유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

요약

게놈 전체 염기서열 분석 실험과 대사체학 실험의 데이터를 통합하는 것은 어려운 일입니다. 이 논문에서는 처음으로 에스트라디올로 처리된 유방암 세포에서 전사체, 시스톰 및 대사체 데이터의 생성, 분석 및 통합을 보고합니다.

초록

-omics의 출현으로 암과 대사 증후군과 같은 만성 질환에 대한 우리의 이해가 개선 된 접근한다. 그러나, 유전자 발현 마이크로 어레이 깊이 순서화 실험 대사 프로파일로부터 획득되는 대규모 데이터 집합의 정보를 효과적으로 마이닝 발견하는 것이 필수적이다하고 효과적으로 병든 세포 표현형의 중요한 표적 레귤레이터. 에스트로겐 수용체 α (ERα)은 에스트로겐 반응 유방암에 중요한 유전자 프로그램을 조절하는 마스터 전사 인자 중 하나입니다. ERα는 유방암 대사에 신호의 역할을 이해하기 위해서 우리는 에스트라 디올로 치료 MCF-7 세포에서 transcriptomic cistromic 및 메타 볼로 데이터를 이용했다. 이 보고서에서 우리는 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 실험 얻어진 데이터의 통합 전산 분석을 위해 샘플의 생성을 설명했다. 이 방법은 새로운 몰을 서술에 유용하다정상 또는 병에 걸린 세포의 영향 대사 특정 전사 인자에 의해 조절된다 큘라 메커니즘과 유전자 조절 회로.

서론

에스트로겐은 생식 조직, 대사 조직, 뇌와 뼈 ^하나를 포함하여 모두 여성과 남성의 많은 생리 학적 과정의 중요한 규제입니다. 이 조직에서의 유익한 효과에 더하여, 에스트로겐은 유방 및 생식 조직에서 발생하는 암을 구동한다. 에스트로겐은 주로 세포 유형 특정한 효과를 유도 ERS를 통해 작동한다. 칩-서열을 이용하여 RNA-서열 및 게놈 전체 ERα DNA 결합 부위 분석을 사용 ERα에 의해 규제 성적 증명서의 깊은 순서는 ERα 그들로부터 발생하는 다른 조직과 암에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 유용한 것으로 입증되었다. 우리와 다른 유전자 발현 (ERβ 대 ERα) 다른 수용체와 관련된 프로파일 ^{2, 3,} 다른 리간드 ^3-5 다른 coregulators ^2,4,6,7를 발표했다.

RNA-서열은 마이크로 어레이 바에 비해 높은 정밀도와 효율성을 제공하는 전 사체를 검사하는 주요 방법입니다SED의 유전자 발현 분석 ^(8). 세포주 ^2-4,7, 조직 또는 종양 샘플에서 얻은 RNA 게놈이 가능한 어셈블리에 매핑 서열화되고 차등 조절 유전자 식별된다. 염색질 면역 침전 (칩)은 알려진 규정 결합 부위에 결합하는 전사 인자와 ....

프로토콜

RNA-SEQ 샘플 1. 준비

1. 세포 배양 및 치료
   1. 문화 개선 MEM (IMEM)을 더한 10 %의 열 불활성 FBS, 1 % 페니실린 / 가습 된 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 스트렙토 페놀 레드 배지에서 MCF7 세포.
      참고 : 동일한 세포주 및 세포 배양 조건을 연구 전반에 걸쳐 사용된다.
   2. 6 웰 플레이트에 잘 당 종자 10 만 MCF7 세포. 각각의 치료를위한 삼중있다. 3 일에, 매체를 제거하거나 잘 각각 10 ^-8 M E2없이 2 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 가습 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 접시를 품어.
   3. 세포 수확을 위해, 각 웰에 1 ml의 RNA 분리 시약 (산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름)를 첨가하고, 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양. 그 후 1.5 ㎖의 튜브에 피펫 예금 의해 파쇄 시약 수집
2. RNA 분리
   1. 200 μL chlorofo 추가10 초 동안 1 ml의 세포 용 해물 시약 (1.1.3)와 소용돌이에 RM. 실온에서 5 분간 인큐베이션. 4 ℃에서 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 ....

