방법 논문

원자 힘 현미경과 뇌 Polysom​​es에서 피어링

DOI:

10.3791/53851

⸱

2016년 3월 16일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

이 논문에서

요약

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리보솜 구조는 광범위하게 규명되었지만 폴리솜의 조직은 여전히 연구가 부족합니다. 이러한 지식 부족을 극복하기 위해 공기 및 액체에서 원자력 현미경(AFM)에 의한 포유류 폴리솜의 정확한 이미징을 위한 자세한 준비 프로토콜을 제시합니다.

초록

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병진 기계, 즉, polysome 또는 polyribosome은 세포에서 가장 크고 가장 복잡한 세포질 기계 중 하나입니다. 리보솜, mRNA를 여러 단백질과 비 코딩 RNA를 형성 Polysom​​es는 번역 컨트롤이 일어날 플랫폼을 통합 나타냅니다. 리보솜 널리 연구되고있다 동안 그러나, polysom​​es의 조직은 여전히​​ 포괄적 인 이해가 결여되어있다. 따라서 많은 노력이 polysom​​e 조직과 내장 될 수있다 병진 제어의 새로운 메커니즘을 규명하기 위해 필요합니다. 원자력 현미경 (AFM)을 나노 스케일 해상도에서 3D 영상의 획득이 가능 사형 프로브 현미경의 유형이다. 전자 현미경 (EM) 방법에 비해, AFM의 주요 이점 중 하나는, 공기와 용액 중의 두 이미지 수천 취득 시료를 활성화 할 수 있다는 것이다은 염색 친 고정 할 필요없이 주변의 생리적 조건 하에서 유지 될cedures. 여기서, 마우스 뇌 운모 기판에 자신의 증착에서 polysom​​es의 정확한 정제 상세한 프로토콜 설명한다. 이 프로토콜은 AFM 및 3 차원 물체 그들의 재건과 공기와 액체의 polysom​​e 촬영을 할 수 있습니다. 극저온 전자 현미경 (EM 극저온) 상보는 제안 된 방법은 편리 체계적 polysom​​es를 분석하고 조직을 연구에 사용될 수있다.

서론

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단백질의 합성은 1,2- 세포에서 가장 에너지 소비 프로세스이다. 그러므로, 단백질 존재비 주로 병진 아닌 전사 수준 3,4,5-에서 제어된다는 의외이다. polysom​​e 기능성 단백질 판독에 mRNA의 정보를 변환하는 기본적인 거대 분자 구성 요소입니다. Polysomes는 지금까지 여러 번역 컨트롤 6-13을 수렴 거대 분자 복합체로 인식하고 있습니다. 리보솜 구조 14- (16)에 대한 연구 수백에도 불구하고, 번역의 역학에 대한 자세한 분자 통찰력과 polysomes의 토폴로지는 제한된이자가 발생했습니다. 결과적으로, 기본 polysom​​al의 리보 핵산 단백질 복합체의 조직과 번역에 대한 잠재적 효과는 여전히 다소 애매한 문제입니다. Polysom​​es 잠재적 무엇 뉴 클레오 및 후생 유전 학적 contro 미러링, 여전히 알 수없는 주문 및 기능 조직을 숨길 수 있습니다LS는 전사 필드에 표시했다. 사실,이 흥미로운 가설의 조사 추가 연구와 새로운 기술 접근​​ 방식이 필요합니다. 이 라인에서, 구조 기술과 원자 힘 현미경 fruitfully 마찬가지로 뉴 클레오 17, 18 달성 한 것에, 유전자 발현을 제어하기위한 새로운 메커니즘을 해명하기 위해 협력 할 수 있습니다.

