레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

요약

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

초록

모두 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 서명 통합 환경 설정. 여기서는 결찰 매개 PCR (LM-PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 레트로 바이러스 통합 위치의 다양한 라이브러리 (1)의 생성에 대한 상세한 프로토콜, (2) 각각의 바이러스에의 게놈 위치에 맵핑을 제시 BEDTools 접합을 이용하고, (3)에 대한 통계 관련 데이터를 분석하는 호스트. 감염된 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해에 의해 분열된다. 적합한 DNA 최종 복구 한 후, 이중 가닥의 링커는 DNA 종료에 라이 게이션하고, 반 중첩 PCR은 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 단부와 결찰 링커 DNA 모두에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 증폭 된 PCR 프라이머는 별도의 어댑터 결찰에 대한 요구 사항을 부정, NGS 동안 DNA 클러스터링에 필요한 시퀀스를 수행한다. 품질 관리 (QC)의 DNA 단편 크기 분포를 평가하고 적응 수행NGS 이전에 DNA의 결합을 어. 시퀀스 출력 파일 LTR 함유 판독 필터링되고 LTR 링커 정의 서열 얻어 자른된다. 트림 숙주 세포 서열은 BLAT를 사용하여 참조 게놈 맵핑하고 참조 게놈의 독특한 지점에 최소 97 % 동일성 필터링된다. 고유 한 통합 사이트는 다양한 게놈 기능에 인접한 염기 (NT) 순서 및 유통 기준에 대해 자세히 조사하고 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 매우 복잡한 통합 사이트 라이브러리 사흘 게놈 DNA로부터 구성 될 수있다. 통합 사이트 분석에 민감한 조직 배양 세포의 외인성 바이러스 감염을 포함하여 전체 프로토콜에 따라서 약 1-2 주에 수행 될 수있다. 이 기술의 최근의 애플리케이션은 HIV 감염 환자에서 통합 부위의 길이에 관계 분석.

서론

숙주 세포 게놈 내로 바이러스 DNA (vDNA)의 통합은 레트로 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계이다. 통합은 안정적으로 삽입 된 프로 바이러스 ^(1)의 구축을 초래할 두 가지 촉매 공정을 행한다 바이러스 인테그라 제 효소 (IN)에 의해 달성된다. 서브 유닛의 IN 합체 ^2-4에 의해 함께 고정 단부 vDNA와 고차 intasome 형성 역전사를 통해 생성 된 선형 vDNA의 단부를 결합. 절단 IN 3'- 처리로 알려진 과정에서 서열 3 '하류 불변 5'-CA-3에서의 단부 vDNA'는 '3 오목 떠나는 각 vDNA ^5-8 말단에 반응성 히드 록 실기로 종료한다. intasome이어서 호스트의 대형 어셈블리의 일부와 사전 통합 복합체 (PIC) ^9-11로 알려진 바이러스 단백질과 핵으로 가져옵니다. 셀룰러 대상 DNA (tDNA)를 발생한 후, I​​N은 3'- 수산기 촉진제 vDNA를 사용UPS는 지그재그 방식으로 tDNA의 상단과 하단 가닥을 절단하고 동시에 가닥 전송 ^{12, 13의} 과정을 통해 tDNA 5 '인산 그룹에 vDNA에 합류한다.

로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 통합 사이트 환경 설정. 로컬, 합의 통합 사이트는 약 다섯 vDNA 삽입 사이트 ^{14, 15에서} 상류 BP와 하류 10에서 걸쳐 약하게 보존 팔린 드롬 tDNA 시퀀스로 구성되어 있습니다. 전 세계적으로 레트로 바이러스는 특정 염색질 주석 ^{(16)을 대상으로.} 엡실론, 렌티 및 spuma을 통해 알파 - 일곱 가지 레트로 바이러스 장군이있다. gammaretroviruses 우선적으로 전사 시작 사이트 (TSSs) 및 활성 증강 영역 ^{18 ~ 20에} 통합하면서 HIV-1을 포함 렌티 바이러스는 적극적으로 전사 유전자 ^(17)의 신체 내에서 통합을 선호. 대조적으로, spumavirus 강하게 heterochrom으로 바이어스이러한 유전자 가난한 얇은 관련 도메인 ⁽²¹⁾ 등의 ATIC 지역. 지역 tDNA 기본 환경 설정 IN과 tDNA ^13,22,23 사이의 핵 단백질 연락처의 특정 네트워크에 의해 결정 큰 부분에 있습니다. 렌티 바이러스 및 gammaretroviruses를 들어, 게놈 주석에 통합 상대는 IN과 동족 세포 요인 ^24-27 사이의 상호 작용에 의해 지배 큰 부분이다. 요인의 상호 작용 ^{25-27,29-32 각각} 로컬 및 글로벌 수준의 통합을 재 타겟팅 전략을 입증 IN-호스트 인 - tDNA 상호 작용 네트워크 ^{13,22,23,28의} 세부 사항을 변경 및 중단하거나 다시 엔지니어링.

