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방법 논문

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53845

⸱

2016년 4월 19일

 ,  ,  , 
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

이 논문에서

요약

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

초록

노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 - 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다.

P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.

서론

인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다.

노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 3에서 볼 수 있습니다 히스 - 혈액형 항원 (HBGAs를)라고. 는 P 도메인 HBGA의 상호 작용은 감염 4 중요한 것으로 생각된다. 사실, 최근의 보고서는 합성 HBGAs 또는 시험 관내 5 인간의 노로 바이러스 감염 박테리아를 HBGA가 발현의 중요성을 밝혔다.

noroviruses의 숙주 세포 부착에 관한 현재의 연구는 주로 곤충 세포 혹은 대장균 (대장균)에서 발현 된 재조합 P 도메인으로 표현 될 수있는 바이러스 입자 (VLP를)로 수행된다. 원 해상도의 P HBGA 도메인 상호 작용을 이해하기 위해, P-도메인 HBGA 복잡한 구조는 X 선 결정학을 이용하여 해결 될 수있다. 여기서, 우리는 높은 수량과 품질 P 도메인의 생산은 X 선 crystall 용으로 사용될 수 있도록 P 도메인 발현 및 정제를위한 프로토콜을 기술ography. 또한,이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역과 비 구조 단백질에 적용 할 수있다.

P 개의 도메인 E. 대한 코돈 최적화 대장균 발현과 표준 전송 벡터에 클로닝. P 개의 도메인이어서 폴리 히스티딘 (그의) 태그 및 프로테아제 절단 부위 다음된다 만노오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 발현 벡터로 재 클로닝된다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질로 표현 E. 대장균은 세 정제 단계 하였다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질은 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)를 이용하여 정제한다. 다음에, 융합 단백질은 인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 및 P 영역이 분리되어로 절단된다 MBP-그의 부가 IMAC 정제 단계에 의해. 마지막으로, P 도메인은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 이용하여 정제한다. 정제 된 P 영역은 X 선 결정학에 사용될 수있다. 단백질 결정화 조건의 스크리닝 PERFO 인다른 P 도메인 단백질 농도를 사용하여 시판의 스크리닝 키트 rmed. 결정 성장이 관찰되고, 가장 유망한 조건이 최적화된다.

방법은 여기에 설명과 함께, 그것은 미만 사주 내에서 구조화 단백질 유전자에서 갈 수 있습니다. 따라서, P 도메인의 발현, 정제, 결정화의 우리의 방법은 분자 수준에서 노로 바이러스 - 호스트 상호 작용을 연구하고 최신 백신 디자인 및 약물 검사를 지원하기 위해 중요한 데이터를 제공하기에 적합하다.

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프로토콜

1. P 도메인 복제

  1. 노로 바이러스 균주의 서열 정렬하여 P 도메인 코딩 영역을 결정합니다 (예를 들어, GII.10 변형, GenBank 등록 : AF504671, PDB-ID : 3ONU) 6. 또한, P 영역 (도 2a)의 C 말단에있는가요 성 영역을 제거한다. E.위한 DNA를 코돈 - 최적화 대장균 발현 및 BamHI에 서브 클론을 위해 (터미널 N) 및 NotI을 (C 터미널) 제한 다음 사이트 pMalc2x 발현 벡터 6,7로 영역을 코딩 P 도메인을 포함한다.
    참고 : P 도메인 코딩 영역은 최적화 된 상용 서비스에 의해 합성된다. 지역 (삽입)를 코딩 P 도메인은 약 1 길이 킬로바이트 및 표준 전송 벡터에서 제공합니다.
  2. 각각의 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)로 제한 제조업체 버퍼를 공급하여 37 ℃에서 1 시간 동안 효소로 전사 벡터의 2 μg의 다이제스트.
  3. 1 % 아가로 오스 겔에서 분해 삽입 별개135 V에서 20 분 동안 시판 키트를 사용하여 겔로부터 삽입 DNA를 정제.
  4. 각 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)에 제한은 37 ° C에서 1 시간 동안 효소로이 벡터의 2 μg의 소화하여 pMalc2x 발현 벡터를 준비한다. (1.3) 상술 한 바와 같이, 아가 로스 젤에서 벡터를 정제. 참고 : 두 샘플 (1.2 및 1.4)는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
  5. 실온 (RT) (그림 2B와 2C)에서 15 분 1 μL T4-DNA 리가 아제 (40 U / ㎖)와 BamHI 및 NotI에 제한 부위에서 절단 pMalc2x 벡터로 정제 인서트를 결찰. 삽입 비율 1 : 3 (분자량)를 pMalc2x 벡터와 벡터의 적어도 20 NG를 사용한다. 결찰 혼합물은 일반적으로 20 ~ μL이다.
  6. 50 μL 화학적 관할 E.로 결찰 믹스 2㎕의 변형 대장균 DH5α 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 박테리아 세포 성장이 60037 ° C에서 1 시간 동안 ㎕의 SOC 배지. 원심 분리기는 형질 전환 된 세포는 1,000 XG에 3 분 동안, 상층 액을 제거하고, SOC 매체의 30 μL에 펠렛을 재현 탁.
    1. 선택에 100 ㎍ / ml 암피실린, LB 한천 플레이트 상 변환 혼합 플레이트, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한다. 적어도 다섯 식민지를 선택합니다.
  7. 다섯 식민지의 각각에 대해, 50 μg의 / ㎖ 앰피 실린 (LB-A)로 보충 LB-매체의 2-3 ml의 문화를 접종하고 37 ℃에서 160 rpm으로 밤새 진탕 성장한다.
  8. 상용 키트를 사용하여 야간 문화 플라스미드의 압축을 풉니 다. pMalc2x 정방향 프라이머 (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ')와 염기 서열에 의한 P 도메인 삽입의 존재를 확인하고 프라이머 역 (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P 도메인 표현