리보솜 14-16의 발견 이래, 그 구조는 광범위 단백질 합성의베이스 메커니즘의 분자에 대한 설명을 제공 원핵 19,20, 최근에는 인간 (22) 효모 21 특징으로하고있다. Polysomes는 초기 일반적인 2D 형상기구 (14)를 형성하는, 소포체의 막에서 인식되었다. 앞서 언급 한 바와 같이, polysom​​e 조립체 리보솜 구조로서 지속적인 관심의 대상이 아니었다. 과거 polysom​​es TR은 본질적으로 연구되어왔다ansmission 기술을 EM은 기반. 최근에, 냉동-EM 기술은 체외 번역 시스템 23-26에서 정제 polysomes의 3D 복원, 사람 세포 용 해물 (27) 또는 셀 (28)의 수있었습니다. 이러한 기술은 polysomes 23, 26 ~ 28과 밀 배아 polysomes (24)에 인접 리보솜의 접촉면의 예비 분자 설명에 리보솜 - 리보솜 조직에 대한 더 정제 된 정보를 제공했다. 따라서, 냉동-EM 단층 촬영 분자 세부 리보솜 - 리보솜 상호 작용의 공개를 할 수 있지만 광범위한 후 처리 부담하고 재건 데이터를 처리하기위한 무거운 전산 자원을 필요로하는 분석한다. 또한, 리보솜 리보솜 작용의 분자 세부 수득 리보솜의 고해상 맵이 필요하며, 기준 리보솜이 종류는 몇 종 가능하다. 중요한 크라이 EM 단층 무연 RNA를 검출 할 수 없다. Theref철광석은 새로운 기술은 완전히 변환 장치의 구성을 이해하기 위해 필요하다.

냉동-EM 옆에, AFM은 낮은 진핵 생물 29-33과 인간 (27)에 polysomes 직접 이미징을위한 유용한 도구로 사용되어왔다. EM에 비해 AFM은 샘플 고정 또는 라벨이 필요하지 않습니다. 또한, 측정 값에 가까운 생리적 조건에서 명확 리보솜 벗은 RNA 가닥 (27)을 모두 식별하는 고유의 가능성을 행할 수있다. 단일 polysom​​es의 영상은 광범위하고 무거운 후 처리에 재건은 냉동-EM 현미경에 의해 요구 분석에 비해 조금 후 처리 노력으로 나노 해상도에서 이미지의 수천을 획득, 상대적으로 빠르게 수행 할 수 있습니다. 따라서, AFM 데이터 처리 및 분석은 고가의 워크 스테이션과 높은 컴퓨팅 파워를 필요로하지 않습니다. 이와 같이,이 기술은 polysom​​al 도형에 대한 정보, 형태 학적 특성 (예 : 수집높이, 길이 및 폭), 리보솜 밀도없는 RNA의 존재 및 극저온 EM보다 높은 처리량 polysome 당 27 리보솜의 수. 이러한 방식으로, AFM은 polysomes (27)을 묘사하는 EM 기술에 대한 강력하고 상호 보완적인 접근 방식을 나타냅니다.

여기에서 우리는 정화의 AFM이 이미지에 적용하고 마우스 뇌 polysom​​es을 분석 데이터 분석에 대한 완전한 파이프 라인을 제시한다. 제안 된 프로토콜은 정화 문제와 AFM 이미징에 사용되는 운모 기판에 polysom​​es의 정확한 증착에 초점을 맞추고있다. 쉽게 AFM 커뮤니티에서 사용되는 일반적인 소프트웨어와 함께 수행 될 수있는 종래의 입자 분석 외에도 RiboPick라는 ImageJ에 플러그 (34)는, polysome 27, 35 당 리보솜 수를 계수되게된다.

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프로토콜

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마우스 조직을 얻기 위해 사용되는 사례가 트 렌토 대학의 동물의 보호 (OPBA) (이탈리아)의 몸에 의해 승인 된 프로토콜 없음. 04-2015, 같은 art.31 당 입법 법령 없음. 2,014분의 26. 모든 마우스는 통합적인 생물학 센터 (CIBIO), 트 렌토 대학, 이탈리아의 모델 생물의 시설 유지했다.

주의 : 샘플 중 RNA의 분해를 방지하는 RNase 오염을 최소화 DEPC 처리 된 물을 사용하는 모든 버퍼를 제조 하였다.

