방법 논문

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

DOI:

10.3791/53840

⸱

2016년 3월 22일

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

이 논문에서

요약

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감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

초록

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모두 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 서명 통합 환경 설정. 여기서는 결찰 매개 PCR (LM-PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 레트로 바이러스 통합 위치의 다양한 라이브러리 (1)의 생성에 대한 상세한 프로토콜, (2) 각각의 바이러스에의 게놈 위치에 맵핑을 제시 BEDTools 접합을 이용하고, (3)에 대한 통계 관련 데이터를 분석하는 호스트. 감염된 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해에 의해 분열된다. 적합한 DNA 최종 복구 한 후, 이중 가닥의 링커는 DNA 종료에 라이 게이션하고, 반 중첩 PCR은 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 단부와 결찰 링커 DNA 모두에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 증폭 된 PCR 프라이머는 별도의 어댑터 결찰에 대한 요구 사항을 부정, NGS 동안 DNA 클러스터링에 필요한 시퀀스를 수행한다. 품질 관리 (QC)의 DNA 단편 크기 분포를 평가하고 적응 수행NGS 이전에 DNA의 결합을 어. 시퀀스 출력 파일 LTR 함유 판독 필터링되고 LTR 링커 정의 서열 얻어 자른된다. 트림 숙주 세포 서열은 BLAT를 사용하여 참조 게놈 맵핑하고 참조 게놈의 독특한 지점에 최소 97 % 동일성 필터링된다. 고유 한 통합 사이트는 다양한 게놈 기능에 인접한 염기 (NT) 순서 및 유통 기준에 대해 자세히 조사하고 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 매우 복잡한 통합 사이트 라이브러리 사흘 게놈 DNA로부터 구성 될 수있다. 통합 사이트 분석에 민감한 조직 배양 세포의 외인성 바이러스 감염을 포함하여 전체 프로토콜에 따라서 약 1-2 주에 수행 될 수있다. 이 기술의 최근의 애플리케이션은 HIV 감염 환자에서 통합 부위의 길이에 관계 분석.

서론

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숙주 세포 게놈 내로 바이러스 DNA (vDNA)의 통합은 레트로 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계이다. 통합은 안정적으로 삽입 된 프로 바이러스 (1)의 구축을 초래할 두 가지 촉매 공정을 행한다 바이러스 인테그라 제 효소 (IN)에 의해 달성된다. 서브 유닛의 IN 합체 2-4에 의해 함께 고정 단부 vDNA와 고차 intasome 형성 역전사를 통해 생성 된 선형 vDNA의 단부를 결합. 절단 IN 3'- 처리로 알려진 과정에서 서열 3 '하류 불변 5'-CA-3에서의 단부 vDNA'는 '3 오목 떠나는 각 vDNA 5-8 말단에 반응성 히드 록 실기로 종료한다. intasome이어서 호스트의 대형 어셈블리의 일부와 사전 통합 복합체 (PIC) 9-11로 알려진 바이러스 단백질과 핵으로 가져옵니다. 셀룰러 대상 DNA (tDNA)를 발생한 후, I​​N은 3'- 수산기 촉진제 vDNA를 사용UPS는 지그재그 방식으로 tDNA의 상단과 하단 가닥을 절단하고 동시에 가닥 전송 12, 13의 과정을 통해 tDNA 5 '인산 그룹에 vDNA에 합류한다.

로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 ....

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프로토콜

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바이러스 주식을 생성 (1)

주 :이 프로토콜의 습식 벤치 형태의 흐름도가도 1에 도시되어 바이러스 스톡 생산 및 조직 배양 세포의 감염 이후의 상세 설명 일반적으로 레트로 바이러스의 종류에 적용한다.. 일부 실험에서, 표적 세포는 내생 바이러스 수용체 (들)을 표현하지 않을 수 있으며, 이러한 경우에 이종 바이러스의 외피 당 단백질을 형질 pseudotyped 레트로 바이러스 입자의 구성은, 예를 들면 소포 성 구내염 바이러스 (VSV-G)로부터의 G 당 단백질 일 것이다 감염 44,45 필요합니다.

참고 :주의 사항을주의해야한다 HIV-1로 작업 할 때. 특정 지침은 기관으로부터 기관 달라질 수 있지만, 모든 바이러스 계 작업 (일반적으로 조직 배양 후드로 지칭) 전용의 조작 제한 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되어야한다. 적절한 개인 보호 장비즉, 안면 보호구, 신발 커버, 이중 장갑 층 및 전신 커버 정장은 언제나 사용할 것을 포함한다. 바이러스 관련 실험 결과 모든 액체 폐기물은 표백제 (10 % 최종 농도)으로 불 활성화되어야하고, 고체를 포함한 모든 폐기물은 폐기 전에 멸균한다.

  1. 어느 날 이전....

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결과

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표 4는 대표적인 실험 결과는 감염된 세포 배양 물로부터 통합 사이트 회수 NGS의 감도를 도시한다. 감염되지 않은 세포의 DNA 직렬 평균 모든 세포는 하나의 통합 (40)를 포함하는 감염으로부터 게놈 DNA를 희석하여 사용 하였다. 15,625 : 희석액 (1)의 최대 희석 다섯 단계로 제조 하였다. 적정 시리즈의 게놈 DNA는 초음파에 의해 조각난 또는 제한과 소화에 의해 LM-PCR 다음 MseI 및 BglII에를, 엔도 뉴 클레아했다. 고유 통합 사이트의 수뿐만 아니라, 선택된 게놈 주석에 사이트 매핑 기단의 수는, 상기 프로토콜에 따라 계산 하였다. 데이터 분석은 이론적으로 하나의 15,625에 감염 된 세포에서 준비 도서관에서 발견 한 유일한 통합 사이트 (양의 1 ~ 2 %가 깔끔한 게놈 DNA로부터 회수) 수십를 한 것으로 밝혀졌습니다.

