여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).
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이 논문에서
요약
초록
노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 - 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다.
P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.
서론
인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다.
노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 3에서 볼 수 있습니다 히스 - 혈액형 항원 (....
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프로토콜
1. P 도메인 복제
- 노로 바이러스 균주의 서열 정렬하여 P 도메인 코딩 영역을 결정합니다 (예를 들어, GII.10 변형, GenBank 등록 : AF504671, PDB-ID : 3ONU) 6. 또한, P 영역 (도 2a)의 C 말단에있는가요 성 영역을 제거한다. E.위한 DNA를 코돈 - 최적화 대장균 발현 및 BamHI에 서브 클론을 위해 (터미널 N) 및 NotI을 (C 터미널) 제한 다음 사이트 pMalc2x 발현 벡터 6,7로 영역을 코딩 P 도메인을 포함한다.
참고 : P 도메인 코딩 영역은 최적화 된 상용 서비스에 의해 합성된다. 지역 (삽입)를 코딩 P 도메인은 약 1 길이 킬로바이트 및 표준 전송 벡터에서 제공합니다. - 각각의 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)로 제한 제조업체 버퍼를 공급하여 37 ℃에서 1 시간 동안 효소로 전사 벡터의 2 μg의 다이제스트.
- 1 % 아가로 오스 겔에서 분해 삽입 별개135 V에서 20 분 동안 시판 키트를 사용하여 겔로부터 삽입 DNA를 정제.
- 각 1 μL를 BamHI (20,000 ....
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결과
기술 된 프로토콜의 개략도가도 2. 프로토콜은 표적 유전자의 클로닝, 발현, 세 단계의 정제 및 결정화 포함 6 주요 부분을 포함한다.도 1에 도시 된 식 구조의 설계를 도시한다 (EC) 및 pMalc2x 발현 벡터의 특징. pMalc2x 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 순서는 제한 프로테아제 절단 부위를 나타낸다.도 3은 제 두개의 대응하는 회로도와 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 대표적인 SDS-PAGE 결과 및 절단 P 영역을 도시 정화의 단계. 세 번째 정제 단계는도 4에 도시되고 정제 방식 정제 P 영역의 용출 크로마토 그램 수집 분획물의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 포함한다. 순수한 분획을 풀링, 정광 (SDS-PAGE에 따라)ED 및 X 선 결정학에 사용.
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토론
여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에 설명과 함께, 우리는 최근에 결합 탄수화물 노로 바이러스의 분자 세부 사항의 이해에 크게 기여했다. 본 프로토콜은 다양한 단백질로 구성 될 수있다. 그러나,이 프로토콜의 성공적인 구현은 정제 방법의 각 부분에서 여러 가지 요인에 따라 달라집니다.
발현 구조체의 디자인의 중요성의 제 1 단계이다. 우리는 E.의 발현 수율을 향상시키기 위해 P 도메인 발현 구조체의 코돈 최적화를 수행 대장균 제거 rele코딩 영역 내에 존재 VANT 제한 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구의 자금은 CHS 재단에서 제공했습니다. 우리는 결정 스크리닝을 위한 하이델베르크 대학의 우수 클러스터 CellNetworks 및 싱크로트론 방사선 시설 제공을 위한 유럽 싱크로트론 방사선 시설 내의 단백질 결정화 플랫폼을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | 요청 | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, 다른 크기 |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | 다양한 | 사용 가능10 kDa, 30 kDa 및 50 kDa의 컷오프는 |
| Subcloning Efficiency DH5&alpha를 사용했습니다. 유능한 세포 | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) 화학적 유능한 E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C 프로테아제 | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC 열 |
| JCSG 코어 스위트 | Qiagen | 다양한 | 4 각 96 웰 |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | 다양한 | 혈액형 제품 |
참고문헌
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol....
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