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방법 논문

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

6.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53880

⸱

2016년 3월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

이 논문에서

요약

여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

초록

재생 의학은 퇴화되거나 손상된 조직을 복구하기 위해 환자에게 전달되는 완전히 기능하는 새로운 세포를 필요로 합니다. 이러한 세포를 쉽게 사용할 수 없는 경우, 많은 것 중에서 재프로그래밍(reprogramming) 및 트랜스-분화(trans-differentiation)를 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 얻을 수 있으며, 이는 서로 다른 기술에 특이적인 장점과 한계를 가지고 있습니다. 여기에서는 성숙한 성숙한 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하기 위한 새로운 전략이 설명되며, 이는 임의로 후성유전학적 전환세포(EpiCC)로 지정됩니다. 이 방법은 세포 운명의 후성유전학적 조절과 분화를 제어하는 메커니즘에 대한 이해가 높아짐에 따라 개발되었습니다. 특히, 첫 번째 단계는 후성유전학적 변형자, 즉 5-아자-시티딘을 사용하여 성체 세포를 "매우 허용적인" 상태로 만듭니다. 그런 다음 이 짧고 되돌릴 수 있는 후성유전학적 가소성의 창을 활용하여 세포를 다른 계통으로 다시 처리합니다. 이 접근법은 "후성유전학적 세포 전환"이라고 명명됩니다. 이는 효율적이고 제어되며 안정적인 세포 계간 스위치를 얻을 수 있는 간단하고 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 transfection의 사용을 포함하지 않기 때문에 바이러스 벡터가 없고 안정적인 만능 상태를 포함하지 않기 때문에 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

서론

재생 의료의 기본적인 목적은 수리되거나 손상된 대체 할 수있는 새로운 기능성 세포의 세대, 조직 변성. 다른 하나의 세포 유형에서 그들을 변환하여, 새로운에 쉽게 사용할 성인 세포 개조하기 필요한 세포 집단 액세스가 풍부하거나 어렵지 않다 특히, 특히 매력적인 방법이다. 그러나, 성인 세포는 매우 안정하다. 그들은 성숙한 터미널 전문화에 도달하면, 그들은 안정적는 1을 유지, 자신의 선택에 점진적으로 제한을 통해 차별화 된 상태를 취득합니다.

체세포 (IPS)의 다 능성을 재 프로그래밍을 가능하게하는 프로토콜 번호가 개발되었으며 최근 년에 전사 세트 2,3- 요인의 강제 발현을 통해 달성. 또한, 셀 변환 (4) 하나를 소개, 직접 혈통의 분화에 의해 얻을 수있다 또는 전사의 조합은 5-7 요인. 이 전략은 역 분화 상태를 통해 전환을 포함하지만, 특정 전사가 8 요인의 고 발현을 필요로하지 않습니다.

우리는 최근 시티 딘 유사체 5- 아자 시티 딘 (5 아자 - CR), 잘 특징 DNA의 메틸화 억제제의 탈 메틸화 특성 성체 세포의 짧은 노출에 기초하여 변환 프로토콜을 개발했다. 탈 메틸화 단계는 즉시 필요한 단말 표현형을 얻을 수있는 특정 분화 프로토콜 9-11 따른다. 이 방법은 다른 혈통의 세포로 성숙, 분화 세포로 변환 할 수 있으며, 바이러스 벡터의 사용 및 외인성 전사 인자의 형질을 모두 회피하는 상당한 이점을 갖는다. 안정적인 만능 상태의 취득 및 불안정성을 셀에 관련 증가 감수성도 피할 수있다.

여기에 제시되는 모든 기능 인슐린 분비 세포로 성인 인간의 피부 섬유 아세포의 전환을 할 수 있습니다 자세한 프로토콜입니다. 그러나, 본 기술은 상이한 유형의 세포에 적용된 다양한 분화 세포를 향해 경로를 다루는 경우, 긍정적 인 결과를 생성 한 것을 주목할 가치가있다. 또한, 후생 유전 학적 변환이 성공적으로 인간 및 돼지 9-13 종뿐만 아니라 개에서 사용 된 방법의 다양한 효능과 안정성을 제안 (원고 제출).

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프로토콜

주의 : 아래에 기재된 모든 절차를 무균 상태에서 층류 후드에서 수행되어야한다. 그들의 처리에 걸쳐 37 ° C에서 모든 문화 절차가 온도 조절 단계에서 수행하는 세포가 유지되어 있는지 확인합니다.