레트로 바이러스 통합 사이트 카탈로그 사용한 DNA 시퀀싱 방법의 힘은 지난 수십 년 동안 상당히 증가 하였다. 통합 사이트는 연구 ^{33, 34} 당 고유 한 사이트의 단지 소수를 산출하기 힘든 정화 및 수동 복제 기술을 사용하여 선구적인 작업에 복구되었다.천 ^(17)에 수백로 증가 외인성 조직 배양 세포 감염에서 회복 사이트의 수와 필드 변환 인간 및 마우스 초안 게놈 개별 통합 사이트 매핑하는 기능 LTR 호스트 DNA 접합부 LM-PCR 증폭의 조합 ^18. NGS 방법과 LM-PCR의 최근 조합 라이브러리 깊이 폭등을 보냈습니다. 라이브러리 고유 시퀀스 ^19-21,39 수백만 얻을 수 DNA 클러스터링의 사용을 통해 시퀀싱하는 동안 특히 pyrosequencing는 수십 고유 통합 사이트 ^30,35-38 수천 정도의 수득 하였다. 여기에서 우리는 증폭 DNA 클러스터링 NGS를 사용하여 레트로 바이러스 통합 사이트를 시퀀싱에 최적화 된 LM-PCR 프로토콜을 설명합니다. 상기 방법은 이에 sequen 전에 추가 어댑터에 결찰 공정에 대한 요구를 배제, 증폭 된 DNA 분자에 따라서 직접 PCR 프라이머에 어댑터 서열을 요구하고 통합한다^(40)을 향. 생물 정보학 분석 파이프 라인은, 게놈 기능을 관련의 독특한 통합 사이트 매핑 LTR-호스트 DNA 접합에 대한 원시 시퀀싱 데이터의 분석에서, 또한 일반적으로 설명한다. 이 분야에서 종래 방법론 ^36,38,41-43 프로토콜에서 설정된 우선 순위에 따라서, 사용자는 스크립트 정보학 파이프 라인의 특정 단계의 완료를 돕기 위해 개발 될 수있다. 유틸리티 및 프로토콜의 민감도 감염 대략 다수 1.0 (MOI)뿐만 아니라,이 DNA의 적정 계열에 감염된 조직 배양 세포에서 HIV-1 삽입 부위를 증폭하여 시퀀싱 한 매핑 대표 데이터로 도시되어 6.4 × 10 ^-5의 대략 동등한 MOI을 얻었다 15625 :에 감염되지 않은 세포의 DNA를 희석 한 최대 희석 단계를 5 배.

프로토콜

바이러스 주식을 생성 (1)

주 :이 프로토콜의 습식 벤치 형태의 흐름도가도 1에 도시되어 바이러스 스톡 생산 및 조직 배양 세포의 감염 이후의 상세 설명 일반적으로 레트로 바이러스의 종류에 적용한다.. 일부 실험에서, 표적 세포는 내생 바이러스 수용체 (들)을 표현하지 않을 수 있으며, 이러한 경우에 이종 바이러스의 외피 당 단백질을 형질 pseudotyped 레트로 바이러스 입자의 구성은, 예를 들면 소포 성 구내염 바이러스 (VSV-G)로부터의 G 당 단백질 일 것이다 감염 ^44,45 필요합니다.

참고 :주의 사항을주의해야한다 HIV-1로 작업 할 때. 특정 지침은 기관으로부터 기관 달라질 수 있지만, 모든 바이러스 계 작업 (일반적으로 조직 배양 후드로 지칭) 전용의 조작 제한 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되어야한다. 적절한 개인 보호 장비즉, 안면 보호구, 신발 커버, 이중 장갑 층 및 전신 커버 정장은 언제나 사용할 것을 포함한다. 바이러스 관련 실험 결과 모든 액체 폐기물은 표백제 (10 % 최종 농도)으로 불 활성화되어야하고, 고체를 포함한 모든 폐기물은 폐기 전에 멸균한다.

1. 어느 날 이전에 형질에, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 1 %로 보충 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 10 ㎖에 판 3.3 × 10 ⁶ HEK293T 세포 (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / 오 100mm 요리의 각 ml의 주).
   참고 : 보충되는-DMEM가이 시점에서 DMEM-FPS라고합니다.
2. 후속 날, 상업적으로 이용 가능한 형질 전환 시약 또는 인산 칼슘을 사용하여 VSV-G 식 구조의 1 μg의 봉투 삭제 된 단일 라운드 벡터의 10 전체 길이 레트로 바이러스 분자 클론을 운반하는 플라스미드의 μg의 9 μg의와 세포를 형질.
   1. 는 C를 품어5 % CO ₂ 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서의 ELL (이하,이 상태는 "조직 배양 인큐베이터"라 함). 후 약 48 시간은 부피 피펫을 사용하여 바이러스를 포함하는 세포 미디어를 수확 중력 흐름에 의해 0.45 μm의 필터를 통해 전달합니다.
   2. 4 ℃에서 1 시간 동안 200,000 XG에서 초 원심 분리하여 바이러스를 집중한다. 20 U DNase의를 포함 500 μL의 DMEM-FPS에서 바이러스 펠렛을 재현 탁하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
      주 : DNase의 단계는 상기 형질 전환 과정에서 지속 플라스미드 DNA의 정면을 제거함으로써 원하지 않는 플라스미드 서열의 회수를 줄이는 것을 돕는다.
3. 제조업체의 지침에 따라 같은 HIV-1 P24 항원 캡처 키트를 사용하여 P24 농도 ^{(46)을 결정합니다.}
   주 : 바이러스 농도는 역전사 효소 활성 분석 ^{(47, 48)에} 의해 결정될 수있다. 대안으로, 기능적 바이러스의 레벨 수MOI를 측정함으로써 결정된다. 이것은 가장 쉽게 강화 된 녹색 형광 단백질 형광 리포터 유전자를 표현 바이러스에 정렬 형광 활성화 된 셀을 사용하여 수행됩니다. 최적화 된 세포주로 감염의 동일한 레벨을 지원하지 않을 일차 전지 작업시 MOI 판정이 특히 유용 할 수있다.

