혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
수혈을 위해 준비된 혈소판은 보관 중에 점차 지혈 기능을 잃습니다. 혈소판 기능은 다양한(간접) 체외 실험을 사용하여 조사할 수 있지만, 이들 중 어느 것도 미세유체 유동 챔버만큼 포괄적이지 않습니다. 이 프로토콜에서는 저장된 혈액 은행 혈소판으로 혈소판 감소성 신선한 혈액을 재구성하는 데 사용되어 혈소판 수혈을 시뮬레이션합니다. 다음으로, 재구성된 샘플은 노출된 내피하 기질 단백질의 지혈을 모방하는 미세유체 흐름 챔버에서 관류됩니다. 헌혈, 수송, 성분 분리, 저장 및 병원체 불활성화의 효과는 쌍체 실험 설계에서 측정할 수 있습니다. 이를 통해 혈액 성분 제제의 모든 조작이 지혈에 미치는 영향을 신뢰할 수 있게 비교할 수 있습니다. 본 연구의 결과는 온도 순환, 전단 속도, 혈소판 농도 및 저장 기간이 혈소판 기능에 미치는 영향을 보여줍니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 혈액 은행 혈소판의 기능을 분석하고 궁극적으로 정맥 절개술, 수송, 성분 준비, 보관 및 수혈을 포함한 처리 사슬의 최적화를 지원합니다.
서론
지혈은 제한된 시공간 상황 (1) 세포, 단백질, 이온 및 조직의 결합과 규제 활동을 필요로한다. 제어되지 않은 활동은 혈액 응고 관련 질환의 스펙트럼에 출혈이나 혈전증 및 이환율이나 사망률의 원인이됩니다. 미세 유체 흐름 챔버 실험은 시험관 내에서 지혈을 모방 도전적인 기술이다. 이 방법은 혈소판에 대한 선도적 인 역할과 지혈에 참여 프로세스의 복잡한 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다.
혈관 손상에 따라, 혈소판은 혈액 손실을 방지하기 위해 피하 노출 매트릭스 (글리코) 단백질에 부착. 접착 후, 혈소판 활성화 및 답변 집합체 자동 - 최종적 혈소판 네트워크의 형성에 의해 안정화 피브린 및 회사의 결과에 이르게 분비 시그널링 혈전이 밀봉 권취. 대부분 혈소판 기능 검사, 체험관 달리흐름 챔버와 사항이 고려 혈류의 물리적 파라미터 따라서 멀티플 세포 및 생체에 3,4- 레올의 영향을.
흐름 챔버 실험은 접착제 매트릭스, 유동성 및 흐름 프로필, 세포 성분, 독성 물질이나 약물, 이온 강도 및 더 많은 존재 포함되는 프로세스 지혈 (하위)에 영향을 미치는 주요 매개 변수를 변화시켜 지혈과 혈전의 랜드 마크 통찰력을....
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프로토콜
이 프로토콜은 인간의 샘플에 대한 연구에 대한 기관 윤리 지침을 다음과 동의서가 포함 된 모든 기증자로부터 얻은 것입니다. 여기에 설명 된 실험에 대한 승인은 앤트워프 대학 병원의 임상 시험 심사 보드에서 얻었다.
주 : 지정하지 않는 온도 표시는 항상 실온이다.
1. 준비 유량 용기 설치
- 준비 레인, 튜브와 핀
- 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석.
참고 : 우리는 주로 유형 I 피 브릴의 구성, 말 건 콜라겐을 사용합니다. 말의 콜라겐 타입 I은 종종 "HORM"콜라겐로하고, 과거뿐만 아니라 생물학적 분석 이유 모두 9 이러한 유형의 황금 표준이다. 인간 타입 III 콜라겐도 사용되지만, 일 수있다E는 덜 코트 브릴 및 혈소판 반응은 강하지 않다. 기타 코팅 표면은 예 폰 빌레 브란트 인자 (VWF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로 넥틴, 트롬 보스 폰딘 -1 (16) 또는 이들의 조합을 위해 사용될 수있다. - 공급자의 컨테이너에서 새로운 일회용 바이오칩을 가져 가라. 여기에 사용되는 바이오칩....
- 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석.