1. 피부 섬유 아세포의 분리

  1. 문화 접시 코팅액을 제조
    1. 물 (최종 농도 0.1 %) 100 ㎖에 돼지 젤라틴 0.1 g을 녹인다. 오토 클레이브와 솔루션을 소독.
    2. 35mm 배양 접시에 무균 0.1 % 돼지 젤라틴의 1.5 ML을 추가합니다. 실온에서 그들을 유지, 코트에 2 시간을 기다립니다.
      주 : 인간의 피부 생검 전완의 앞쪽 양태의 무 혈관 영역에서 국소 마취 절제하여 수거하고, 사용하기 전에 4 ℃에서 2 % 항생제 항진균제 용액이 보충 된 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 저장된다.
  2. 새로운 PBS로 세척 생검은 2 % antibi 보충귀 안티 곰팡이 솔루션입니다.
  3. 장소 a를 100mm 페트리 접시에 조직 검사와 멸균 메스와 약 2mm 3 조각으로 잘라.
  4. 단편 도금 직전에 도포 액의 과도한 제거.
  5. 사전 코팅 35mm 페트리 접시에 5-6 피부 조각을 놓습니다.
  6. 섬유 아세포 배양 배지를 준비 : 77 % 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 고 글루코스, 20 % 우 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민 용액 및 2 % 항생제 항진균제 용액.
  7. 5 % CO 2 37 ° C에서 각각의 조각 (조각 당 보통 100 μL), 문화 그들을 섬유 아세포 매체의 방울을 추가합니다.
  8. 24 시간 후, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 습윤을 유지하기 위해 조각 위에 섬유 아세포 배양 배지 500 μl를 추가한다.
  9. 적어도 한 번 피펫마다 48 시간과 매체를 변경합니다.
  10. 배양 6 일 후, 조심스럽게 조직 조각을 제거하고 폐기합니다.
    참고 : 6 일 후, 섬유 아세포S는 조직 절편에서 성장하고 세포 단층을 형성하기 시작한다.
  11. 매체 고침 섬유 아세포 배양액 2 ㎖를 추가 한 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 단층 배양을 계속한다.

2. 섬유 아세포 문화

  1. 37 ° C에서 배양 섬유 아세포 5 % CO 2에서 80 %의 합류까지
  2. 조직 배양 접시에서 계대, 흡인 섬유 아세포 배양 배지하십시오. PBS의 4 ㎖로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충.
  3. 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다.
  4. 트립신 작용을 중화 섬유 아세포 배지 9 부를 세포 현탁액을 희석. 원심 분리는 필요하지 않습니다.
  5. 새로운 배양 접시에서 플레이트 세포 (와젤라틴 아웃)과 문화 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서. 성장 속도에 따라, 4 : 2, 1 : 1 사이의 통로 비율을 유지한다.
  6. 세포 (주당 보통 회) 약 80 %의 합류 통로를 도달하면.

성적인 변환 3. 섬유 아세포 도금

  1. 세포 배양 접시에 0.26 ㎖ / 0.1 % 돼지 젤라틴 cm 2 (1.1에 설명 된대로 준비) 추가합니다. 코트에 2 시간을 기다립니다.
  2. 섬유 아 세포를 도금하기 전에 도포 액을 초과하는 10 ~ 30 분을 제거합니다.
  3. 배양 접시에서 섬유 아세포 배양 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충.
  4. 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다.
  5. fibrobl 9 부분으로 세포 현탁액을 희석AST 배지는 트립신 중화 작용.
  6. 실온에서 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. / ㎠ 7.8 × 104 섬유 아세포의 세포 농도를 얻기 위해, 세포를 재현 탁하는 섬유 아세포 배양액의 필요한 부피를 계산한다. 이것은 사용 챔버의 특정 유형에 의존 할 것이다.
    셀 / μL = 작은 그리드 X 90 (곱셈) × 희석 당 세포의 평균 수
  7. 실온에서 5 분 동안 150g로 원심 분리 세포 현탁액. 섬유 아세포 배지 이전에 계산 된 양으로 재현 탁하고 세포 상등액을 제거한다.
  8. 0.1 % 젤라틴 미리 코팅 요리와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 문화를 접시에 세포.

