이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
제브라피시(Danio rerio)는 척추동물의 발달을 연구하는 강력한 모델 유기체입니다. 제브라피시 배아 발달의 많은 측면이 형태학적 수준에서 설명되었지만, 유기체가 발달함에 따라 발생하는 세포 변화의 분자적 기초에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 최근 미세유체역학(microfluidics) 및 다중화 기술의 발전으로 이제 단세포에서 유전자 발현을 특성화할 수 있습니다. 이를 통해 특정 세포 집단의 개별 세포 간의 이질성을 조사하여 세포 아형을 식별 및 분류하고, 세포 분화 중에 발생하는 중간 상태를 특성화하고, 자극에 대한 차등 세포 반응을 탐색할 수 있습니다. 이 연구는 고처리량 멀티플렉싱 분석을 위해 제브라피시 배아에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 형광 마커가 있는 모든 제브라피시 배아 세포 유형에 빠르게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 확장은 단일 세포의 전사체를 완전히 특성화하기 위해 고처리량 염기서열분석 기술과 함께 사용될 수도 있습니다. 원리의 증거로, nkx2.5 양성 심장 전구세포에서 유래한 분리된 단일 세포에서 심장 분화 마커의 상대적 풍부도를 평가했습니다. 단일 세포 수준과 단일 시점에서의 유전자 발현을 평가함으로써, 이 데이터는 심장 전구세포(cardiac progenitor)가 분화된 자손(progeny)과 공존하는 모델을 뒷받침합니다. 여기에 설명된 방법 및 작업 흐름은 제브라피시 연구 커뮤니티에 광범위하게 적용할 수 있으며, 라벨링된 형질전환 어선과 미세유체역학 기술에 대한 액세스만 필요합니다.
서론
세포 및 분자 생물학의 현재 대부분의 연구는 인구의 평균을 기준으로합니다. 작은 인구가 생물학적 과정과 질병의 결과에 중요한 역할을 할 수 있기 때문에, 중요한 생물학적 이벤트는 이러한 기존의 인구 기반의 분석에 의해 마스크 될 수있다. 단일 세포 수준에서 이질적인 집단에서 유전자 발현을 이해하는 것은 (그리고있다) 관련 생물학적 및 임상 통찰력 1,2로 이어질 수 있습니다. 배아 발달 과정에 관심 셀의 큰 모집단에서 전구 세포는 종종 소수가있는 도전 결국 세포의 운명 결정 (3)을 개시 유전자 발현의 미묘한 변화를 감지 할 수있다. 마찬가지로, 단일 셀 타입 미세 4에 응답하여 상이한 발현 프로파일을 가질 수있다. 예를 들어, (예., 대동맥 또는 신장) 같은 기관 또는 다른 기관에 거주 내피 세포는 일반적인 morp을 공유에도 불구하고 상당한 이질성을 전시hological 및 기능 기능 5. 또한, 동일한 종양 채우는 암세포는 단일 세포 수준에서 6 분 프로필 또는 돌연변이를 변화 할 수있다.
모델 시스템에서, 하나의 세포에서 transcriptomics 성공적으로 새로운 세포 집단을 식별 세포 분화 동안 발생하는 중간 상태를 특징으로하고, 7, 8, 9를 자극에 차등 세포 반응을 공개했다. 이러한 통찰력은 기존의 인구 기반 연구에서 마스크 된 것이다. 제브라 피쉬 배아 줄기, 전구의 대단히 과소 활용 소스, 그리고 개발 과정에서 단일 세포의 이질성 및 세포 정체성의 분자 규제의 질문을 탐험 세포를 분화. 그들의 매우 틀에 박힌, 생체 개발 및 유전자 조작의 용이성은 그들이 방법 10,11위한 훌륭한 모델 시스템합니다. 특히, 단일 세포 세대의 해석에 큰 제한E 발현 데이터는 개발 중에 신규 중간체 셀 상태의 신뢰성 식별 조직 수집 9 조심 타이밍을 필요로한다는 것이다. 이것은 캡처 세포 이질성 연령 의존적 세포 분화 제시 유전자 발현 한 시점에서 조직 내의 얼룩이보다 이질성을 나타낸다는 것을 보장 할 필요가있다. 마우스에 비해, 제브라 피쉬 배아 발달 정확하게 배아 (12)의 다수를 통해 동기화 될 수있다. 또한, 큰 크기의 클러치, 제브라 피쉬 배아 줄기 세포 및 선조 세포의 풍부한 공급원으로서 사용될 수있다.
