이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라피시(Danio rerio)는 척추동물의 발달을 연구하는 강력한 모델 유기체입니다. 제브라피시 배아 발달의 많은 측면이 형태학적 수준에서 설명되었지만, 유기체가 발달함에 따라 발생하는 세포 변화의 분자적 기초에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 최근 미세유체역학(microfluidics) 및 다중화 기술의 발전으로 이제 단세포에서 유전자 발현을 특성화할 수 있습니다. 이를 통해 특정 세포 집단의 개별 세포 간의 이질성을 조사하여 세포 아형을 식별 및 분류하고, 세포 분화 중에 발생하는 중간 상태를 특성화하고, 자극에 대한 차등 세포 반응을 탐색할 수 있습니다. 이 연구는 고처리량 멀티플렉싱 분석을 위해 제브라피시 배아에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 형광 마커가 있는 모든 제브라피시 배아 세포 유형에 빠르게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 확장은 단일 세포의 전사체를 완전히 특성화하기 위해 고처리량 염기서열분석 기술과 함께 사용될 수도 있습니다. 원리의 증거로, nkx2.5 양성 심장 전구세포에서 유래한 분리된 단일 세포에서 심장 분화 마커의 상대적 풍부도를 평가했습니다. 단일 세포 수준과 단일 시점에서의 유전자 발현을 평가함으로써, 이 데이터는 심장 전구세포(cardiac progenitor)가 분화된 자손(progeny)과 공존하는 모델을 뒷받침합니다. 여기에 설명된 방법 및 작업 흐름은 제브라피시 연구 커뮤니티에 광범위하게 적용할 수 있으며, 라벨링된 형질전환 어선과 미세유체역학 기술에 대한 액세스만 필요합니다.
서론
세포 및 분자 생물학의 현재 대부분의 연구는 인구의 평균을 기준으로합니다. 작은 인구가 생물학적 과정과 질병의 결과에 중요한 역할을 할 수 있기 때문에, 중요한 생물학적 이벤트는 이러한 기존의 인구 기반의 분석에 의해 마스크 될 수있다. 단일 세포 수준에서 이질적인 집단에서 유전자 발현을 이해하는 것은 (그리고있다) 관련 생물학적 및 임상 통찰력 1,2로 이어질 수 있습니다. 배아 발달 과정에 관심 셀의 큰 모집단에서 전구 세포는 종종 소수가있는 도전 결국 세포의 운명 결정 (3)을 개시 유전자 발현의 미묘한 변화를 감지 할 수있다. 마찬가지로, 단일 셀 타입 미세 4에 응답하여 상이한 발현 프로파일을 가질 수있다. 예를 들어, (예., 대동맥 또는 신장) 같은 기관 또는 다른 기관에 거주 내피 세포는 일반적인 morp을 공유에도 불구하고 상당한 이질성을 전시hological 및 기능 기능 5. 또한, 동일한 종양 채우는 암세포는 단일 세포 수준에서 6 분 프로필 또는 돌연변이를 변화 할 수있다.
모델 시스템에서, 하나의 세포에서 transcriptomics 성공적으로 새로운 세포 집단을 식별 세포 분화 동안 발생하는 중간 상....
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프로토콜
이 프로토콜은 배아를 생산하는 라이브 성인 지브라 피쉬의 사용을 필요로한다. 배아는 조직 수집을 위해 수확. 이 실험을 수행하기 위해 적절한 윤리 리뷰 보드의 승인을 얻기 위해 필수적이다.
1. 단계적 배아를 구합니다
- 실험 전날, 번식을위한 건강한 성인 제브라 피쉬를 준비합니다. 한 남자와 사육 탱크에 명확한 구분선의 반대편에 한 여자를 놓습니다.
- 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 충분한 배아 생산을 위해 필요한만큼 사육 탱크 1.1를 반복합니다. 관심의 세포 유형에 형광 단백질을 표현 야생 형 물고기와 형질 전환 어류 모두에서 배아를 가져옵니다.
주의 : 단계 2-8 하향 애플리케이션에 필요한 배아의 개수는 관심 시점에서 관심 셀의 상대적인 풍부함에 의존한다. 이 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 200 배아는 2,000-5,000 정렬 된 세포를 생성 할 때 C관심의 ELL 학생은 24 HPF (시간 후 수정)에서 <전체 세포의 1.0 %를 나타냅니다. - 다음날 아침, 신선한 사육 탱크에 물고기를 전송하여 빵 가루 탱크에 물을 변경하고 분배기를 제거합니다. 사육을 장려하기 위해 각도로 탱크를 기울입니다.
- 무대 배아를 수집합니다.
- 매 1....
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결과
원리의 증거로, 유전자 발현이 심장 개발하는 동안 차별화 역학을 탐구하는 평가 하였다. 제브라 피쉬, 심장 조상들은 선형 심장 튜브를 형성하도록 융합 전방 측 방향 플레이트 중배엽 마이그레이션 중배엽 세포 집단에서 발생한다. 융합에 앞서, 심장 선조 심장 선조 16,17의 초기 특정 마커 생각된다 전사 인자 nkx2.5 (NK2의 호 메오 5) 표현하기 시작한다. 여기서, 전술 한 바와 BAC 형질 전환 어류의 Tg (nkx2.5 : ZsYellow) 18 nkx2.5을 축약 : ZsY는 18 체절 단계, 18 시간 게시물 수정 (HPF) (12)에서 단일 세포에서 심장 분화 마커를 조사하기 위해 사용되었다. 이것은 ZsYellow 신호 시각적 검출되었을 때의 초기 시점이었다. 이전에이 유전자 변형 라인에서 기술 한 바와 같이, Z.......