탈 메틸화 에이전트 5 아자 - CR을 사용하여 4. 증가 셀 소성

  1. 날 0
    1. DMEM 고 글루코스 메디칼 10ml에 5- 아자 CR 2.44 mg을 용해시켜 5- 아자 - CR 원액을 준비음. 여과 소독. 바로 사용하기 전에 5 아자 - CR 주식을 준비합니다.
    2. 섬유 아세포 배양 배지 (최종 농도 1 μM) 1 ㎖에 5 아자 CR 원액 1 μl를 희석.
    3. 세포의 가소성, 세포 도금 (소호 3.8) 후 24 시간을 늘리려면 시드 섬유 아 세포에서 배지를 제거하고 CO 2 배양기 5 %에서 37 ° C에서 18 시간 동안 1 μM 5 아자 - CR 원액과 문화를 추가 할 수 있습니다.
  2. 1 일
    1. 표 1에 기재된 바와 같이 신선한 인간 다 능성 (HP) 배지를 준비한다.
    2. 1 μM 5 아자 CR 함께 배양 한 결과, 5- 아자 - CR 멀리 세정되도록 PBS로 3 회 배지를 제거하고 세포를 세척한다.
    3. 부화 -5- 아자 - CR 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 시간 (회복 기간)에 대한 HP 매체 처리 아세포.
    4. 회복 기간 후, 중간 제거 PBS로 3 회 세척한다.
    5. 5- 아자 - CR 처리의 효율을 모니터링하기 위해,이 단계 f 체크인또는 형태 학적 변화의 존재는 (결과 섹션에 설명). 세포는 섬유 아세포의 전형적인 긴 형태를 잃고 확대 핵으로, 크기가 작아지고, 원형 또는 타원형 모양을 취득.
    6. 췌장 분화를 진행합니다.

5. 췌장 분화 프로토콜

  1. 일 1-6
    1. 표 2에 기술 된 바와 같이 췌장 기초 배지를 준비합니다.
    2. 원액을 티빈 준비 : 멸균의 166.6 μL에서 재조합 인간 단백질을 티빈의 5 μg의 용해.
    3. 배양 5 아자 CR 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6일 위해 (5.1.2 참조) 1 μL / ㎖ 액 티빈 원액 보충 0.26 ㎖ / cm 췌장 기초 배지 2에서 섬유 아세포를 처리 하였다. 매체 매일을 변경합니다.
  2. 일 7-8
    1. 레티노 ACI 50 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 16.6 ml에 첨가하여 레티노 산 원액을 준비디.
    2. 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포는 1 μL / ㎖ 37 ℃에서 원액 (5.1.2 참조) 2 일간 1 μL / ㎖ 레티노 산 원액을 (5.2.1 참조) 티빈 C 보충 5 %의 CO 2. 매체 매일을 변경합니다.
  3. 일 9-36
    1. 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포 (v / v)의 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS), 2 % (v / v)의 B27 0.1 % (v / v)의 재조합 인간 FGF 기본 1 %로 보충 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 (bFGF의) 원액 (표 1 참조). 처음 15 일 동안 매일 매체를 변경합니다.
    2. 이후 하루에 16에서, 배양 접시의 바닥에서 분리 할 수​​ 있습니다 집계 세포를 형성하기 때문에, 현미경, 매일 매체를 새로 고칩니다.

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결과

피부 생검에서 차 문화의 설립
피부 생검은 작은 조각으로 잘라 젤라틴 미리 코팅 요리에 넣었다. 육일 후, 섬유 아세포는 조직 조각에서 성장하기 시작하고 세포 단층 (그림 1A)을 형성했다. 세포는 전형적인 긴 형태를 보여, 예상대로 섬유 아세포 특정 마커 멘틴 (빔, 그림 1B)의 균일 한 면역 양성을 표시.

5 아자 - CR에 18 시간 노출 후 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 변화와 메틸화 패턴
인슐린 분비 세포로 섬유 아세포의 성공적인 후생 유전 학적 변환을 얻으려면, 우리는 탈 메틸 화제, 5 아자 - CR을 사용하여 가소성을 증가했다. 인간 섬유 아세포를 7.8 × 104 아세포 / ㎠의 농도로 0.1 % 젤라틴 프레 코트 접...

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토론

본 논문은 조직 특이 적, 유도 프로토콜이어서 5- 아자 CR에 과도 짧은 노광, 인슐린 생산 세포에 인간의 피부 섬유 아세포의 변환을 허용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 전사 인자 또는 마이크로 RNA의 강제 표현이나 세포가 더 불안정하고 실수 (14)하는 경향이 있습니다 안정적인 만능 상태의 취득없이, 중배엽에서 내배엽과 관련된 세포로 전환 할 수 있습니다.