바이러스 2.을 감염 세포

1. 플레이트 3.0 × 10 ⁵ HEK293T의 2.5 ml의 DMEM-FPS에서 6 웰 플레이트에 웰 당 세포 조직 문화 인큐베이터에서 하룻밤 배양한다.
   주 :이 프로토콜 회수 고유 삽입 부위의 수는 세포 감염에 사용 된 활성 바이러스의 양의 수에 정비례한다.
2. 조직 배양 인큐베이터에서 2 시간 동안 500 ㎕의 신선한 DMEM-FPS의 최종 부피 500 ng를 / ㎖의 최종 바이러스 P24 농도로 세포를 감염 후 2 ml의 DMEM-FPS는 웰 당 37 ℃로 미리 가온 추가 배양을 계속합니다.
3. 에서감염 후 48 시간이 매체를 제거하고 2 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)으로 세포를 세척 하였다. 0.5 ㎖의 트립신 EDTA는 37 ° C로 미리 예열, 몇 초 후 시각적으로 세포 탈락의 우물을 검사 추가.
4. 2 ml의 사전 예열 DMEM-FPS를 추가하고 ~ 부피 피펫 10 회 / 아래로 피펫까지 부드럽게하여 세포를 재현 탁. DMEM-FPS 예열 18 mL를 함유 75cm ² 조직 배양 플라스크에 상기 용액을 전송하고, 조직 배양 배양기에서 세포를 배양한다.
5. 감염의 시작에서 최소 오일 후, 5 ml의 PBS로 세척, 미디어를 제거하여 세포를 수집 2ml를 미리 예열 트립신 EDTA를 추가하고 피펫 5 ml를 미리 예열 DMEM-FPS로 재현 탁. 2,500 × g으로 실온에서 5 분 동안 상기 용액을 원심 분리하고, 상층 액을 제거한다.
   참고 : 약 48 시간 게시물 감염 ^49,50에서 이러한 조건의 고원에서 통합이, 문화의 추가 삼일이 sufficientl해야하지만Y는 셀 기반 DNA의 재조합 바이러스 - 매개 autointegration 결과 통합되지 않은 DNA 분자의 농도를 희석한다.
6. 시판되는 키트 (예 ^{51 참조)를} 사용하여 세포 펠릿으로부터 게놈 DNA를 추출한다. 10 mM 트리스 - 염산 200 μL, pH가 8.5으로 제공되는 이온 교환 컬럼으로부터 DNA를 용출시켰다.
   주 : 세포 분취 전에 NGS에 적합한 바이러스 감염을 보장하는 감염성 분석을 위해 48 시간의 감염 후 (단계 230)에 배분한다.

초음파 처리하거나 제한 효소 다이제스트 3. 조각 게놈의 DNA

참고 : 사실상 시퀀스 독립적 인 방식으로 초음파 조각 게놈 DNA 및 따라서 조각의 바람직한 모드 일 때 낮은 기대 회수율과 시퀀싱 샘플 (예를 들어, 상대적으로 낮은 MOI에서 시작 감염 환자의 세포 또는 감염). 또한, 초음파 하나가 이상적 상대의 PCR 중복을 구별 할 수 있습니다중요 같은 사이트에서 고유 한 통합에서 큘라 통합 사이트 순서는, 감염된 환자 (아래 11 단계 참조) ^{39,52-54에서} 프로 바이러스 함유 세포의 클론 확장을 구별합니다.
주 : DNA는 LM-PCR 동안 내부 바이러스 서열의 증폭을 감소시키는 상류 LTR에서 바로 하류 절단해야합니다. 상류 U5 서열로부터 43 bp의 다운 스트림 거짓말과 그 MseI 생성 된 DNA와 이후의 결찰에 대한 호환되지 않는 제한 효소 BglII에 많은 HIV-1 균주 (그림 1B) 잘 작동을 종료합니다. 초음파에 의해 DNA를 제조 할 때, 내부 리빙 제한 효소 링커 결찰 후 적용한다 (- E 4.3 이하 단계도 1C 참조).

1. 초음파를 들어, 120 μL의 최종 부피 클레아없는 물에서 게놈 DNA 10 μg의 섞는다. (500 bp의 평균 휴식 크기에 대한 매개 변수를 사용하여 다음 파라 두 라운드를 초음파 처리m : 듀티 사이클 : 5 %; 강도 : 3; 버스트 당 사이클 : 200; 시간 : 80 초).
2. PCR 정제 키트를 사용하여 초음파 처리 된 DNA를 정제 하였다. DNA의 DNA는 최종 수리 키트를 사용하여 단부 복구 및 PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제. A-꼬리 클레 나우 엑소을 사용하여 DNA ^- 효소는 PCR 정제 키트를 사용하여 꼬리 A-DNA를 정제. 키트 사용의 추가 내용은 ^{51, 52을} 참조하십시오.
3. 제한 효소 분해를 들어,뿐만 아니라, 제조 업체 및 5'-TA의 돌출을 생성 (각 100 U) 효소의 칵테일에서 제공하는 버퍼 100 μL의 볼륨에서 하룻밤 37 ° C에서 게놈 DNA의 10 μg의 절단 이러한 BglII에 호환되지 않는 효소 상류 바이러스 LTR에서 다운 스트림이 절단. PCR 정제 키트를 사용하여 다음날 DNA를 정제 하였다.
   주 : 제한 효소 중에 단말에서 절단 안 ~ 다 LM-PCR 프로토콜로 증폭 된 DNA 바이러스 말단의 30 염기쌍. 이 프로토콜은 특별히 U5 증폭HIV-1 DNA의 끝.