  1. MBP-그의-P 도메인에 대한 pMalc2x 벡터 코딩 - (400 NG / μL 150 NG / μL) 1 μl를 변환관할 E.의 50 μL에 융합 단백질 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 대장균 BL21 세포는 37 ° C에서 1 시간, 600 μL의 SOC 배지에서 자란다. 밤새 160 rpm으로 37 ° C에서 LB-A의 120 ml의에 하위 문화.
  2. 차 배양 (100 일)와 LB-A의 (1.5 L 매체 각각 예를 들어, 6 × 5 L 플라스크) 구리터을 접종한다. 0.6 - 외경 (600)가 0.4에 도달 할 때까지 160 rpm으로 37 ° C에서 진탕 세포 성장. 그 후, ~ 1 시간 동안 22 ° C까지 온도를 낮추고 다음 이소 프로필 β-D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드의 0.66 밀리미터 (IPTG) 8 단백질 발현을 유도. 하룻밤 22 ° C (~ 18 시간)에서 세포를 성장.
    온도는 다양 할 수 있지만, 우리는 22 ° C 이하를 사용하는 것이 좋습니다 있습니다.
  3. 원심 분리 (10,543 XG, 15 분, 4 ° C)에 세​​포를 수확. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 세포 펠렛을 동결.

3. 1 차 정제 단계 및 프로테아제 절단

  1. 실험의 재현성 및 안정성을 보장하기 위해 재고 솔루션에서 단백질 정제 단계 동안 사용되는 버퍼를 준비합니다. 고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 대 한 4 개의 서로 다른 버퍼 (IMAC), 이미 다졸의 다른 농도를 포함하는 각 (10 밀리미터, 20 밀리미터, 50 밀리미터, 250 밀리미터)를 준비합니다. SEC에 대해보다 높은 염 농도와 겔 여과 완충액 (GFB)을 제조하지만, 이미 다졸없이. 탈 이온수를 사용하여 0.45 ㎛의 공극 크기를 사용하기 전에 모든 버퍼를 필터링.
    참고 : 자세한 버퍼 준비 방식은 표 1을 참조하십시오.
  2. 아홉 리터의 문화에서 세포 펠렛을 해동하고 4 ° C에서 150 ml의 PBS에 용해. 세포를 파괴하는 세포 현탁액을 2 분 (파워 130 W, 20 %의 진폭, 펄스 주파수 50 %) 3 회 초음파 처리. 초음파 동안 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  3. CentrifuGE는 초음파 세포 현탁액 (43,667 × g으로 30 분, 39 ° C에서)이 발현 된 단백질을 함유하는 상청액으로부터 세포 찌꺼기를 분리한다. 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다.
  4. 세척 및 니켈 (Ni) 크로마토 그래피 컬럼에서 10 mM의 이미 다졸 버퍼 -NTA 아가 로스 비드 10 ㎖ (= 1 열 볼륨 [CV]) 슬러리를 평형. 단계 3.3에서 뜨는로 평형 니켈 구슬을 추가 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 발현 느린 회전 4 ° C에서 30 분 동안 품어 함유.
  5. 배양 후, 크로마토 그래피 컬럼에 전체 니켈 비드 단백질 혼합물을 적용합니다. 10 밀리미터, 20 밀리미터, 10 밀리미터, 다음 20 mM의 마지막 50 밀리미터 (그림 3A)로 시작하는 50 mM의 이미 다졸 버퍼, 각각 5 이력서와 함께 천천히 열을 씻으십시오.