항목의 두뇌에서 Polysom​​es 1. 준비

  1. 뇌 조직 수집 (15 분)
    1. 5 분 36 CO 2 질식과 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 안락사. 조심스럽게, 두개골 (36)로부터 뇌를 해부 1.5 ML 튜브로 조직을 배치하고 즉시 액체 질소에 넣습니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
  2. 해물의 준비 (30 분)
    1. 하여 전체 뇌 조직 분쇄액체 질소에서 박격포와 유 봉.
    2. 감기 microcentrifuge 관에 약 25 mg의 분말을 전송하고 즉시 신속하게 피펫 팅 상하 25 배 용해 완충액 (표 1) 0.8 mL를 추가하고, 세포를 교란 (분쇄 된 조직의 해동을 피하기 위해).
    3. 세포 파편 펠렛 4 ° C에서 1 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
    4. 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지.
    5. 핵 및 미토콘드리아 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
    6. 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다.
    7. 6 개월 최대 -80 ° C에서 뜨는을 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다.
  3. 수 크로스 구배 원심 분리 제제와 (2 시간 30 분)
    1. 의 RNase없는 물 (디 에틸 피로 카보 처리 수 (DEPC-물) 또는 상업적)와 광범위하게 세척 초 원심 분리기 튜브D 3 % H 2 O 2 / DEPC H 2 O 솔루션입니다.
    2. 얼음에 튜브를 넣고 각 튜브 (자당 용액에 대한 표 1 참조)의 바닥에 50 %의 차가운 수크로오스 용액 5.5 mL로 추가한다. 조심스럽게 튜브가 완전히 채워질 때까지, 날카로운 계면을 유지하기 위해서 계면 부근에 머물고, 드롭하여 15 % 자당 용액 방울을 추가합니다. 튜브가 완전히 충전 될 때, 기포 형성을 방지하기 위해 고무 마개를 닫는다.
    3. 추운 방에서 조심스럽게 수평으로 튜브를 놓고 2 시간 동안이 위치에 보관합니다. 이 시간이 지나면 천천히 수직 위치에 튜브를 곧게하고 얼음에 넣어. 그라디언트 이제 사용할 준비가 있습니다. 또한, 전 기존의 그라데이션을 사용하여 15~50% 자당 기울기를 준비합니다.
    4. 차가운 방에 구배의 상부로부터 1.0 ml를 조심스럽게 제거하고 세포질 분해물로 강하하여 자당 드롭 (즉, 상청액 인트 얻어진 오버레이P 1.2).
    5. 조심스럽게 스윙 버킷 로터의 버킷으로 튜브를 낮 춥니 다. 초 원심 분리기를 사용하여 4 ° C에서 18 XG에 100 분의 그라디언트를 원심 분리기.
    6. 원심 분리 후, 그라디언트가 안정 될 수 있도록 4 ° C에서 20 분 동안 자신의 양동이에 튜브를 둡니다.
  4. 자당 그라데이션 분류 (2 시간)
    1. 조심스럽게 초원 심 분리기 회 전자에서 하나의 초 원심 분리기 튜브를 제거하고 밀도 그라데이션 분별 시스템의 컬렉터 장치에 장착. 자외선 / VIS 검출기 (그림 1 상단 패널)와 260 nm에서 흡광도를 모니터링하는 1 ml의 분수를 수집합니다. 얼음에 수집 된 분수를 유지합니다.
    2. 관심있는 분은 30 ~ 40 μL의 분취 량을 준비 사용까지 -80 ° C에서 그들을 저장하기 전에 얼음에 보관하십시오. 두 개 이상의 냉동 - 해동 사이클을 시행 분취 또는 자당 분수를 사용하지 마십시오 (그림 1 하부 패널 참조).

원자 힘 현미경 2. 샘플 준비 (3 시간)

  1. 운모 시트를 벗겨, 테이프를 사용.
  2. DEPC-물 운모 시트를 3 ~ 4 회 반복하고 작은 페트리 접시에 놓습니다. 이어서 공기를 이용하여 표면을 건조.
  3. 1 mM의 NISO 4의 200 μL와 운모를 덮고 실온에서 3 분 동안 품어.
  4. 니켈 용액을 제거하고 공기를 이용하여 표면을 건조. 얼음에 운모와 페트리 접시를 배치하여 4 ℃에서 미래의 모든 단계를 수행합니다.
  5. 얼음에 1.4.2에서 얻은 나누어지는을 녹여 부드럽게 운모에 드롭하여 샘플 드롭을 모두 추가 할 수 있습니다. 100-200 μL 팁을 사용하여, 운모의 전체 표면 상에 샘플을 확산. 3 분 동안 얼음에 샘플을 품어.
  6. 200 μL 차가운 버퍼-AFM과 드롭에 의한 운모 시트 드롭을 커버 (표 1 참조)과 얼음에 1 시간 동안 품어.
  7. 액체 영상
    1. 조심스럽게 버퍼-AFM 제거하고 운모 시트를 3 ~ 4 시간을 씻어200 μL 차가운 버퍼-AFM와의 초과 크로스를 제거합니다. 이어서 운모 시트를 저온 세척 용액으로 3 회 세척 용액 몇 ㎕를 적용 운모 표면을두고있다 (표 1 참조).
    2. 3 (이미지 획득)을 가리 키도록 이동합니다.
  8. 공기 영상
    1. 조심스럽게 버퍼-AFM을 제거하고 여분의 크로스를 제거하기 위해 200 μl의 차가운 버퍼-AFM으로 운모를 3 ~ 4 회 반복한다. 그 후, 마이카를 차가운 세척액으로 3 회 반복한다 (표 1 참조)과 종이를 사용하여 과잉의 물을 배수.
    2. 부분적으로 개방 된 페트리 접시의 상단과 화학 후드에서 건조 샘플을 남겨주세요. 2 시간 후, 실온에서 페트리 접시와 저장소를 닫습니다. 그들이 년 동안 안정적으로 2 ~ 3 시간 후 샘플을 측정합니다.