4. 어닐링 링커 올리고 뉴클레오티드와 파편이 게놈 DNA에 결찰

참고 : 위의 DNA 단편 (이 프로토콜에서 이용되는 올리고 뉴클레오티드 서열은 표 1 참조)과 호환되는 돌출부를 포함하는 비대칭 링커를 준비한다. MseI 소화 DNA에 대한 링커가 호환 5'-TA 오버행 (그림 1)를 포함해야합니다 동안 링커는 호환 T-3 '오버행을 포함해야합니다 초음파 DNA와 함께 사용할 수 있습니다. 짧은 링커 가닥 추가적으로 관심 DNA 향해 연속 증폭 반응을 제한하기 위해, 이러한 3'-아민 등의 비 신축 화학적 변형을 함유한다.
주 : 병렬로 상이한 통합 사이트 라이브러리를 제조 할 때 및 / 또는 동일한 순서 실행에 다중화 고유 샘플은, 샘플 간 contamin 대한 가능성을 제한하기 위해 각 샘플에 대해 고유 한 링커를 사용하는 것이 될 때PCR 동안 ATION. 이것은 부가 반 중첩 PCR (후술 됨) 동안 각 샘플에 대해 고유 링커 프라이머의 사용을 의미한다. 고유 링커 가닥 프라이머 및 링커는 유사한 전체적인 %의 GC 함량 해당 돌출 위치를 유지하면서 표 1에 열거 된 올리고 뉴클레오타이드 링커 스크램블링 시퀀스에 의해 설계 될 수있다.

1. 90 ℃로 가온하여 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0-0.1 mM의 EDTA (각 올리고 뉴클레오티드의 10 μM의 최종 농도) 35 μL에 짧고 긴 링커 가닥을 어닐링 천천히 1 ° 씩 실온으로 냉각 분당 C.
2. 1.5 μM 결찰 링커, 1 μg의 DNA 단편화, 50 μL에 800 U T4 DNA 리가 아제를 포함하는 게놈 DNA 샘플 당 적어도 4 개의 병렬 라이 게이션 반응을 준비한다. 12 ℃에서 하룻밤 결찰. PCR 정제 키트 다음날 정제.
3. 초음파 분해하여 제조 된 샘플 들어 restric 100 U로 정제하여 연결 반응 다이제스트제조업체에서 다운 스트림 (HIV-1에 대한 예를 들어, BglII에) 상류 LTR에서 절단 하룻밤 조건을 권장하는 것이 기 효소. PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제 하였다.

세미 중첩 된 PCR 5. 증폭 바이러스 LTR-호스트 게놈 DNA 접합

참고 : 복구 된 연결 반응의 DNA 농도에 따라 최적의 라이브러리 다양성 적어도 4-8 병렬 PCR들을 확보하려면, 모두 PCR 라운드에 대한 각 샘플에 대해 준비를해야합니다. DNA 템플릿 농도는 분광 광도법에 의해 정량화되어야​​한다. 이 PCR 프로토콜의 제 1 및 제 2 라운드 중첩 LTR 특이 적 프라이머를 사용하지만, 동일한 링커 특정 프라이머 모두 발사 (표 1)에 사용된다. 두 번째 라운드 LTR 특정 프라이머와 DNA 클러스터링뿐만 아니라 시퀀싱 프라이머 결합 부위에 대한 링커 특정 프라이머 인코딩 어댑터 시퀀스. 중첩 LTR 특이 프라이머는 WH, 6 NT 인덱스 시퀀스를 인코딩무형 문화 유산은 동일한 순서 실행 내에서 다중 라이브러리에 대한 다른 프라이머 사이에서 변화 될 수있다.

1. 표 2에 열거 된 튜브 당 성분을 함유 첫 라운드 PCR들을 준비합니다.
   주 : 링커 특정 프라이머 링커의 말단 3 '에서 15-16 bp의 상류에 위치한'말단 53 ° C, 45 %의 GC 함량, 및 (3)의 용융 온도에 상보성 22 NT를 품고 다른 링커 긴 가닥 (표 1). 첫 번째 라운드 27 NT LTR 프라이머는 59 ° C, 48 %의 GC 함량의 용융 온도를 갖고, 그것의 3 '단부는 HIV-1 U5 말단에서 34 bp의 상류에 위치한다. HIV-1 LTR에 상보 번째 라운드 26 NT LTR 프라이머의 영역은 60 ° C, 50 %의 GC 함량, 및 3 '말단의 용융 온도를 갖고, 바이러스 U5에서 18 bp의 상류에 위치한 말단. 이 올리고 뉴클레오티드 용융 온도와 GC 함량이 매개 변수를 사용자 경우 모방 것을 권장변경된 시퀀스 ⁽²¹⁾ (다른 레트로 바이러스와 함께 사용 포함), 디자인 PCR 프라이머.
2. 다음과 같은 열 순환기 매개 변수 아래 첫 번째 PCR 라운드를 실행 한주기 : 2 분 94 ° C; 30 회 : 15 초 동안 94 ° C, 30 초, 45 초 동안 68 ° C, 55 ° C; 한 사이클 : 10 분 동안 68 ° C.
3. 반응을 수영장과 PCR 정제 키트를 사용하여 정화. . 표 3에 따라, 튜브 당 성분을 함유하는 두 번째 라운드의 PCR 준비 단계 5.2에 기재된 열 순환기 매개 변수를 사용하여 PCR의 두 번째 라운드를 실행. 반응을 풀 제조업체의 지시에 따라 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제.
   주 : DNA 클러스터링 NGS와 호환 권장 인덱스 시퀀스의 다양한 ⁷¹ 사용할 수 있습니다.