이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아 세포를 분리하고 QRT-PCR 유전자 발현 분석을위한 시판 통합 마이크로 유체 회로 (IFC) 칩 autoprep 시스템을 사용하여 단일 세포를 포착하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 전체 처리량을 포함하는 임의의 다중 검정법 빠르게 양도 될 수있다휴대 이질성 (13)의보다 포괄적 인 분석이 가능 사체 서열. 또한, 기존의 유전자 발현 분석에 여러 가지 이점을 제공한다. 단일 세포 분리 프로토콜 하류 어플리케이션에 포함되어 손상된 세포의 비율을 FACS 감소 후 높은 생존율을 산출한다. IFC를 사용하여 캡처 된 세포를 직접 포획 율을 평가하고 세포 형태 학적 상태를 평가하는 것으로 관찰 될 수있다. 또한,이 프로토콜은 미세 유체 세포 캡처 기술 만 표시 형질 전환 어류 라인과 접근을 필요로 제브라 피쉬 연구 커뮤니티에 광범위하게 적용 할 수있다.
원리 증명으로, 심장 전구 세포로부터 유도 된 단일 세포를 격리시키고, IFC 칩 캡처하고 심장 분화 마커의 상대적인 존재 량 QRT-PCR에 의해 측정 하였다. 단일 세포 수준에서의 유전자 발현 분석은 심장 전구 세포가 differe 공존 것을 증명ntiating 자손. 심장 전구 세포의 단일 셀 프로파일에서 얻은 통찰력은 기존의 인구 기반의 분석에 마스크되었을 수 있습니다 척추 개발하는 동안 심장 전구 세포 간의 유전자 발현 패턴의 이질성에 광명을 비춰 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜은 배아를 생산하는 라이브 성인 지브라 피쉬의 사용을 필요로한다. 배아는 조직 수집을 위해 수확. 이 실험을 수행하기 위해 적절한 윤리 리뷰 보드의 승인을 얻기 위해 필수적이다.
1. 단계적 배아를 구합니다
- 실험 전날, 번식을위한 건강한 성인 제브라 피쉬를 준비합니다. 한 남자와 사육 탱크에 명확한 구분선의 반대편에 한 여자를 놓습니다.
- 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 충분한 배아 생산을 위해 필요한만큼 사육 탱크 1.1를 반복합니다. 관심의 세포 유형에 형광 단백질을 표현 야생 형 물고기와 형질 전환 어류 모두에서 배아를 가져옵니다.
주의 : 단계 2-8 하향 애플리케이션에 필요한 배아의 개수는 관심 시점에서 관심 셀의 상대적인 풍부함에 의존한다. 이 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 200 배아는 2,000-5,000 정렬 된 세포를 생성 할 때 C관심의 ELL 학생은 24 HPF (시간 후 수정)에서 <전체 세포의 1.0 %를 나타냅니다. - 다음날 아침, 신선한 사육 탱크에 물고기를 전송하여 빵 가루 탱크에 물을 변경하고 분배기를 제거합니다. 사육을 장려하기 위해 각도로 탱크를 기울입니다.
- 무대 배아를 수집합니다.
- 매 15 분, 신선한 사육 탱크에 성인을 전송하고 차 여과기를 통해 남아있는 계란을 전달하여 배아를 수집합니다.
참고 : 비교 밀도와 온도로 유지하면 Zebrafish의 배아 동 기적으로 개발할 수 있습니다. - (1 L 증류수에 0.21 g / L 인스턴트 오션 염) 계란 물과 계란을 씻어 배양 접시에 전송합니다. 공기 순환으로 28.5 ° C에서 습한 인큐베이터로 배양 접시를 전송합니다.
- 매 15 분, 신선한 사육 탱크에 성인을 전송하고 차 여과기를 통해 남아있는 계란을 전달하여 배아를 수집합니다.