3. 이미지 인식 (열 안정화 후 이미지 당 15 분)

주 : 운모에 고정화 Polysom​​es은 AC 모드를 사용하여, 공기 또는 액체에 이미징 될 수있다.

  1. 양면 테이프를 사용하여 샘​​플 홀더 운모 첨부.
  2. 제조사의 지시 다음 AFM 단계에서 샘플 홀더를 삽입합니다. 가능하면 영상은 액체, 시간 polysom​​e 안정성을 증가시키기 위해보다 낮은 온도 25 ° C에서 샘플을 유지하려고하는 경우.
  3. AC 영상에 적합한 캔틸레버를 선택하고는 제조업체의 지침에 따라 팁 홀더에 장착합니다. 여기에, 공기 이미징을위한 2-20 N / m 및 액체 이미징을위한 약 0.1 N / m 사이에 일정한 힘으로 사용 캔틸레버.
  4. 캔틸레버에 레이저 스폿을 조정하고 사분면 검출기 신호를 제로.
  5. 좋은 기회 구동 주파수를 선택하고 10 ~ 20 나노 미터의 크기로 캔틸레버를 구동한다.
  6. 팁이 표면에 결합 될 때까지 샘플에 접근.
  7. 적어도 512 × 512 픽셀 이미지 (픽셀 폭 <4 nm의)를 획득, 2 × 2 ㎛의 스캔 영역을 선택 라이브 배경 빼기 모드와 20 ~ 25 nm의 Z 스케일을 선택합니다.
  8. t 검사그 화상 범위 25 ~ 30 nm의 공기 및 액체 (25) 및 30 nm의 폭으로 확보 할 때 10 내지 15 사이의 높이에 의해 특징 원형 물체의 존재를 찾는. 날카로운 물체가 가시화 될 때까지 설정 값과 피드백 매개 변수를 조정합니다. 배경은 일부 2-4 나노 미터 높이 개체 (그림 2A와 B 참조), 좋은 샘플에서 상대적으로 평평하게 나타납니다.
  9. (포인트 3.8에 나타낸 바와 같이) 이미지가 잘 보이는 경우, 다른 샘플 영역에서 여러 (최소 10) × 2 미크론 스캔을 취득.
  10. (선택 과목). 필요한 경우, 선택된 polysomes의 높은 해상도 이미지를 획득 (도 2C 참조).
  11. 원자 현미경 이미지 임의의 기울기를 제거하고 효과를 표류를 해결하기 위해 소프트웨어 수정 (평면 감산 및 라인 별 보정 알고리즘)을 적용합니다.

4. 데이터 분석 (이미지 당 30 분)