6. 수행 QC 및 NGS (일반적으로 시퀀싱 시설에 의해 완료)

1. (QC는 분석 1) 확인 단계 5.3 라이브러리 DNA 농도의 불소를 사용하여미터 ^55. 간단히, 200 ㎕의 핵산 분해 효소가없는 물을 최종 부피 기준 및 실험 샘플을 준비합니다. 보텍스 튜브 2-3 초, 2 분 동안 실온에서 배양한다, 다음에 형광 샘플을 읽었다.
   참고 : 시료 15 μL의 최소 볼륨에서 2 nM의 라이브러리 DNA의 최소 농도를 포함해야합니다.
2. (QC 분석 # 2)의 테이프 계 분석 ^(56)를 사용하여 DNA 단편 크기 분포를 확인한다.
   참고 : 이상적인 분포의 길이가 약 500 염기쌍을 중심으로 비교적 넓은 DNA 피크입니다. 물질의 상당한 양의 1 KB 이상인 경우, 이는 클러스터링 동안 다리의 증폭을 저해 할 DNA 종 이상을 제거하는 사이즈 선택 절차를 통합하는 것을 권장한다. 중요한 피크가 약 100 bp의 200 명백한 경우 이와는 대조적으로, 프라이머 이량 체는 PCR 동안 형성되었을 수 있습니다. 이 경우에, 과정은 프라이머 이량 체의 형성을 최소화하기 위하여 최적화되어야한다.
3. (QC 분석 # 3) 공동정량 PCR ^(57)에 의해 DNA 라이브러리에 어댑터의 적절한 결합을 nfirm.
4. 제조업체의 응용 프로그램 문헌 다음 NGS를 수행합니다. 10 %의 스파이크에 활용 (w / w) 시퀀싱 런에 균형베이스 조성물을 제공하여 실시간 품질 메트릭을 최적화 ΦX174 DNA.
   참고 : 통합 사이트 시퀀싱 실험은 일반적으로 단일 엔드 (150) BP (SE150) 또는 쌍 엔드 (150) BP (PE150) 시퀀싱을 실시한다. PE150 각 DNA 분자의 링커 접속점을 포착하는 것이 특히 유용하다 (예를 들어, 숙주 세포 클론 확장 증거 삽입 부위를 면밀히 경우).

7. LTR 함유 시퀀스, 자르기 멀리 LTR 및 링커 시퀀스에 대한 시퀀싱 데이터를 구문 분석하는 사용자 정의 파이썬 또는 PERL 스크립트를 사용하여 BLAT과 참조 게놈에지도

1. 순서 읽기 LTR 함유 거리에 호스트 게놈 DNA 서열에서 작물 LTR와 링커 서열 등에 대한 검사 FASTA 파일새로운 FASTA 파일이 시퀀스를 내보낼 수 있습니다. 지도 참조 게놈 모두 읽어립니다 (예를 들면 인간 게놈 버전 hg19 또는 GRCh38) 및 출력 통합 사이트와 BLAT ^(58)를 사용하여 바이러스 게놈은 다음 설정을 사용하여 별도의 .txt 파일로 내 보낸 좌표 :
   스텝 사이즈 = 6, minIdentity = 97, 및 maxIntron = 0
2. 에이즈-1 게놈 및 다른 시퀀스 매핑합니다 (LTR 끝이 내부 바이러스 DNA 게놈의 영역으로 통합했다고 즉 증거를) autointegrations을 제거, 파일이 .txt BLAT 출력을 구문 분석, 파일 .txt를 별도의 출력을 생성하는 모든 중복 된 통합 사이트는 하나의 고유 한 좌표 안타에 응축되어있다.

8. FASTA 파일이 변환, 통합 주변 15 Nt 개의 간격을 포함하는 .bed 파일을 생성하고 기본 환경 설정이 통합 사이트 주변 표시 할 순서 로고를 구축

1. 기지의 간격을 나열 .bed 파일 만들기각각의 통합 사이트입니다. 적어도 15 기지 (5 업스트림 및 다운 스트림 10)가 순서 로고 생성을 위해 제안된다. BEDTools ^59에서 fastaFromBed 기능과 명령을 사용하여 이러한 .bed 파일에서 FASTA 파일을 생성합니다 :
   fastaFromBed -fi / 디렉토리 /에 / 참조 / 유전체 / -name -s - 침대 15_base_pair_file.bed -Fo output_file.fasta
   참고 : 불변 바이러스 5'-CA-3 '뉴클레오티드는 통합시 DNA를 호스팅에 가입하고, 세포 DNA에 LTR 말단의 접합을 확인하는 것은 선의의 통합 사이트를 식별하는 중요한 초기 필터입니다. 우리는 추가로 실험 결과를 확인하기 위해 숙주 DNA 서열의 집단에서 서열 로고를 컴파일한다. 레트로 바이러스들은 통합 사이트 ^{14,15 주변} 기반 서명 환경 디스플레이로서, 상기 시퀀스 로고는 비 - 상동 DNA 등의 다른 재조합 기법에 비해 IN 매개 통합하여 매핑 된 게놈 부위가 발생한 것을 확인하는 역할^{60, 61에} 합류 끝.
2. 사용 WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)를 FASTA 파일에서 순서 로고를 만들 수 있습니다. 클릭 FASTA 파일을 업로드 '파일 선택', 다음과 같은 설정을 사용 : 출력 형식, PDF (벡터); 로고 크기, 큰; 첫 번째 위치 번호, -5; 로고 범위가 -5 내지 5; Y 축 배율 0.1, Y 축 TIC 간격 0.5, 컬러 방식, 클래식 (NA).