- 두 시간 마지막으로 수집 한 후, 정렬 10cm 배양 접시에, 다세포 배아를 수정 된과 접시 당 50 배아에 밀도를 줄일 수 있습니다. 하나, 15에서 선택 배아다운 스트림 응용 프로그램에 대한 수집 분 시간 창. 28.5 ° C에서 배아를 품어.
참고 : 예를 들어 8:30 8:45 9:00 9시 15 분 9:30 9:45 10:00 10:15 오전 배아를 수집합니다. 수정 된 배아의 최대 수는 9시에 수집 된 클러치의 경우 시점에서 비교, 다음, 다운 스트림 응용 프로그램 만이 배아를 사용합니다.
2. 단일 세포 해리에 대한 설정
- 이전에 관심 (18 HPF)의 시점에 약 30 분 잘 집게로 수동으로 융모막에서 배아를 제거합니다.
- 수집하고 각 조건에 대해 다음 라벨을 두 개의 2 ml의의 microcentrifuge 튜브, 한 40 μm의 셀 스트레이너, 하나의 35mm 세포 배양 접시, 그리고 35 μm의 셀 스트레이너 얹어 두 FACS 튜브.
- 얼음에 다음과 같은 시약을 진정 : 계란 물 1L에 증류수를 0.21의 /의 L 인스턴트 오션 염을 함유 55 mM의 염화나트륨, 1.8 mM의 KCl을, 1.25 mM의 NaHCO3을 함유 버퍼 드 - yolking; 및 FACS 버퍼 라이 보 비츠의 L-15 5 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청을 포함하는 매체.
- RT에 셀 해리 시약 1의 샘플 당 1 ml에 가져와. 얼음에 샘플 당 해동 1 ml의 세포 해리 시약 2. 사용 직전에 실온으로 가져옵니다.
3. 단일 세포 해리
- 넓게 보아 유리 피펫을 사용하여, 달걀 물의 최소 부피 2 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 100-300 배아를 옮긴다.
- 20 분 동안 얼음에 튜브를 1 ml의 얼음처럼 차가운 물과 계란 물을 1,8- 침지하여 배아를 안락사.
주의!이 (보조 안락사와 같은 세포 분리 한 다음 얼음에 재미)이 안락사 방법에 대한 적절한 제도적 동물 보호 감독위원회의 승인을 받아야하는 것이 중요합니다. 표준 안락사는 일반적으로 배아 그들이 생존 세포를 얻기에 적합하지 않은 냉동 후 표백된다 삼일에게 후 수정을 <해야합니다. - 1 ml의 얼음처럼 차가운 달걀 물과 배아 두 번 씻으십시오. 세척, 달걀 물과 계란 물을 추가하는 P1000을 제거하기 위해 넓은 구멍 유리 피펫을 사용합니다.
- P1000 팁으로 8 ~ 12 시간을 1 ml의 Deyolking 버퍼와 배아의 물을 교체하고 분쇄하여 의해 노른자를 제거하거나 노른자가 용해 될 때까지 태아의 몸은 볼 수 있습니다.
- 1 분 300 XG에서 원심 분리하여 조직을 수집합니다. 부드럽게 조직 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 1 ml의 달걀 물에 다시 일시 중지합니다.
- 반복 세 세척의 총 단계 3.5하지만, 최종 세척에, 1 ml의 RT 셀 해리 시약 (1)에 다시 일시 중지합니다.
- 수평으로 배치 된 튜브 실온에서 10 분 동안 세포 해리 시약 1에 품어. 모든 2 ~ 3 분, 부드럽게 응집을 방지하기 위해 P1000 피펫으로 씹다.
참고 : 분쇄 단계 동안 부드럽게 샘플을 처리합니다. 언젠가 하나의 큰 덩어리는 배아 몸의 복잡하게 얽힌에서 튜브를 형성 할 것이다. 이 뜻부드러운 분쇄에 힘 입어 추가로 소화를 분산. VORTEX하지 않습니다. - 3 분 300 XG에서 원심 분리하여 조직을 수집합니다. 1 ml의 세포 해리 시약 2 상층 액과에 resuspend를 제거합니다.
- 실온에서 5 ~ 15 분 동안 품어. 수평 튜브를 놓습니다. 모든 2 ~ 3 분, 부드럽게 응집을 방지하기 위해 씹다. 매 5 분, 소화의 진행 상황을 평가합니다.
