가락으로 자궁 뿔이 노출됩니다.
   2. 일렉트릭 측 또는 자궁벽을 통해 삽입 유리 피펫 뇌실의 양측에 약 2-5 μL CMN-의 Ala (500 mm)를 주입한다. 생체 내 ²¹ CMN을 제공하기 위해 디 펩티드 CMN-알라 (CMN 알라닌)를 사용, CMN의 생체 이용률을 증가합니다.
   3. 다시 말하지만, 집게 손가락 끝으로 부드럽게 복강에 자궁 뿔을 반환합니다. 근육 벽 봉합 수술 후 봉합으로 피부는 배아 발달을 계속하도록.
4. 급성 뇌 조각을 얻기
   1. 119 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.3 mM의의 MgCl _2, 2.5 mM의 염화칼슘을 함유 한 L 인공 뇌척수 (ACSF)를 확인 _{이, pH가 7.3에서 1 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 26.2 밀리미터의 NaHCO3 및 11 mM의 글루코오스.}
   2. 20 ~ 30 분 -80 ° C에서 200 ML의 ACSF 빠른 동결을 가져 가라. 버블 5 % CO ₂ ACSF의 나머지 95 % O ₂ 가스를 실온에서 첨가 하였다.
   3. 준비 및 배아에서 뇌를 수확 수술 도구를 소독. 또한 얼음 양동이를 준비합니다.
   4. 전자 레인지에서 가열 플라스크에 ~ 100ml의 4 % 저 융점 아가로 오스 솔루션을합니다. 이 응고 시작하기 전에 약 5 분 동안 용액을 냉각.
   5. CO ₂ 과다 복용에 의한 CMN-알라 주입 후 마우스 12 ~ 24 시간을 안락사. 복부에 큰 절개를 확인하고 미세 가위와 집게로 자궁에서 전기 천공 / 미세 주입 배아를 해부하다.
   6. 미세 가위와 집게로 배아에서 수확 두뇌.
   7. 얼음 통에 배치 10cm 배양 접시에 각각의 뇌를 놓습니다. 날카로운 날을 사용하여 두 개의 반구를 나누고, 각각의 장소접시의 바닥을 감동 midsagittal 비행기와 함께 접시에 반구. 신속하게 (반구 ​​당 500 ㎕의 주위에) 머리 위에 아가로 오스 솔루션을 통해 붓는다.
   8. 날카로운 칼날을 사용하여 사각형 뇌 내장 아가로 오스 블록을 만들기 위해 뇌 주위 아가로 오스를 잘라.
   9. 조직 접착제를 사용하여, vibratome위한 장착부에 아가 블록 midsagittal 평면을 접착제. 사전 냉장 ACSF와 vibratome 챔버를 입력하고 200 μm의 시상 뇌 조각을 잘라.
   10. 95 % O ₂ 가스 : 5 % CO _2와 버블 링하면서 42 분 동안 33 ° C에서 3 밀리미터 미오의 -inositol, 0.4 MM의 아스 코르 빈산, 2 mM의 피루브산 나트륨 보충 ACSF 급성 슬라이스를 품어.
   11. 42 분 후, 히터를 끄고 버블 링 실온에서 슬라이스를 배양하는 것을 계속한다. 히터를 끄고 전체 셀 패치 기록을 최소 15 분을 시작합니다.
5. 빛 활성화와 전체 셀 녹음
   1. INTRAC 준비130 mM의 칼륨, 글루 콘산 4 밀리미터의 MgCl _2, 5 mM의 HEPES, 1.1 mM의 EGTA, 3.4 mM의 _나트륨이 ATP, 10 mM의 나트륨 크레아틴 포스페이트 및 KOH로 조정의 pH 7.3, 0.1 mM의 나트륨 ₃ GTP 함유 ellular 용액.
   2. 3-6 MΩ 피펫 저항을 가지고 상업 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 전극에서 패치 피펫을 당깁니다.
   3. 전체 셀 패치 클램프에 대한 슬라이스 전기 생리학 장비를 설정하고 2 ㎖ / 관류 펌프 분 속도로 ACSF로 기록 챔버를 superfuse. 약 33 ° C로 챔버 온도를 조정합니다.
      참고 : 슬라이스 전기 생리학 장비는 관류 챔버, 침수 목적 및 온도 조절 장치가 장착되어 있습니다. 또한, GFP 필터 (여자 : 30분의 480 nm의, 방출 : 40분의 535 ㎚) 및 mCherry 필터 (여자 : 20분의 580 nm의 방출 : 130분의 675 nm의)가 필요합니다.
      1. 45 °에서 1cm 거리에서 초점에 빛을 전달하기 위해 장비에서 현미경으로 385 nm의 방출에 LED를 설치하십시오각도. 광 파워 미터와 LED의 전원이 켜져 있는지 확인하십시오.
   4. 조심스럽게 관류 챔버에 유리 피펫 및 장소 뇌 조각을 선택합니다. 하프와 슬라이스를 누르십시오.
   5. 신피질 영역 ^(27)에서 mCherry / GFP의 형광을 가진 신경 세포 패치. 전압 클램프 (V-클램프) 방법을 사용하여 기록 PIRK 활동. 첫째, -60 MV에서 막 잠재력을 보유. 그런 다음, 고정 부정적인 막 전위 (-100 MV) 또는 전압 램프 (+40 MV -100 MV)에 기록 전류. 특히, -100 MV에서 Kir2.1 특정 안쪽으로 전류를 모니터링 할 수 있습니다.
   6. 수동 또는 상기 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여, 기록하면서 신경에 LED 광 펄스 (100 밀리 초 시간 ^-1의 단일 펄스) 플래시 및 PIRK 단백질이 활성화되어 있는지. PIRK가 활성화되면, -100 Mv로 내향 전류가 크게 증가 할 것이다.
   7. 목욕에 0.5 mM의 BaCl _2를 추가하고 PIRK 다시 불 활성화되어 있는지 확인.