통합 부위의 데이터 세트를 분석 할 때, 임의의 매칭 제어.......

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토론

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게놈 분포 패턴의 매핑을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 레트로 바이러스 통합 위치의 분석을위한 프로토콜은 기술되어있다. 이 프로토콜은 레트로 바이러스 감염 가능한 모든 세포 유형에 적용 가능하다. 또한, 상기 분석 파이프 라인은 6.4 × 10 -5의 MOI로 감염 개시의 게놈 DNA에 상당 희석액에서 고유 삽입 부위의 충분한 수를 복구 할 가능성 매우 민감하다. 세포의 작은 분획은 프로 바이러스 통합 항구 것이다 낮은 바이러스 부하를 포함 할 수있다 감염된 환자의 시료에 적용 할 때 감도는 프로토콜 특히 유용한다. 이 필드 36,38,41-43에서 이전의 방법론 논문과 일치,이 프로토콜의 생물 정보학 부분에 여러 단계 시퀀스 데이터의 큰 파일을 처리하기위한 사용자 정의 스크립트의 개발 혜택을 누릴 것입니다. BLAT (58)는 엄마는하지만이 프로토콜에 설명 된 유틸리티를 pping, 사용자가 적절한 대안이 될하기 위해 나비 넥타이 67 (ht.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 Engelman 실험실에서 레트로 바이러스 통합 사이트 시퀀싱을위한 NGS 프로토콜을 확립하는 것이 중요했다 우리의 동료 스티븐 휴즈와 조언 헨리 레빈에 감사하고 있습니다. 이 작품은 AI039394과 (ANE에) AI052014 및 AI060354 (AIDS 연구를위한 하버드 대학 센터) 건강의 미국 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMGibco11965-084HEK293T 세포와 호환되는 표준 세포 배양 배지
Fetal Bovine SerumThermo ScientificSH 30088.03최적의 바이러스 생산을 위해 다양한 혈청을 사전 스크리닝해야 할 수 있음
Penicillin/StreptomycinCorning30-002-ClDMEM
Phosphate-Buffered SalineMediatech21-040-CV세포 세척에 사용
트립신 EDTACorning25-053-CI조직 배양 플레이트에서 부착 세포를 분리하는 데 사용
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688 DNA 트랜스펙션 시약
0.45 µ m FiltersThermo Scientific09-740-35B바이러스 입자 함유 세포 배양 매체를 필터링하는 데 사용
Turbo DNaseAmbionAM2239바이러스 스톡에서 캐리오버 플라스미드 DNA를 분해하는 데 사용
HIV-1 p24 Antigen Capture AssayABL Inc.5447바이러스 생산 DNeasy
Blood & 조직 키트Qiagen69506세포에서 게놈 DNA를 정제하는 데 사용
SonicatorCovarisS2이 초음파 발생기 모델로 듀티 사이클, 5%; 강도, 3, 버스트당 사이클, 200, 시간, 80
뉴클레아제-프리 워터GeneMateG-3250-125샘플 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 시판되는 물을 사용하는 것이 좋습니다
QIAQuick PCR 정제 KitQiagen28106라이브러리 건설 중 DNA를 정제하는 데 사용됨
End-It DNA End-Repair KitEpicenterER81050초음파 처리된 DNA 샘플의 DNA 끝을 수리하는 데 사용됨
Klenow Fragment (3'-5' exo–)New England Biolabs (NEB)M0212SdATP와 함께 A-tail repaired DNA fragments
dATPThermo ScientificR0141Deoxyadenosine triphosphate
MseINEBR0525L게놈 DNA 절단을 위한 제한 엔도뉴클레아제
BglIINEBR0144L업스트림 HIV-1 U5 서열 T4 DNA 리가아제의 증폭을 억제하기 위한 제한 엔도뉴클레아제
NEBM0202L/6218호환 가능한 DNA 말단의 공유 결합을 위한 효소
DNA 올리고뉴클레오티드통합 DNA 기술맞춤형회사에서 올리고를 정제하도록 합니다. HPLC 정제는 DNA에 충분합니다 < 30 개의 뉴클레오티드; PAGE 정제 더 긴 DNA 
장점 2: 중합효소 혼합물Clontech639202)용 DNA 중합효소를 함유한 상업용 혼합물
ThermoScientificR01814가지 화학물질을 멸균수로 얼음 위에 희석하여 중간 농도인 2.5mM에 도달합니다. dNTP
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000DNA 농도
측정을 위한 분광광도계Qubit 형광측정기Life TechnologiesQubit® 3.0통합 사이트 라이브러리 DNA 농도를 확인하는 데 사용되는 형광측정기
2200 TapeStation SystemAgilentG2964AA통합 사이트 라이브러리 DNA 크기 분포를 확인하는 테이프 기반 분석
MiSeqIlluminaSY-410-1003NGS에 사용
에 첨가할 항생제초 . PCR dNTP(100mM 용액:

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S.....

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재인쇄 및 허가

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Retroviral Integration SitesLigation mediated PCRNext generation SequencingGenomic DNA MappingRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

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