- 소화의 진행 상황을 평가 세포 배양 접시 위에 방울로 18 μL FACS 버퍼 및 피펫으로 2 μl의 상층 액을 희석합니다.
- 샘플을 통해 커버 슬립을 놓고 10 배와 20 배 배율에서 조직 문화 현미경으로 관찰한다.
주 : 준비 단일 세포, 작은 클러스터, 대형 클러스터 및 가끔 대부분-그대로 배아 체의 혼합으로 표시됩니다. - 시각적으로 단일 세포와 작은 클러스터 인 준비의 비율을 평가합니다.
주 : 오버 소화가 생존 능력을 감소; 아래 - 소화 단일 세포 수율을 감소시킬 것이다.
- 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 세포의 준비를 수집합니다. 뜨는을 취소하고 차가운 FACS 버퍼 1 ㎖에 다시 일시 중지합니다.
- FACS 버퍼와 40 μm의 셀 스트레이너를 묻 힙니다. 35mm 세포 배양 접시에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과한다. 버퍼를 정렬 한 ML의 FACS로 셀 스트레이너를 한 번 씻으십시오.
- 이 용액에 마이크로 원심 튜브에 관류 이동. 5 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 세포를 수집하고 100 ㎕의 FACS 버퍼에 다시 일시 중지합니다.
- 혈구를 사용하여 세포 수율을 계산합니다. 또한 선택의 FACS 기계 권장 ml의 또는 최적의 농도 당 5 × 6 세포 샘플을 희석. 혈구에 세포 수율을 계산하면 선택적, 트리 판 블루 Counterstain과 죽은 세포를 FACS 정렬하기 전에 셀 준비의 가능성을 확인합니다.
참고 : 너무 정렬 시간을 초과하는 금액을 취할 것 희석되는 물질. 너무 C 있습니다 준비oncentrated이 다량으로 응집하는 경향이 순수한 인구를 정렬 최적입니다. - 예약은 각 샘플의 ~ 20 %는 흠없는 컨트롤을 사용합니다. 추가하여 나머지 샘플, 얼룩 죽은 세포에 대한 형광 라이브 / 죽은 (L / D) 차별은 각 샘플에 염료. 세척하지 마십시오.
참고 핵산은 L / D 염료로서 사용될 수있다 손상된 세포막 얼룩 세포 침투 상관 형광 염료, 형광 스펙트럼의 관심 선택과 형광 표지 세포의 FACS 시스템과 호환 한한다.- 일부 세포가 FACS 정화에 운송 죽을와 정렬 된 인구에서 제외해야로서 염료를 추가 한 후 준비를 세척하지 마십시오.
- 20 μL FACS 완충액으로 FACS 튜브 덮인 35 μm의 셀 스트레이너를 묻 힙니다. 스트레이너에 셀을 추가하고 중력에 의해 수집합니다. 얼음에 보관하십시오.
4. FACS 농축
- 하나의 위해 풍부하게 FACS를 사용하여형광 마커를 발현하는 살아있는 세포.
- 측면 산란 진폭 (SSC-A) 대 앞으로 분산 형 (FSC-A) 진폭의 산포도에 파편으로부터 세포를 구분하는 게이트를 설정, 모두 선형 스케일링.
주의! Zebrafish의 세포는 일반적으로 마우스 나 인간의 세포보다 작습니다. 이것은 세포와 파편 사이의 낮은 기저 분리에 반영됩니다. - 4.1.1에서 설정 한 문에서 하나의 셀에 대한 풍부하고 앞으로 분산 높이 (FSC-H) 및 로우 사이드 분산 높이 (SSC-H)의 산포도를 사용하여 다량, 선형 스케일링을 모두 제외 게이트를 설정합니다.
참고 : 불균형 높은 FSC-H 낮은 SSC-H와 세포 가능성이 다량하고 분류에서 제외됩니다. - 단색 제어를 사용 4.1.2 게이트 집합, 선형 스케일링 및 채널의 진폭 FSA-A의 산점도만을 사용 생균을 포함하는 게이트를 설정 로그 스케일링 L / D 얼룩을 검출하기 위해 사용된다. L / D 음성 세포를 포함합니다.