9. 샘플 교차 오염을 확인, 중앙 자료 쌍 파일을 .bed 작성하고 타당한 게놈 기능에 상대 고유 한 통합 사이트의 분포지도

1. 레트로 바이러스는 통합 tDNA 가닥 걸쳐 지그재그 방식으로 발생하기 때문에, 게놈 기능 게놈 분포 대하여 올바른 매핑 목표 부위 중복 중앙 BP를 반영하여 삽입 부위의 정확한 좌표를 조정한다.
   1. 따라서, 5 BP는 HIV-1과 같은 바이러스 복제를 들면, 내가로부터의 오프셋 (offset) 중앙 BP와 .bed 파일을 생성플러스 가닥에 통합 매핑 다운 스트림이 기지와 마이너스 가닥에 통합 매핑 상류 두 기지로 ntegration 사이트입니다.
2. 중앙 bp의 두 개의 서로 다른 샘플이 명령에 따라 파일을 .bed 교차하는 BEDTools 기능을 교차 사용하여 다른 라이브러리에 공통 통합 사이트의 수를 계산, 샘플 교차 오염을 확인하려면 :
   bedtools 교차 -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt
3. 다음 명령을 사용하여 두 개의 라이브러리에 공통 사이트의 정확한 수를 정량화하기 위해 출력 overlap1v2.txt 파일 내 라인 수를 카운트 :
   화장실 -l overlap1v2.txt
4. 예를 들어 http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/da합니다 (UCSC 게놈 주석 데이터베이스에서 통합 사이트 매핑에 사용 된 참조 게놈의 버전에 나온 RefSeq 주석 .bed 파일을 다운로드tabase) ^62.
   1. 나온 RefSeq이 명령 다음 파일을 .bed와 샘플에 대해 생성 된 중앙 염기쌍 .bed 파일을 교차하는 BEDTools 기능을 교차 사용하여 나온 RefSeq 유전자 내에 통합 사이트의 수를 계산한다 :
      bedtools 교차 -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
5. 다음 명령을 사용하여 나온 RefSeq 유전자 떨어지는 위치의 정확한 수를 정량화하기 위해 출력 RefSeq_sample1.bed 파일 내 라인 수를 카운트 :
   화장실 -l RefSeq_sample1.bed
6. 반복 간격이 파일을 사용할 수 .bed있는 관심의 다른 주석에 매핑 통합 사이트 9.3 및 9.4 단계를 반복합니다. 단계 9.4의 지시에 따라 UCSC 게놈 주석 데이터베이스에서 관심의 참조 게놈에 대한 가장 최신의 CpG 섬 주석 .bed 파일을 다운로드합니다.
   1. 특정 디 내에 삽입 부위의 수를 계산자세 BEDTools 창 기능을 사용하여이 명령을 따라의 CpG 섬 (이 예에서 도시는 5킬로바이트 창입니다)
      central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed 2500 -w bedtools 창
7. 다음 명령을 사용하여 상류 또는 하류의 CpG 섬 2.5 KB 내에 위치의 정확한 수를 정량화하기 위해 출력 CpG_sample1.bed 파일 내 라인 수를 카운트 :
   화장실 -l CpG_sample1.bed
8. 반복 9.6 및 매핑 통합 사이트 9.7 근처 TSSs 단계를 반복합니다. 게놈은 하나 이상의 유전자 매핑 좌표 RefSeq.bed 파일의 다른 버전을 생성하는 것은 그 위치에 단일 유전자의 존재를 반영하기 위해 조정되었다. 이 통합 사이트를 주변의 유전자 밀도의 과대 평가를 방지 할 수 있습니다. BEDTools 윈도우 함수를 이용하고이 명령에 따라 각각의 통합 부위를 둘러싸는 1 메가 비트 영역의 유전자 밀도를 계산한다 :
   bedtools 창 -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
9. 이 명령을 수행하여 데이터 세트에있는 모든 통합에 대한 평균 유전자 밀도를 계산한다 :
   AWK '(합계 + = $ 7) END (인쇄 "평균 =", 합 / NR)'GeneDensity_sample1.bed

10. 통계적으로 R에서 피셔의 정확한 테스트와 두 개의 꼬리 윌 콕슨 순위 합 테스트를 두 개의 꼬리 사용하여 샘플 중 통합 사이트 배포 비교

나온 RefSeq 유전자 내 또는의 CpG 섬 또는 TSSs의 창 내에 삽입 부위의 비율을 비교하기 위해 사용 피셔의 정확한 시험, 그러나 삽입 부위 주변 유전자 밀도 분포를 비교 윌 콕슨 순위 합 시험을 사용하여 참고. 는 R 프로그램은 http://www.r-project.org/에서 확인할 수있다.
피셔의 정확한 테스트를 두 꼬리 :

