방법 논문

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

DOI:

10.3791/53847

⸱

2016년 5월 29일

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

이 논문에서

요약

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인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

초록

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작용 성 수용체는 세포 내로 진입하는로서 인플루엔자 바이러스 (IAV) hemagglutinins는 세포 표면의 시알 산을 인식한다. 야생 물새는 IAV의 자연 저수지하지만, IAV는 가금류, 돼지, 말과 인간 종의 장벽을 통과 할 수 있습니다. 조류 바이러스가 사람 바이러스는 우선적 α2-6 결합 (인간 형 수용체)와 시알 산을 인식하는 반면 α2-3 결합 (조류 형 수용체)에 의해 끝에서 두 번째 갈락토스에 첨부 된 시알 산을 인식한다. 조류 바이러스가 인간 형 수용체에 적응하는 경우 모니터하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수있다. 합성 sialosides의 다양한 라이브러리와 글리 칸 마이크로 어레이는 점점 수용체 특이성을 평가하는 데 사용됩니다. 그러나,이 기술은 avidities 측정에 사용되지 않는다. 결합력의 측정은 통상적으로, 종래의 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 흡착 글리 칸으로 희석 한 바이러스 헤 마글 루티 닌 또는 결합을 평가함으로써 달성된다. α이 분석에서, 글리 칸2-3 또는 α2-6 시알 산은 비오틴에 결합 스트렙 타비 딘 판에 흡착 또는 직접 플라스틱에 흡착 폴리 아크릴 아미드 (PAA)에 연결되어있다. 우리는 크게 직접 마이크로 웰 유리 슬라이드에 PAA 링크 sialosides과 비 PAA 연결된 대응을 인쇄하여이 분석을 소형화했다. 하나의 슬라이드에 48 배열이 셋업은, 6 글리 칸은이 비 시알 릴화 통제를 포함한 6 개의 글리 칸을 심문, 8 희석에 결합 단백질의 동시 분석 할 수 있습니다. 이는 기존의 플레이트 분석에서 18 배 96 웰 플레이트에 해당합니다. 글리 칸 배열 형식은 화합물 및 생물학적 제제의 소비를 감소함으로써 효율성을 크게 향상시킨다.

서론

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야생 물새 IAV위한 자연 저장고 있지만 IAV 가금류 인간을 포함한 포유 동물에 종 장벽을 통과 할 수있다. 인간 바이러스 α2-6 결합 시알 산 (사람 형 수용체)에 결합하는 반면 조류 IAVs은 α2-3 결합 시알 산 (조류 형 수용체)를 인식한다. 효율적으로 복제 및 조류 IAV 인간 형 수용체 1에 결합 할 필요가 인간 사이에 전송 할 수 있습니다.

IAVs는 자신의 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) 엔벨로프 당 단백질의 항원 성을 특징 혈청에 따라 구분된다. NA는 바이러스 라이프 사이클 및 절단 시알 산 (2)의 타단 수용체 - 파괴 효소 인 반면, HA는, 시알 산에 결합한다. H1N1, H2N2 및 H3N2을 포함한 모든 인간 감염 바이러스는 조류 기원 3 있습니다. 인간의 크로스 오버에 여러 조류 수십 년의 마지막 두 이상 H5N1, H7N7 및 H7N9으로 발생되는 가장 잘 알려진; 하우버전이 다른 아형보다 산발적으로 인간을 감염 한 (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. 다행스럽게도, 이러한 바이러스 중 어느 것도 완전한 인간 형 α2-6 결합 시알 산 수용체 5-8에

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프로토콜

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주 : 달리 지시되지 않는 한 모든 단계가 실온에서 수행된다.

1. 배열 건설

  1. 글리 칸 준비 및 플레이트 설치
    1. 인쇄 버퍼의 재고를 준비합니다. 우선 인산 나트륨을 150 mM의 스톡 용액을 500 mL로 만든다. 또한, 인산이 수소 나트륨 용액을 150 mM의 스톡 용액을 50 mL로 만든다. 플라스크에서, pH가 8.5에 도달 할 때까지 서서히 용액으로 염기성 인산 나트륨 용액을 적정 교반 막대 및 pH 미터를 사용하여 자기. 0.005 %의 트윈 20을 추가합니다.
    2. 글리 칸 샘플을 준비합니다. PAA에게 복합 글리 칸, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) 및 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (그림 1A 희석 )) 100 ㎍로 희석되어야한다 / step1.1.1. 가의 글리 칸에서 버퍼를 인쇄에서 ml의diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Ne....