- 에서게이트는 단일 색상 제어를 이용하여 4.1.3 설정 로그 스케일링 형광 단백질 세포 마커를 검출하기 위해 사용되는 채널의 선형 스케일링 및 진폭 FSA-A의 산포도를 이용한 포지티브 형광 만 생균을 포함하는 게이트를 설정할 . 양성 세포를 포함합니다.
- 필요한 경우 L / D 염색 및 형광 단백질의 스펙트럼 사이의 간섭을 고려하여, 어떤 보상 컨트롤을 설정합니다.
- 측면 산란 진폭 (SSC-A) 대 앞으로 분산 형 (FSC-A) 진폭의 산포도에 파편으로부터 세포를 구분하는 게이트를 설정, 모두 선형 스케일링.
- 단계 4.1에서 설정 한 게이트 모두에 해당 셀에 설정 정렬 논리.
- 이중 라벨 세포를 이용한 세포 분류를위한 게이팅 확인합니다.
참고 : 세포보다는 파편, 단일 세포보다는 다량, L / D 부정과 형광 양성 세포 수 있습니다 정렬 세포.
- 이중 라벨 세포를 이용한 세포 분류를위한 게이팅 확인합니다.
- 얼음에 microcentrifuge 관에서 차가운 FACS 버퍼의 5 μL에 관심있는 인구에서 정렬 2,000-4,000 세포. 휴대가 가능한 최저 압력을 사용하여 정렬하는 동안 세포에 전단과 부담을 최소화하기 위해다소.
참고 : FACS 버퍼의 5 μl의 방울은 FACS 기계를 종료 세포에 대한 쿠션 역할을한다. 직접 FACS 버퍼 2,000-4,000 세포를 수집하기 전에 IFC 칩 상에 로딩 원심 분리의 필요성을 제거한다. 세포 펠렛에서 서로을 준수 할 경우 원심 분리가 다량의 형성으로 이어질 수 있기 때문에이 전략을 권장합니다. - 후 정렬 생존 분석을 평가합니다.
- L / D 얼룩 1,000 희석 전송 1 μL 버퍼 1 정렬 100 ㎕의 FACS와 신선한 FACS 튜브에 세포를 분류. 단계 4.1의 게이팅 전략 FACS 분류기를 통해 세포를 전달합니다. L의 비율을 사용하여 / 긍정적 인 부정적인 D는 정렬 된 세포의 생존 능력을 평가합니다.
미세 유체 칩에 5.로드 셀
- 혈구를 사용하여, 농도와 정렬 셀 크기 모두를 측정한다.
- 적어도 10 μL로 정렬 된 세포를 희석. 5 μ의 나누어지는을 희석5 ㎕의 트리 판 블루 L 세포. 혈구에로드 커버 슬립을 적용합니다.
- 혈구의 4 × 4 격자의 모든 세포의 명 시야 이미지를 수집합니다. 생균들의 수를 카운트하고 살아있는 세포 / ml을 계산한다. 라이브 세포는 트리 판 블루를 차지하지 않습니다.
주 : 모든 살아있는 세포의 직경을 측정하기 위해 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. 셀 크기의 평균치와 표준 편차를 산출하고, 관심있는 셀 크기 범위에 대한 적절한 IFC 판을 선택한다. 셀 크기 범위 IFC 플레이트 셀 크기 범위에 걸쳐있는 경우, 관심있는 셀의 전체 범위를 캡쳐하기 위해 여러 판을 사용한다.
- 제조업체의 지침에 따라 IFC 플레이트에로드 셀 (자료 참조).
- 1 × 106 세포 / ㎖로 세포를 희석하고 제조업체의 지침에 따라 부력 최적화를 수행합니다.
주 : 부력 최적화 셀 아래쪽 싱크하지도 로딩 아의 상단에 떠있는 것을 보장하지도IFC 칩 상에 최적의 로딩 리터. 세포에 버퍼의 비율은 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 6 범위 수 있습니다 4-7 : 세포의 3 : 버퍼를. - 프라임 - IFC 접시에 세포를 추가합니다. 로드 호환 유체 기계로 판 및 마이크로 유체 회로를 통해 캡처 차선으로 세포를 밀어 셀 로딩 스크립트를 실행합니다.
- 1 × 106 세포 / ㎖로 세포를 희석하고 제조업체의 지침에 따라 부력 최적화를 수행합니다.