1. CR, 단계 9.4 및 9.7의 지침에 따라 계산 된 숫자를 사용하여관찰 발생이 명령을 수행하여 사이트에 남아있는 대 (주석 내에서 또는 주석을 둘러싼 창에서 통합)의 R의 각 비교 행렬을 eate :
   (annotation_of_interest <- 매트릭스 (C (SampleA에서 #, SampleA 번호가 남아있는, SampleB 번호가 남아 SampleB 번호에), nrow = 2, dimnames = 목록 (다 ( '센터', '나머지'), C ( 'SampleA' 'SampleB'))))
2. 다음 명령을 사용하여 피셔의 정확한 시험이 꼬리에 의한 비교에 대한 P 값을 계산한다 :
   fisher.test (annotation_of_interest, 대안 = 'two.sided') $의 p.value
   윌 콕슨 순위 합 테스트를 두 꼬리 :
3. 각 열은 정상 세포의 샘플 이름을 포함하는 탭으로 구분 된 .txt 인 파일을 생성한다 (단계 9.9에서 생성 된 .bed 파일에서 얻은) 그 라이브러리에있는 모든 통합 사이트에 대한 유전자 밀도 값 아래 하였다. 다음 명령을 사용하여 R에이 탭으로 구분 된 .txt 인 파일 가져 오기 및 NA올바른 파일 디렉토리로 vigating :
   FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), 헤더 = T는, check.names는 = FALSE) = TRUE 9 월은 = '의 t'를 입력)
4. 다음 명령을 사용하여 두 개의 꼬리 윌 콕슨 순위 합 시험에 의한 비교에 대한 P 값을 계산한다 :
   wilcox.test (파일 이름 $ 쌍 SampleA, FILENAME $ SampleB, 대안 = 'two.sided'= F, 정확한 = T) $의 p.value
   주 : P 값은 프로그램에 의해 반환되는 제로 이후에만 R의 특정 (매우 낮은) 한계까지 계산 될 수있다. R에서 P = 0을 수득 대규모 다른 샘플은 <2.2 × 10 ^-308로 P의 값을 추정한다.

11. 통합 바이러스 성 DNA를 포함하는 세포의 클론 확장의 증거에 대한 원시 시퀀싱 데이터를 검사

주 : 작은 전위 기준 게놈 동일한 NT 둘 이상의 통합이 필요하다. 대안의 단일tegration 이벤트로 인해 라이브러리 준비하는 동안 및 / 또는 DNA 준비하기 전에 세포 복제에 의한 PCR의 사용에 시퀀싱 데이터의 중복 존재가 될 수 있습니다. HIV 감염 환자에서 게놈 DNA에 대한 최근의 분석은 동일 통합 사이트 ^{52-54을 포함하는} DNA 서열에서 (단 전에 PCR에 발생할 수있다) 고유 초음파 전단 점 / 링커 어태치먼트 포인트를 식별함으로써 이러한 가능성을 구별 하였다. 클론 적 확장 셀들 내에 숨겨 proviruses는 잠상 바이러스 저장조에 기여하고, 따라서 인간 환자의 삽입 부위를 연구 할 때 그 팽창 레벨을 특성화하기 위해 특히 중요한 여부에 대한 논쟁은 현재있다.

1. 단계 8.1에 기재된 절차와 유사하게,이 경우 연장 된 염기의 간격으로 나열 .bed 파일을 생성 (25)은 NT 하류 각 고유 통합 사이트 (상류 염기는 여기에서 불필요). 의 지침에 따라 (이 .bed 파일에서 FASTA 파일을 생성BEDTools에서 fastaFromBed 기능을 사용하여이 명령을 수행하여 단계 8.1)
   fastaFromBed -fi / 디렉토리 /에 / 참조 / 유전체 / -name -s - 침대 25_base_pair_file.bed -Fo output_file.fasta
   참고 :이 클론 확장 분석을 위해 각 통합 사이트에서 NT 하류 적어도 25를 추출하는 것이 좋습니다 검색 각각의 특이성을 개선하기 위해.
2. 바람직하게는 사용자 정의 스크립트를 사용하여, 각각의 고유 한 통합 사이트에서 NT 하류 (25)에 정확히 일치를 포함하는 모든 문자열에 대한 원시 시퀀스 데이터 FASTA 파일을 검색하고 새로운 파일로 이러한 시퀀스를 입금. 원시 문자열에서 LTR와 링커 서열을 낸다. 문자열이 NT를 중복 적어도 20를 공유하는 경우, 역 보완을 읽고 자신의 READ1 쌍 READ2 문자열을 할당 한 후 LTR와 링커 서열을 트리밍하고, 변환하여 읽어 PE 순서를 병합합니다.
3. 각 축적 사이트 블록의 링커 어태치먼트 포인트 스캔. 클론 적 확장 "각 통합을 분류 및# 34; 링커 어태치먼트 포인트가 있는지 ≥3 떨어져 비점.
   참고 서열을 병합없는 클론 확장 분석 프로토콜 ^(52)을 설명 하였지만 읽는다.
   주 : 초음파에 의해 동일한 위치에서 게놈의 분열은 클론 확장의 정도의 과소 평가로 연결, 및 방법 ^{63, 64 설명} 된 결과 실험 바이어스를 해결하려면.