결과

Transcriptomics
E2 처리에 의한 차등 발현 유전자를 분석하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 실험을 수행하기로 결정했습니다. mRNA 수준에 대한 정보를 제공 할뿐만 아니라, RNA-SEQ 데이터는 비 코딩 RNA를 (길이 비 코딩 RNA를, 마이크로 RNA)와 스 플라이 싱 이벤트의 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 본 연구의 범위는 대사 조절에 중요​​한 단백질 코딩 유전자를 식별하기 때문에 우리는 RNA를 코딩 비 또는 대안 전사 유전자의 분석에 대한 정보를 제공하지 않았다. 그러나, RNA-SEQ 차등 유전자 발현 이벤트에 대한 정보를 얻을 수있는 훌륭한 방법이다.

고품질 판독 얻기 위해서는 고순도의 RNA를 얻기 위해 중요하다. RNA를 분리 한 후 우리는 RNA 청소 키트를 사용하여 RNA를 정제 하였다. 불행하게도 R.......

토론

본 논문에서는 E2로 치료 MCF-7 세포에서 생성 및 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 데이터의 통합 분석을 설명했다. 우리는 생물학적으로 중요한 발견을 생산하는 가장 효율적인 방법과 사용자 친화적 인 부드러운 상품을 활용하는 전략 수립 프로토콜을 개발. 우리의 지식으로, 우리는 세 가지 분석 ERα 직접 유방암 세포 규제 식별 새로운 대사 경로에서 -omics 데이터를 통합하는 최초의 연구이다.

Transcriptomics
성공적인 transcriptomic 분석을위한 고품질의 RNA를 시작하는 것이 중요합니다. 좋은 방법은,의 RNase없는 벤치를 만들어 자주 장갑을 변경, C °에서 -80 저장하고 사용 얼음에 유지를 포함하여 RNA 분해의 가능성을 제거합니다. -20 ºC에서 하룻밤 배양의 추가는 RNA 복구를 향상시킨다. 반복 동결 융해의 RNA를 방지하기 위해, 하나는 다운 스트림 procedur의 RNA를 할당 할 수단리 및 정제시 에스. 시.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트리글리세라이드 믹스	시그마	17810-1AMP-S
올레산	Sigma	O1257-10MG	올레산-수용성 분말
TRIzol 시약	생명 기술	15596-026
Dynabeads Protein A	Life 기술	10006D
Dynabeads Protein G	Life 기술	10007D
QIAquick PCR 정제 키트	QIAGEN	28106	입력 샘플의 DNA 분리
ZYMO ChIP-DNA 분리 키트	자이모 리서치	D5205	ChIP DNA 클린 & 농축기
Quant-iTª 피코그린¨ dsDNA 어세이 키트	Invitrogen	P7589	DNA 정량
RNase-Free DNase 세트	QIAGEN	79254	RNA 정제
DEPC 처리된 물	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	1/8 프로브
피셔 사이언티픽 사운드 인클로저	피셔 사이언티픽	FB-432-A	소음 감소용
Eppendorf 튜브 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 튜브 (2 봉지 100 개)
랜덤 프라이머 믹스	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV 역전사효소	NEB	M0253S
FastStart SYBR 그린 마스터	ROCHE	4673484001
아가로스	피셔	BP160100	1.5% 아가로스 젤
Qubit RNA HS 어세이 키트	생명 기술	Q32852	RNA 정량화(100개 분석)
포름알데히드	시그마	F8775
프로테아제 억제제 정제	로슈	4693116001	각 정제는 10 ml 용해 완충
PhosSTOP Phosphatase 억제제 칵테일 정제	Roche에 충분합니다.	4906845001	각 정제는 10 ml 용해 버퍼에 충분합니다.
비트 어세이 키트	라이프 테크놀로지스	Q32850	100 분석
자동 세포 카운터	ORFLO	MXZ000
튜브 로테이터	VWR	10136-084
Victor X5 멀티플 플레이트 리더	PerkinElmer	2030-0050
마이크로 원심분리기 5417R	Eppendorf	22621807
자석 스탠드	Diagenode	B04000001
빠른 Real-time PCR 시스템	응용 과학

액 큐4351405