- 세포가 IFC 접시에 캡처 사이트에 박혀 있는지 확인합니다.
- 유체 기계에서 IFC 플레이트를 제거합니다. 플레이트 어댑터가 장착 된 현미경에 IFC 플레이트를 탑재합니다.
- 10 배 배율에서 각 캡처 사이트에 대한 밝은 필드 및 형광의 스냅 샷을 수집합니다.
참고 : 브라이트 캡처 시간은 램프의 강도에 따라 10 ~ 50 밀리의 범위 일 수있다. 형광 촬영 시간은 형광 휘도에 따라 250-750 MS 범위 일 수있다. 광 손상을 방지하기 위해 세포의 과도한 노출을 피하십시오.
6. cDNA를 합성
- I에 따라 현장에서 세포 용해를 수행FC 플레이트 제조업체의 지침.
- IFC 플레이트에 웰에 용해 버퍼를 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 호환되는 유체 기계 및 실행 세포 용해 스크립트 상에로드 플레이트.
- IFC 플레이트 제조업체의 지침에 따라 역전사를 수행합니다.
- IFC 판에 역전사 시약을 추가합니다. 호환되는 유체 기계 상에로드 플레이트. 역전사 스크립트를 실행합니다. 샘플 사이클링 조건 : 5 분 85 ° C에서 다음 1주기를 10 분 동안 25 ° C에서 1주기, 1 시간 동안 42 ° C에서 1주기.
- IFC 플레이트 제조업체의 지침에 따라 유전자 특이 적 프로브를 미리 증폭을 수행합니다.
참고 : 낮은 복사 번호와 자신의 큰 특이성으로 인해, 인터 칼 염료와 함께 사용하기에 최적화 된 형광 표지 된 프로브가 아닌 프로브를 사용합니다.- 풀 프라이머 및 최종 180 nM의 각각에 희석. IFC 판에 풀 프라이머를 추가합니다. 호환 fluidi 상에로드 플레이트CS 기계. 실행 프리 앰프 스크립트.
- 다음 사이클의 조건으로 미리 증폭을 수행 한 사이클을 95 ° C에서 10 분 동안, 그 다음 18주기를 4 분 동안 60 ° C에서 15 초 후, 95 ℃에서 어닐링과 연장 변성. 상점은 수확 할 때까지 4 ° C에서의 cDNA를 미리 증폭. 사용할 때까지 -20˚C에서 제조업체의 지침 및 저장에 따른 미세 유체 플레이트에서 수확 된 cDNA.
단일 대상 QRT-PCR을위한 단일 세포에서 7. cDNA를
- 제조업체의 지침에 따라 25 μl를 희석 시약에서 cDNA를 희석.
참고 : 대략적인 최종 수율은 셀 당 사전 증폭 된 cDNA를 28 μL이다. QRT-PCR에서 노 템플릿 컨트롤로 사용하기 위해 희석제의 분취 량을 보유하고 있습니다.- 시야 단계 5.3.2에 기록 된 형광 이미지를 참조하면, 각 캡처 사이트를 점수. 수동 계산 세포의 수를 기록한다. 평가하고 각 셀 독감인지 기록orescent.
주 : 각 개별 사이트가 포함될 수 있습니다 0> 1 셀이 여러 셀 및 / 또는 식별 할 수없는 파편을 포함 캡처 사이트를 포함 하나, 또는> 1 전지. 이미지가 충분한 품질 인 경우, 화소 값은 형광 신호의 강도를 정량화하는 데 할당 될 수있다.
- 시야 단계 5.3.2에 기록 된 형광 이미지를 참조하면, 각 캡처 사이트를 점수. 수동 계산 세포의 수를 기록한다. 평가하고 각 셀 독감인지 기록orescent.
- QRT-PCR 분석을위한 샘플을 선택합니다.
- 긍정적 인 형광과 정확한 1 셀을 포함하는 단계 7.2에서 식별 된 캡처 사이트에서의 cDNA 샘플을 선택합니다. 각 샘플에서의 cDNA의 풀 1 μL 씩.