  6. 250 mM의 이미 다졸 완충액 (도 3a)을 사용하여 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 용출시켰다. 용출 동안에, 융합 단백질의 용출 (OD (28)의 증가를 확인 OD를 280 ㎚를 점검를 0㎚). 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 떨어질 때까지 용출을 계속합니다. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 적어도 10 약력이어서 250 mM의 이미 다졸 완충액 (적어도 10 CV들) 과량으로 비드를 세척 하였다. 두 번째 정제 단계 (섹션 4)의 구슬을 저장합니다.
  7. 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (10 × 8cm) (9) (도 3A)을 이용하여 SDS-PAGE로 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 존재를 확인한다. 45에서 겔 전기 영동을 수행하고 45 분 동안 200 V.
  8. ~ 3 mg / ml의 최종 농도로 (상업적 농축기를 사용하여, 예) 용출 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 농축시킨다. (~ 1 : 100)을 10 mm의 2 L에 대해 투석하는 동안 이미 다졸 버퍼를 HRV-3C 프로테아제와 MBP-그의-P 도메인 융합을 절단 밤새 4 ° C (도 3A)에서. 농축 된 단백질의 최종 부피에 따라 투석 카세트 또는 투석 튜브로 투석을 수행한다.
    주 : 단백질 HRV-3C 단백질 분해 효소의 양은분열은 특정 프로테아제 활성에 따라 계산되고, 발현 량에 변화하고, SDS-PAGE의 결과로부터 추정 될 수 용출 된 융합 단백질의 양 (3.7 (2 U / ㎕의 1 U 100 단백질 μg의을 절단하기에 충분하다) ).

4. 2 차 정화 단계

  1. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 단계 3.6에서 니켈 구슬 평형.
  2. 느린 회전으로 ​​39 ° C에서 30 분 동안 평형화 니켈 비드 (4.1)와 (P 절단 도메인 MBP 단백질 및 HRV 프로테아제 함유)을 단계 3.7에서 투석 된 단백질을 부화.
  3. 컬럼에 니켈 비드 혼합물을 적용하고 흐름을 통해 (절단 P 도메인) (그림 3B)를 수집합니다. 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 도달 할 때까지 열을 벗기으로 단백질 농도를 측정한다.
    참고 : MBP-그분은 니켈 구슬 (그림 3B)에 결합 된 상태로 유지해야합니다.
  4. 1과 함께 SDS-PAGE를 이용하여 절단 된 P 영역의 존재를 확인2 % 겔은 다음과 같이 (도 3b) 상술. ~ 3 ㎎ / ㎖로 용출 P 도메인을 집중 이후 SEC의 정제 GFB에 대한 4 ° C에서 하룻밤 투석.

제 3 차 정제 단계

  1. 세척 펌프 및 HPLC 정화 시스템의 파이프 및 사전 평형 증권 거래위원회 (SEC) 열을 GFB와 (자료 목록 참조).
  2. 농축 된 시료의 양에 따라, 1 ㎖ (3 ㎖까지)을 superloop (최대 12 ㎖) 또는 루프를 사용 / 분의 유속으로 컬럼에 P 도메인을 주입한다. 분사가 완료되면 / 분으로 2.5 ml의 유량을 증가시킨다.
  3. 외경이 증가하고, P 도메인 열 벗기 같이, 1.5 ㎖로 분획을 수집한다. 12 % 겔 SDS-PAGE를 이용하여 분획을 확인 (도 4a 및도 4b). 수영장 만 순수한 분수와 ~ 3 ㎎ / ㎖하고 ~ 8 ㎎ / ㎖에 집중한다.
    참고 : 110 ~ 후 ㎖ (공극 부피) 대부분의 불순물이 320 ml의 침대 볼륨과 SEC 컬럼에서 용출됩니다. 그만큼P 도메인은 일반적으로 이량 체로서 용출된다. 는 P 도메인 이량 체의 용출 시간 / 볼륨은 SEC 컬럼의 사전 등급 (PG)에 따라 달라집니다.