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결과
내부 분석 변화를 설명하기 위해, 3 개의 동일한 복원 된 전혈 시료를 콜라겐 코팅 된 표면 (도 1)를 통해 동시에 관류 하였다. 이는 8.7 %의 변동 계수가 발생했습니다. 이 통계는 관련 샘플 간의 신뢰성있는 비교를 허용 허용 내 분석 및 intralaboratory 변화를 의미한다.
우리는 여기 설명 상업적 유동 챔버의 입구는 상기 측정 챔버에 수직이며,이 대신에 그 시점에서 층류 약간 난류가 발생할 수있다. 특히 항응고제가없는 실험에서 이는 혈액과 고정화 효능의 증가 된 접촉 시간에 막힘이 발생할 수있다. 막힌 유입 챔버의 하류 판독을 혼동 할 수있다. 따라서, 설치가 부분적으로 유량 용기 (그림 2) 떠나 코팅하여 최적화 된혈소판 효능없는 입구는하여 기본 및 보조 지혈의 불의의 활성화를.......
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토론
미세 유체 흐름 챔버 실험은 혈액을 흐르는 혈소판 기능을 조사하는 훌륭한 도구입니다 실험 상황 변화에 체외에서 지혈을 평가하는 데 사용됩니다. 가난한 실험실 간 표준화 (9)에도 불구하고, 우리는 우리의 실험실에서 실험 변동이 허용되는 것을 보여줍니다. 이것은 확실하게 주어진 연구에서 (쌍) 샘플을 비교할 수 있습니다. 이것은 혈액 은행 조건 11 혈소판 저장 해로운 결과이다 혈소판 저장 병변의 문서화 현상을 이용하여 검증 하였다. 또한, 최근의 혈액 14,15 재구성 다음 미세 유동 챔버의 PC 혈소판 기능에 대한 세 가지 가능한 병원체 불활 화 기술의 영향을 출판.
생물 물리학 및 - 화학 매개 변수를 20 다양 때 혈소판은 다르게 반응한다. 따라서, 전단 응력, 세포 수 및 세포 성분 조성기, 온도, 코팅, 항응고제 등 많은 요인은 연구 문제에 따라이 프로토콜 내에서 변형 될 .......
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공개 사항
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감사의 글
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| EDTA가 있는 BD 진공 튜브 | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| Heparin이 있는 BD 진공 튜브 | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| 구연산나트륨이 있는 BD 진공 튜브 | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin 혈액 | Roche | 6675751 001 | |
| BD 진공 청소기 Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | 홀더가 사전 부착된 채혈 바늘 |
| 피펫 팁 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| 피펫 팁 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| 피펫 팁 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| 튜브 5 ml | Simport | 11691380 | |
| 원뿔형 튜브 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| 원뿔형 튜브 50ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10ml 주사기 | BD | 309604 | |
| 정밀 와이프 | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro + Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Figure S1 A에 명명 된 'Biochip'Vena8 |
| 튜빙 | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Figure S1 B에서 '일회용 튜브'로 명명 |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Figure S1 B에서 'Pin'으로 명명 |
| Biochips의 단일 입구 케이블용 커넥터 | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Figure S1 B에서 'Reusable tubing' 및 'Splitter'로 명명 |
| Cellix | HUMID-BOX | ||
| 소프트웨어 미세유체 펌프 | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) 콜라겐을 묽게 하기 위한 등장성 포도당 용액이 보충 |
| 됩니다.HEPES 완충 식염수(HBS) | 가정 준비 | 중 준비 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충 식염수(0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) | |
| 집 준비 준비 내 | 차단 버퍼 | HBS | |
| Calcein AM | 분자 프로브 | C1430 | |
| 표백제 10% | 가정 준비 | ||
| 0.1 M NaOH | 가정 준비 | ||
| 준비 변성 알코올 | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Figure S1 A에서 'Pump' 및 'Manifold' 현미경으로 명명됨 |
| Zeiss | Axio Observer Z1 | colibri-LED와 고해상도 CCD 카메라 | |
| 소프트웨어 현미경을 | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| 혈액학 분석기 | Sysmex | N/A | |
| 탁상용 원심분리기 | Eppendorf | 521-0095 | |
| 혈소판 인큐베이터 | Helmer | PF-48i | |
| 배양 수조 | GFL | 1013 | |
| 피펫 | 브랜드 | A03429 | |
| 튜브 롤러 | Ratek | BTR5-12V | |
| 멸균 도킹 장치 | Terumo BCT | TSCD | |
| 튜빙 실러 | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
참고문헌
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling netwo....
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