주 :이 관심 유전자가 선택된 셀의 모든 표현되는지 여부를 결정하는 데 사용되는 "풀"양성 대조군이다. - 음성 대조군과 정확히 0 셀이 적어도 하나의 캡처 사이트에서의 cDNA를 선택합니다. 노 템플릿 제어와 같은 단계 7.1.2에서 희석제를 사용합니다.
- 긍정적 인 형광과 정확한 1 셀을 포함하는 단계 7.2에서 식별 된 캡처 사이트에서의 cDNA 샘플을 선택합니다. 각 샘플에서의 cDNA의 풀 1 μL 씩.
- QRT-PCR 분석을 실행합니다.
- 단계 6.4.1에서 미리 증폭에 사용되는 전용 프로브를 사용합니다. triplicat의 모든 샘플을로드이자형. 1주기 50 ° C 2 분, 1 사이클 10 분, 1, 60 ° C에서 다음 95 ° C 15 초에서 소둔 및 확장을 변성 40주기 95 ° C : 384 웰 플레이트에 10 ㎕의 반응 사이클링 조건 분.
8. 데이터 분석
- 표준 겔 전기 영동에 의해 QRT-PCR 제품을 확인합니다. 제품을 확인하는 것은 예상 분자량에서 단일 밴드 (각 프로브에 따라 다릅니다).
참고 : 프로브 부적절한 크기로 다중 대역 또는 단일 밴드를 생성하는 경우, 특이도는 의문이며,이 분석에서 유전자를 제외합니다. - 어떤 이상 (14)에 대한 모든 증폭 곡선과 계정을 검사합니다. 각 샘플 / 유전자의 조합 (15)에 대한 평균 CT 값을 계산한다.
참고 : 긍정적 인 컨트롤에 대한 CT 값은 일반적으로 10-30까지 다양합니다. 음성 대조군에 대한 CT 값은 일반적으로 35 ~ 40 (더 증폭)에 이르기까지 다양. CT 값은 30 ~ 35은 매우 낮은 표현으로 간주됩니다및주의 14 해석되어야한다. - 보고서 데이터
- 샘플 CT = 10 ~ 30에 빠질 경우, 데이터는 제어 샘플 성적 증명서 풍부 상대의 배의 변화로보고 할 수있다.
참고 : (- ΔΔCT) 변화를 접어은 2 ^ 동일 ΔCT가 하우스 키핑 유전자로부터 샘플의 평균 CT를 빼서 하우스 키핑 유전자에 상대적이며 ΔΔCT 샘플 및 양성 대조군 (15) 사이의 ΔCT의 차이입니다.
- 샘플 CT = 10 ~ 30에 빠질 경우, 데이터는 제어 샘플 성적 증명서 풍부 상대의 배의 변화로보고 할 수있다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
원리의 증거로, 유전자 발현이 심장 개발하는 동안 차별화 역학을 탐구하는 평가 하였다. 제브라 피쉬, 심장 조상들은 선형 심장 튜브를 형성하도록 융합 전방 측 방향 플레이트 중배엽 마이그레이션 중배엽 세포 집단에서 발생한다. 융합에 앞서, 심장 선조 심장 선조 16,17의 초기 특정 마커 생각된다 전사 인자 nkx2.5 (NK2의 호 메오 5) 표현하기 시작한다. 여기서, 전술 한 바와 BAC 형질 전환 어류의 Tg (nkx2.5 : ZsYellow) 18 nkx2.5을 축약 : ZsY는 18 체절 단계, 18 시간 게시물 수정 (HPF) (12)에서 단일 세포에서 심장 분화 마커를 조사하기 위해 사용되었다. 이것은 ZsYellow 신호 시각적 검출되었을 때의 초기 시점이었다. 이전에이 유전자 변형 라인에서 기술 한 바와 같이, Z...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본원에 기재된 방법은 하나의 심장 유전자 집합의 발현을 평가하기 위해 마이크로 유체 보조 된 단일 셀 캡쳐 시스템에서 사용하기 위해 제브라 배아 심장 선조 세포 집단을 풍부하게하는 세포 형 특이 적 프로모터의 제어하에 형광 단백질의 발현을 사용하여 세포. FACS 레이저 여기 및 발광 기능은 원하는 형광 물질 (들)과 호환되는지 다만,이 방법은 형광 리포터 라인에 대해 사용될 수있다. 많은 제브라 리포터 라인 이미 존재하며, 신규 한 기자 반송 형질 전환 어류는 적은 3 개월에서 생성 될 수있다. 또한 본 작업 플로우는 단일 세포 RNA 서열에 대한 전체 사체로부터 cDNA를 생산하는 데에 적합 할 수있다. 이를 위해 5-7 RNA 서열 분석에 적합한 라이브러리를 생성하는 cDNA를 제조하기위한 최적의 화학 반응에 사용하기 위해 약간 수정 될 필요가 단계. 그러나 인구의 이질성을 확인하는 것이 좋습니다높은 처리량 시퀀싱 애플리케이션을 추구해하기 전에 여기에 설명 된 방법을 이용하여.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 생선 재고에 대해 C. Geoffrey Burns 박사에게 감사드립니다. 저자들은 이 프로젝트를 가능하게 하는 자원을 제공해 준 UNC 유세포 분석 핵심 시설, UNC-CGIBD AAC 코어, 동물 관리를 위한 ZAC 시설에 감사를 표합니다. L.S.는 NIH T32 보조금 HL069768-13(PI, Nobuyo Maeda)의 지원을 받습니다. N.F.는 NSF 대학원 연구 펠로우십 NSF-DGE-1144081의 지원을 받습니다. 이 연구는 NIH P30DK034987 보조금(UNC Advanced Analytics Core), 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 13SDG17060010 및 Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13(Qian 박사에게) 및 NIH R00 HL109079 보조금(Liu 박사에게)의 지원을 받았습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Supplies | |||