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토론
본원에 기재된 방법은 하나의 심장 유전자 집합의 발현을 평가하기 위해 마이크로 유체 보조 된 단일 셀 캡쳐 시스템에서 사용하기 위해 제브라 배아 심장 선조 세포 집단을 풍부하게하는 세포 형 특이 적 프로모터의 제어하에 형광 단백질의 발현을 사용하여 세포. FACS 레이저 여기 및 발광 기능은 원하는 형광 물질 (들)과 호환되는지 다만,이 방법은 형광 리포터 라인에 대해 사용될 수있다. 많은 제브라 리포터 라인 이미 존재하며, 신규 한 기자 반송 형질 전환 어류는 적은 3 개월에서 생성 될 수있다. 또한 본 작업 플로우는 단일 세포 RNA 서열에 대한 전체 사체로부터 cDNA를 생산하는 데에 적합 할 수있다. 이를 위해 5-7 RNA 서열 분석에 적합한 라이브러리를 생성하는 cDNA를 제조하기위한 최적의 화학 반응에 사용하기 위해 약간 수정 될 필요가 단계. 그러나 인구의 이질성을 확인하는 것이 좋습니다높은 처리량 시퀀싱 애플리케이션을 추구해하기 전에 여기에 설명 된 방법을 이용하여.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 생선 재고에 대해 C. Geoffrey Burns 박사에게 감사드립니다. 저자들은 이 프로젝트를 가능하게 하는 자원을 제공해 준 UNC 유세포 분석 핵심 시설, UNC-CGIBD AAC 코어, 동물 관리를 위한 ZAC 시설에 감사를 표합니다. L.S.는 NIH T32 보조금 HL069768-13(PI, Nobuyo Maeda)의 지원을 받습니다. N.F.는 NSF 대학원 연구 펠로우십 NSF-DGE-1144081의 지원을 받습니다. 이 연구는 NIH P30DK034987 보조금(UNC Advanced Analytics Core), 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 13SDG17060010 및 Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13(Qian 박사에게) 및 NIH R00 HL109079 보조금(Liu 박사에게)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Supplies | |||
| Dumont #5 집게 | Fine Science Tools | 11254-20 | 배아에서 융모막 제거용 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40um 세포 여과기 | Biobasic | SP104151 | |
| 35mm 배양 접시 | Falcon | 351008 | |
| 35um 셀 스트레이너 | Falcon | 352235 | |
| P1000 및 | 팁 Rainin | 17005089 | |
| P20 및 팁 | Rainin | 17005091 | |
| IFC 칩 제조업체 프로토콜 | Fluidigm | 100-6117 | 버전 100-6117 E1이 대표적인 실험에 사용되었습니다 |
| . 배아 이식 | |||
| 성체 야생형 제브라피시 | N/A | AB 계열 | |
| 성체 형질전환 제브라피시 | N/A | Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | 물에 재고를 만들고 탈노른자 완충액에 사용 |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | 물에 재고를 만들고 탈노른자 완충액 |
| NaHCO3 | Sigma에 사용 Aldrich | S6014 | 물에 스톡을 만들고 탈노른 완충제에 사용 |
| Leibovitz의 L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | 열 비활성화; FBS의 모든 브랜드는 미세해야 합니다 |
| 세포 해리 시약 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | 실온에서 보관하십시오. |
| 세포 해리 시약 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; 얼음에서 해동; 사용 전에 실온에 두십시오 |
| pronase (선택 사항) | Sigma | P5147 | |
| L/D 염료 - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | 유세포 분석에 적합한 모든 살아있는/죽은 염색제가 작동합니다 |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| IFC 플레이트 사용 및 qRT-PCR용 시약 | |||
| 유전자 특이적 프로브 | 프로브는 실험에 따라 다릅니다 | ||
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| TaqMan 프로브 nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
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| TaqMan 프로브 vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan 프로브 isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | Life Technologies | 4369016 | |
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| C1 시약 키트 | : Fluidigm | 100-5319 | IFC 플레이트에 세포를 로딩하기 위한 시약 |
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| 분자 생물학 품질 | 물 코닝 | 46-000CM | |
| C1 IFC 프리 앰프 (5-10 um) | 이드 임 | 100-5757 | IFC 플레이트 스몰 셀 용 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep 기계 | Fluidigm | 100-5477 | IFC 플레이트용 |
| 혈구계를 사용하십시오 | Sigma Aldrich | Z359629 | 세포 계수 및 세포 크기 평가용 |
| 해부 현미경 | 융모막에서 배아 제거용 | ||
| 조직 배양 현미경 | 단일 세포 소화 평가용 | ||
| FACS 기계 | 관심 세포 분리용 |
참고문헌
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene express....
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재인쇄 및 허가