결과

표 4는 대표적인 실험 결과는 감염된 세포 배양 물로부터 통합 사이트 회수 NGS의 감도를 도시한다. 감염되지 않은 세포의 DNA 직렬 평균 모든 세포는 하나의 통합 ^(40)를 포함하는 감염으로부터 게놈 DNA를 희석하여 사용 하였다. 15,625 : 희석액 (1)의 최대 희석 다섯 단계로 제조 하였다. 적정 시리즈의 게놈 DNA는 초음파에 의해 조각난 또는 제한과 소화에 의해 LM-PCR 다음 MseI 및 BglII에를, 엔도 뉴 클레아했다. 고유 통합 사이트의 수뿐만 아니라, 선택된 게놈 주석에 사이트 매핑 기단의 수는, 상기 프로토콜에 따라 계산 하였다. 데이터 분석은 이론적으로 하나의 15,625에 감염 된 세포에서 준비 도서관에서 발견 한 유일한 통합 사이트 (양의 1 ~ 2 %가 깔끔한 게놈 DNA로부터 회수) 수십를 한 것으로 밝혀졌습니다.

통합 부위의 데이터 세트를 분석 할 때, 임의의 매칭 제어...

토론

게놈 분포 패턴의 매핑을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 레트로 바이러스 통합 위치의 분석을위한 프로토콜은 기술되어있다. 이 프로토콜은 레트로 바이러스 감염 가능한 모든 세포 유형에 적용 가능하다. 또한, 상기 분석 파이프 라인은 6.4 × 10 ^-5의 MOI로 감염 개시의 게놈 DNA에 상당 희석액에서 고유 삽입 부위의 충분한 수를 복구 할 가능성 매우 민감하다. 세포의 작은 분획은 프로 바이러스 통합 항구 것이다 낮은 바이러스 부하를 포함 할 수있다 감염된 환자의 시료에 적용 할 때 감도는 프로토콜 특히 유용한다. 이 필드 ^{36,38,41-43에서} 이전의 방법론 논문과 일치,이 프로토콜의 생물 정보학 부분에 여러 단계 시퀀스 데이터의 큰 파일을 처리하기위한 사용자 정의 스크립트의 개발 혜택을 누릴 것입니다. BLAT ^(58)는 엄마는하지만이 프로토콜에 설명 된 유틸리티를 pping, 사용자가 적절한 대안이 될하기 위해 나비 넥타이 ⁶⁷ (ht...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Gibco	11965-084	HEK293T 세포와 호환되는 표준 세포 배양 배지
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH 30088.03	최적의 바이러스 생산을 위해 다양한 혈청을 사전 스크리닝해야 할 수 있음
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-Cl	DMEM
Phosphate-Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV	세포 세척에 사용
트립신 EDTA	Corning	25-053-CI	조직 배양 플레이트에서 부착 세포를 분리하는 데 사용
PolyJet	SignaGen Laboratories		SL100688 DNA 트랜스펙션 시약
0.45 µ m Filters	Thermo Scientific	09-740-35B	바이러스 입자 함유 세포 배양 매체를 필터링하는 데 사용
Turbo DNase	Ambion	AM2239	바이러스 스톡에서 캐리오버 플라스미드 DNA를 분해하는 데 사용
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	바이러스 생산 DNeasy
Blood & 조직 키트	Qiagen	69506	세포에서 게놈 DNA를 정제하는 데 사용
Sonicator	Covaris	S2	이 초음파 발생기 모델로 듀티 사이클, 5%; 강도, 3, 버스트당 사이클, 200, 시간, 80
뉴클레아제-프리 워터	GeneMate	G-3250-125	샘플 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 시판되는 물을 사용하는 것이 좋습니다
QIAQuick PCR 정제 Kit	Qiagen	28106	라이브러리 건설 중 DNA를 정제하는 데 사용됨
End-It DNA End-Repair Kit	Epicenter	ER81050	초음파 처리된 DNA 샘플의 DNA 끝을 수리하는 데 사용됨
Klenow Fragment (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	dATP와 함께 A-tail repaired DNA fragments
dATP	Thermo Scientific	R0141	Deoxyadenosine triphosphate
MseI	NEB	R0525L	게놈 DNA 절단을 위한 제한 엔도뉴클레아제
BglII	NEB	R0144L	업스트림 HIV-1 U5 서열 T4 DNA 리가아제의 증폭을 억제하기 위한 제한 엔도뉴클레아제
	NEB	M0202L/6218	호환 가능한 DNA 말단의 공유 결합을 위한 효소
DNA 올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술	맞춤형	회사에서 올리고를 정제하도록 합니다. HPLC 정제는 DNA에 충분합니다 < 30 개의 뉴클레오티드; PAGE 정제 더 긴 DNA
장점 2: 중합효소 혼합물	Clontech	639202	)용 DNA 중합효소를 함유한 상업용 혼합물
Thermo	Scientific	R0181	4가지 화학물질을 멸균수로 얼음 위에 희석하여 중간 농도인 2.5mM에 도달합니다. dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	DNA 농도
측정을 위한 분광광도계Qubit 형광측정기	Life Technologies	Qubit® 3.0	통합 사이트 라이브러리 DNA 농도를 확인하는 데 사용되는 형광측정기
2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	통합 사이트 라이브러리 DNA 크기 분포를 확인하는 테이프 기반 분석
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	NGS에 사용