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결과

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인쇄, 스캔 및 데이터 분석

적절한 인쇄를 보장하기 위해, 상기 슬라이드 각 어레이를 묘사 테플론 마스크 내에서 발견 된 격자의 정확한 정렬을하는 것이 중요하다. 인해 테프론 코팅의 성질, 인쇄 도중, 스폿은 MPX 슬라이드에 육안으로 볼 수 없다. 주의를 폴리 -L- 라이신 코팅 된 슬라이드에 프리 반점의 외관 후 지불된다. 직접 인쇄 후, 각 슬라이드 인해 그 자리에서 건조 버퍼의 염을 볼 수 있습니다 각각의 발견 화합물의 존재를 눈으로 확인해야합니다. 배열은 테프론 테두리와 발견 기능의 정확한 수 내 관광 명소의 올바른 정렬을 위해 검사된다.

슬라이드 사진 표백을 피하기 위해 높은 스캔 전원 이하의 반복 과정에서 스캔 HIG의 비교를 허용하고그녀.......

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토론

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IAV 수용체 특이성을 평가하는 것은 조류 바이러스의 대유행 가능성을 분석하는 중요한 단계이다. 바이러스에 의해 시알 산 인식은 같은 셀에 결합 및 해제로 여러 생물학적 성질에 연결되어 있습니다. 조류 바이러스가 결합 α2-6 달성하고 종 장벽이 대유행 대비를 가능하게 교차하는 지식은 아미노산 돌연변이가 필요합니다. 여러 분석은 수용체 특이성을 결정하기 위해 사용된다; 그러나, 모든 반대로 만 측정 결합력이 아닌 특이 포함한 결점들을 갖는다.

여기에서 우리는 더 복잡한 글리 칸의 PAA 연결된 단말기 조각을 사용하여 널리 사용 및 인정 ELISA를 기반​​으로 새로운 소형 도구를 설명합니다. 4 잘 정의 된 렉틴, 공장의 2 인플루엔자의 2 바이러스 원점을 사용하여, 우리는 우리가 특이 상대 결합력을 유지하는 것으로 나타났다.

우리는 화학 biolog의 감소량을 계산하면글리 칸 어레이 칩 상에 ELISA를 소.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다

감사의 글

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이 작품은 스크립스 마이크로 어레이 핵심 시설 및 질병 통제 예방 센터 (JCP)로부터 계약에 의해 부분적으로 지원되었다. RPdV는 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 루비콘과 VENI 부여받는 것입니다. NIGMS 부여 GM62116 (JCP)에 의해 투자 컨소시엄은 기능 글리코 믹스에 대한 (http://www.functionalglycomics.org/) 본 연구에 사용 된 여러 글리 칸을 제공했다. 이는 스크립스 연구소에서 발행 29,113입니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
넥스테리온® 슬라이드 H MPX-48 Schott1091525Microwell 슬라이드
ProScanArray Plus PerkinElmer단종컨포칼 마이크로어레이 스캐너
Innoscan 1100AL 스캐너/Mapix 소프트웨어Innopsys-confocal마이크로어레이 스캐너
MicroGrid II Digilab-microaray프린터
SNAVector LabsB-1305 식물 렉틴
ECA벡터 연구소B-1145 식물 렉틴
항-연쇄상구균 항체IBA2-1509-001 HA 바인딩을 위한 Anitbody
안티-마우스 Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA 바인딩
Tween-20SigmaP2287 세정제
di-basic 소듐 포스페이시그마255793인쇄 버퍼 구성
요소 모노-베이직 소듐 포스페이시그마229903 인쇄 버퍼 구성 요소
폴리-l-라이신 용액SigmaP8920 Pre-spotting Slide 구성 요소
수산화나트륨시그마221465사전 스포팅 슬라이드 구성 요소
에탄올시그마493546사전 스포팅 슬라이드 구성 요소
인산염 완충 식염수코닝46-013-CM배양/세척 버퍼
SMP4B 핀TelechemSMP4B인쇄 핀
압축 질소(5등급)프렉스에어UN1066일반 먼지 제거/건조 도구
Boric AcidSigmaB6768-500G슬라이드 차단 시약
에탄올아민SigmaE9508-500ML슬라이드 차단 시약
Atto 488AttoTecAD 488-91Gridmarker on array
PAA-LNLNConsortium for Functional GlycomicsPA368Spotted glycans
PAA-3SLNLN컨소시엄 기능성 글리코믹스PA362점박이 글라이칸
PAA-6SLNLN컨소시엄 기능성 글리코믹스PA343점박이 글라이칸
LNLN컨소시엄 기능성 글리코믹스Te98점박이 글라이칸
3SLNLN컨소시엄 기능성 글리코믹스Te175
6SLNLN컨소시엄 기능성 글리코믹스Te176점박이 글라이칸
384웰 마이크로타이터 플레이트Matrix TechCorp4361인쇄판
VWR 랩 마커VWR52877-150슬라이드 번호 매기기
Wheaton 슬라이드 염색 접시SigmaZ103969-1EA차단 및 건조
는 된 트 트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional ba....

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Glycan Microarray AssayInfluenza A VirusHemagglutinin BindingAvidity MeasurementSpecificity AnalysisSialic Acid LinkagePAA Conjugated GlycansSerial DilutionFluorescent DetectionData Analysis

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