| Dumont #5 집게 | Fine Science Tools | 11254-20 | 배아에서 융모막 제거용 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40um 세포 여과기 | Biobasic | SP104151 | |
| 35mm 배양 접시 | Falcon | 351008 | |
| 35um 셀 스트레이너 | Falcon | 352235 | |
| P1000 및 | 팁 Rainin | 17005089 | |
| P20 및 팁 | Rainin | 17005091 | |
| IFC 칩 제조업체 프로토콜 | Fluidigm | 100-6117 | 버전 100-6117 E1이 대표적인 실험에 사용되었습니다 |
| . 배아 이식 | |||
| 성체 야생형 제브라피시 | N/A | AB 계열 | |
| 성체 형질전환 제브라피시 | N/A | Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | 물에 재고를 만들고 탈노른자 완충액에 사용 |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | 물에 재고를 만들고 탈노른자 완충액 |
| NaHCO3 | Sigma에 사용 Aldrich | S6014 | 물에 스톡을 만들고 탈노른 완충제에 사용 |
| Leibovitz의 L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | 열 비활성화; FBS의 모든 브랜드는 미세해야 합니다 |
| 세포 해리 시약 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | 실온에서 보관하십시오. |
| 세포 해리 시약 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; 얼음에서 해동; 사용 전에 실온에 두십시오 |
| pronase (선택 사항) | Sigma | P5147 | |
| L/D 염료 - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | 유세포 분석에 적합한 모든 살아있는/죽은 염색제가 작동합니다 |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| IFC 플레이트 사용 및 qRT-PCR용 시약 | |||
| 유전자 특이적 프로브 | 프로브는 실험에 따라 다릅니다 | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan 프로브 gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan 프로브 nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan 프로브 myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan 프로브 vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan 프로브 isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | Life Technologies | 4369016 | |
| IFC 제조업체의 프로토콜 | |||
| C1 시약 키트 | : Fluidigm | 100-5319 | IFC 플레이트에 세포를 로딩하기 위한 시약 |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | 역전사 및 사전 증폭 단계용 시약 |
| 분자 생물학 품질 | 물 코닝 | 46-000CM | |
| C1 IFC 프리 앰프 (5-10 um) | 이드 임 | 100-5757 | IFC 플레이트 스몰 셀 용 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep 기계 | Fluidigm | 100-5477 | IFC 플레이트용 |
| 혈구계를 사용하십시오 | Sigma Aldrich | Z359629 | 세포 계수 및 세포 크기 평가용 |
| 해부 현미경 | 융모막에서 배아 제거용 | ||
| 조직 배양 현미경 | 단일 세포 소화 평가용 | ||
| FACS 기계 | 관심 세포 분리용 |
참고문헌
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