  1. preferent : ImageJ에 (스케일 팩터를 적용 사양)에서 이미지 내보내기ially 예 무손실 압축 포맷을 이용하여 TIFF 포맷 (도 3a 참조).
  2. 샘플의 통계적 특성을 polysomes에서 리보솜 (그림 3B 참조) 계산과 계산하기 위해합니다 (ImageJ에 매크로 / 도구 세트 서브 디렉토리에 복사 할)이 ImageJ에 매크로 도구 세트의 RiboPick.ijm를 사용하여 (그림 3C 참조).
    1. 프로그램 초기화 <판독 화상> 도구를 사용하여 이미지를로드 시작.
    2. 표준 ImageJ에 <포인트 선택> 도구 (시프트 + 왼쪽 클릭은 ​​리보솜의 다중 선택을 할 수 있습니다)와 리보솜 센터를 선택합니다. 의 <마크 리보솜> 도구를 선택한 리보솜을 표시합니다. 리보솜 좌표는 사용자 정의 텍스트 창에 표시됩니다.
    3. 포인트 4.2.2에 명시된 절차를 반복 동일한 polysom​​e에 더 많은 변이를 추가합니다.
    4. 첫 번째로 마지막에 추가 리보솜에서 제거 <실행 취소 마지막 선택> 도구 (시작을 사용하여 잘못 표시 리보솜을 제거(212); 현재 polysom​​e 만).
    5. polysom​​e이 완료되면, <새 polysom​​e> 도구를 사용한다. polysom​​e 번호가 이미지에 오버레이로 추가로, 텍스트 창에 업데이트됩니다.
    6. 사용하여 리보솜 파일 (이미지의 기본 단위가 사용된다)와 픽업 리보솜과 polysom​​es을 요약하는 PNG 이미지를 좌표를 작성하는 <결과와 가까이 저장>. 원본 이미지는 저장되지 않고 닫힙니다.

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결과

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전체 마우스 뇌의 자당 그라데이션 polysomal 프로파일

그들의 무게와 크기에 따라 거대 분자를 분리 polysom​​al 프로파일 링하여 세포 용 해물에서 polysom​​es을 정화 할 수있다. polysom​​al 프로파일로, 이러한 예에서와 같이 배양 된 세포 또는 조직에서 얻은 세포질 해물은 (자신의 침강 계수에 따라 40S와 60S 서브 유닛, 80S 리보솜과 polysom​​es에서 무료로 RNA를 분리하는 초 원심 분리에 의해 선형 자당 기울기에로드 및 처리 그림 1 상단 패널). 254 nm에서 샘플 분획 수집 흡광도 사체 변이 당 상이한 수의 변이 또는 polysom​​es 농축 자당 분획의 분리를 가능하게한다. 분획 AFM 이미징 분취하고 -80 ° C (도 1에...

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토론

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DNA의 구조가 전사 및 염색질의 조직에서 유전자 발현의 전사 조절에 대한 우리의 이해를 발전와 프로세스를 설명하는 데 가장 중요한 것으로 입증 된 바와 같이, 이는 진실 이해력을 향상 polysom​​es의 조직 및 구조를 분석하는 것이 필수적이다 번역 및 규제.

전술 한 프로토콜에 부드럽게 평평한 표면에 고정화 polysom​​es의 최적 밀도는 AFM 영상 적합한 얻는다. 편리하게 제조 된 샘플이 조건을 이용하여 시간당 약 50 polysom​​es 더 분석 및 특성화를위한 준비를 얻을 수있다. 또한, 실온에서 건조 보관 샘플보다 1 년 후에 촬상에 적합한 것으로 증명되었다.

성공적으로 우리의 프로토콜 polysom​​e 이미지를 얻으려면 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 제대로 dissectio 직후 플래시 동결 된 조직을 사용하는n 및 RNA의 분해를 최소화하기 위해 -80 ℃에서 보관; mRNA의 리보솜의 해리를...

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공개 사항

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저자는 이 논문에서 경쟁하는 재정적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 이탈리아 트렌토 자치구(Provincia Autonoma di Trento)에서 자금을 지원한 AXonomIX 연구 프로젝트의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CycloheximideSigma01810용해물
DNAseIThermo Scientific89836용해물 준비
RiboLock RNAse 억제제Life TechnologiesEO-0381용해물 준비
DEPCSigma40718용해물 준비
Triton X100SigmaT8532용해물 DTT
Sigma43815용해물 준비
Sodium Deoxycholate시그마D6750용해물 미
세원심분리기 준비 Eppendorf5417R용
준비: SucroseSigmaS5016Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge, Beckman CoulterOptima LE-80KSucrose gradient centrifugation,
Ultracentrifuge, rotorBeckman CoulterSW 41, TiSucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube, Beckman Coulter331372Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System Teledyne Isco67-9000-176자당 구배 분획
AFM망명 연구암호 폴리솜 시각화
해제 , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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