첫 번째 단계에서, 세포 가소성 말단 분화 세포에 일시적, 가역적 허용 상태를 유도하는 합성 후생 유전 학적 개질제로 확실히 증가한다. 특히, 5- 아자 - CR은 피부 섬유 아세포의 전체 메틸화의 감소를 야기하기 위해 사용되었다. 5- 아자 CR 직접 메틸 전이 효소의 활성을 억제하고, 새로 합성 된 DNA 메틸화에 새로이를 방지하는 것으로 알려져있다. 때문에 그 효과,이 분자이전 자동 유전자를 활성화 할뿐만 아니라 15,16 진핵 세포의 분화 상태를 변경하는...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 Carraresi 재단과 당뇨병 연구를위한 유럽 재단 (EFSD)에 의해 투자되었다. GP는 밀라노 대학의 후 문서의 교제에 의해 지원됩니다. 후성 유전학과 Periconception 환경과 BM1308 공유 큰 동물 모델에서 진행 비용 조치 (살람) : 저자는 비용 작업 FA1201 Epiconcept의 구성원입니다. TALB은 비용 조치 CM1406 성적인 화학 생물학 (EPICHEM)의 회원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수SigmaD5652PBS; 세포 세척 및 용액 준비용
항생제 항진균 용액SigmaA5955섬유아세포, HP 및 췌장 매체의 구성 요소
100 mm 페트리 접시Sarstedt83.3902섬유아세포 분리용
돼지 젤라틴시그마G1890접시 코팅용
물: 시그마W3500용액 준비
용 35mm 페트리 접시Sarstedt83.39섬유 아세포 분리
DMEM, 고 포도당, 피루브 산생명 기술41966052섬유 아세포 배양 매체
태아 소 혈청생명 기술10500064FBS; 섬유 아세포 및 HP 매체
L-글루타민 용액요소 SigmaG7513섬유 아세포, HP 및 췌장 매체
트립신-EDTA 용액아세포 해리용
KOVA GLASSTIC SLIDE 10포함 Hycor Biomedical87144세포 계수
5-AzacytidineSigmaA23855-aza-CR, increrase 세포용 섬유아세포의 가소성
Ham's F-10 영양 혼합물Life Technologies31550031HP 매체
DMEM, 저포도당, 피루브산Life Technologies31885023HP 매체
녹아웃 혈청 교체Life Technologies10828028HP 매체
MEM 비필수 아미노산 솔루션의Life Technologies11140035HP 및 췌장 기저 매체의 구성
2-메르캅토에탄올시그마M7522HP 및 췌장 기초 매체의 구성
구아노신시그마G6264뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의 성분
아데노신시그마A4036뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의
티딘시그마C4654뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체
UridineSigmaU3003HP 매체
ThymidineSigmaT1895뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체
Millex-GS 0,22 µ의 뉴클레오시드 혼합 원료 성분; mMilliporeSLGS033SB용액
FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질생명 기술PHG0261bFGF의 살균을 위해; HP 및 췌장 기저 매체
소 혈청 알부민시그마A3311; 췌장 기저 매체의 구성
DMEM / F-12Life Technologies11320074췌장 기초 매체
B-27 보충제 마이너스 비타민 A라이프 테크놀로지12587010췌장 매체
N-2 보충제라이프 테크놀로지17502048췌장 기초 매체
액티빈 A 재조합 인간 단백질라이프 테크PHG9014췌장 매체
레티노산시그마R2625췌장 매체
디메틸 설폭사이드시그마D2650DMSO; 레티노산 재고 준비
인슐린-트랜스페린-셀레늄생명 기술41400045ITS; 췌장 최종 매체
항-바이멘틴 항체 Abcamab8069면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride시그마32670DAPI. 면역세포화학 분석용. 작업 희석  1 &마이크로; g/ml
5-메틸시티딘EurogentecMMS-900P-B면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:500
Anti-C 펩타이드 항체 Abcamab14181면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100
Anti-PDX1 항체 Abcamab47267면역세포화학 분석기용. 작동 희석 1:500
Mercodia 인슐린 ELISAMercodia10-1113-10인슐린 방출 감지용
의 구성 의 구성 요소 섬유 그리드 용 구성 요소 요소 요소 시 BSA의 구성 요소 요소 스 스 놀로지스의 구성 요소

참고문헌

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  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
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