는 P 도메인 6. 결정화

  1. 초기 결정화 스크리닝 ~ 3 ㎎ / ㎖, 8 ㎎ / ㎖에서 P 도메인을 사용합니다. 384 시중에서 판매하는 선별 조건을 초기 화면에 대한 농도 별 P 도메인의 최소 100 μl를 준비합니다. 리저버 어머니 용액 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트 형식에서 18 ° C에서 스크리닝을 수행하고 드롭 0.2 μL 머더 용액 0.2 μL 단백질로 구성된다.
  2. 반복 성공적으로 결정화 조건을 최적화 할 수 있습니다. 따라서, 3 행을 포함 15 웰 플레이트를 사용합니다. 100 % 어머니 솔루션, 90 %의 어머니 용액과 10 %의 물과 80 %의 어머니 용액과 20 %의 물과 세 번째 행과 두 번째 행과 첫 번째 행을 설정합니다. 2 μL (1 μL 단백질 + 1 μl의 어머니 용액) 500의 방울 크기를 사용하여81, 저수지 볼륨으로 어머니 솔루션의 리터.
  3. 공 결정화 리간드와 P 도메인에 최적화 된 결정 조건을 사용합니다. 6.2에 설명 된대로 판을 준비합니다. 대신에 2 ㎕의 방울 크기, 1 μL 모 용액 1 ㎕의 단백질 및 1 ㎎ / ㎖ 농도의 리간드 1 μl를 함유 방울을 설정.
  4. 싱크로트론 방사선을 이용한 단결정의 데이터 세트를 수집한다. 초기 탐색 모델 6,10-13 같은 높은 서열 유사성과 출판 P 도메인 구조를 이용하여 분자량 교환을 수행한다.
    참고 : 리간드의 존재는 전자 밀도의 취소 모델링 덩어리로 표시됩니다.

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결과

기술 된 프로토콜의 개략도가도 2. 프로토콜은 표적 유전자의 클로닝, 발현, 세 단계의 정제 및 결정화 포함 6 주요 부분을 포함한다.도 1에 도시 된 식 구조의 설계를 도시한다 (EC) 및 pMalc2x 발현 벡터의 특징. pMalc2x 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 순서는 제한 프로테아제 절단 부위를 나타낸다.도 3은 제 두개의 대응하는 회로도와 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 대표적인 SDS-PAGE 결과 및 절단 P 영역을 도시 정화의 단계. 세 번째 정제 단계는도 4에 도시되고 정제 방식 정제 P 영역의 용출 크로마토 그램 수집 분획물의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 포함한다. 순수한 분획을 풀링, 정광 (SDS-PAGE에 따라)ED 및 X 선 결정학에 사용.

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토론

여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 ​​않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에 설명과 함께, 우리는 최근에 결합 탄수화물 노로 바이러스의 분자 세부 사항의 이해에 크게 기여했다. 본 프로토콜은 다양한 단백질로 구성 될 수있다. 그러나,이 프로토콜의 성공적인 구현은 정제 방법의 각 부분에서 여러 가지 요인에 따라 달라집니다.

발현 구조체의 디자인의 중요성의 제 1 단계이다. 우리는 E.의 발현 수율을 향상시키기 위해 P 도메인 발현 구조체의 코돈 최적화를 수행 대장균 제거 rele코딩 영역 내에 존재 VANT 제한 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구의 자금은 CHS 재단에서 제공했습니다. 우리는 결정 스크리닝을 위한 하이델베르크 대학의 우수 클러스터 CellNetworks 및 싱크로트론 방사선 시설 제공을 위한 유럽 싱크로트론 방사선 시설 내의 단백질 결정화 플랫폼을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
P domain DNALife TechnologiesGeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector요청
BamHINew England BiolabsR0136L
NotINew England BiolabsR0189L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
S.O.C. MediumLife Technologies15544-034
Econo-Column Chromatography ColumnBio-Rad73725122.5 x 10 cm, 다른 크기
Ni-NTA AgaroseQiagen30210
Vivaspin 20GE Healthcare다양한사용 가능10 kDa, 30 kDa 및 50 kDa의 컷오프는
Subcloning Efficiency DH5&alpha를 사용했습니다. 유능한 세포Life Technologies18265-017
One Shot BL21(DE3) 화학적 유능한 E. coliLife TechnologiesC6000-03
HRV 3C 프로테아제Merck Millipore71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34SEC 열
JCSG 코어 스위트Qiagen다양한4 각 96 웰
CarbohydratesDextra Laboratories, UK다양한혈액형 제품
시 스크리닝

참고문헌

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