결과

유전자 신경 세포에서 단백질로 UAA를 통합하려면 첫 번째 중요한 단계는 적절한 유전자 전달 및 신경 세포에 효율적으로 유전자를 표현하기 위해 구축 설계하는 것입니다. UAA 혼입 세 유전 요소가있다 : (1) UAA 혼입 (2) 돌연변이 TAG 정지 코돈을 인식하는 직교 tRNA는, (3), 직교 아미노 아실 대하여 선택된 사이트에 도입 TAG 앰버 정지 코돈과 표적 유전자 -tRNA 합성 효소는 직교 tRNA의 상 UAA를 충전합니다. 각 구성 요소는 적절한 프로모터에 의해 구동 될 필요가있다. 이러한 세 가지 유전자 카세트는 하나의 플라스미드를 포함하거나 여러 플라스미드를 분리 할 수​​있다. 신경 세포에서 PIRK을 표현하기 위해, 광 반응성 UAA CMN은 직교 tRNA에 ^레우 _CUA / CmnRS (CMN-의 tRNA 합성 효소) CMN ^21,29에 대해 구체적으로 진화 쌍을 사용하여 Kir2.1에 ...

토론

효율적인 광 변조를 달성하기 위해, 중요한 초기 단계 여기서 표적 단백질의 감응성 UAA를 통합하기로 결정한다. 표적 단백질의 구조 및 기능 정보는 후보 위치의 선택을 안내하기 위해 매우 유용하다. 동시에, 광 조절의 목적은 최적 인 위치를 결정한다. 후보 사이트를 선택한 후, 우리는 차 신경 세포와 생체 내에서 진행하기 전에 이러한 인간 배아 신장 (HEK) 쉽게 문화와 조작을위한 세포와 같은 포유 동물 세포 라인의 사이트를 테스트하는 것이 좋습니다. Kir2.1 photoactivati​​on에 대한 사이트를 확인하려면, Kir2.1의 기공을 따라 여러 사이트는 처음 HEK 세포에서 테스트되었습니다. CMN 측쇄는 이온 통로를 차단하는 C169 상주 Kir2.1 공경 CMN 측쇄를 수용 할 수있을만큼 충분히 크지 만 작기 때문에 Kir2.1의 C169은 최적 발견되었다. CMN은 Kir2.1에 C169에 통합 될 때 HEK 세포에서 발현, t그는 돌연변이 Kir2.1가 비활성 상태였다 결과 만 성공 PIRK...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
커버 안경, 원, 12mm, 두께 0.13-0.17mm	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-포도당 용액	Sigma-Aldrich	G8769
Iris Spatula-curved	Fine Science Tool	10092-12
해부 칼 - 미세 각도 팁	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Supplement	Life Technologies	35050-061
MITO+ 혈청 확장기	BD Biosciences	355006
Falcon 40 µ m 세포 스트레이너	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)	Sigma-Aldrich	B6420
LED 광원 – 블랙 LED 385	Prizmatix Ltd.
아가로스, 저융점, 분석 등급	Promega	V2111