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방법 논문

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

20.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53881

⸱

2016년 5월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Trudeau Institute, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, 3Departments of Medicine and Infectious Diseases and Pathology, University of Florida

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 들판을 가로 질러이 기술의 표준화를 장려하기 위해 사망률없이 재현 부상 결과 생쥐의 장 허혈 - 재관류의 상세 절차를 설명합니다. 창자 허혈 재관류 손상이 모델은 부상 및 재생의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

초록

장 허혈은 동맥 경화증, 혈전증, 저혈압, 괴사 성 장염, 장 이식, 외상 및 만성 염증을 포함하여 임상 조건의 넓은 범위와 관련된 생명을 위협하는 상태이다. 창자 허혈 재관류 (IR) 부상 장내 손상 얻어진 장간막 혈관 통해 불충분 한 혈류로 인한 급성 장간막 허혈 결과적이다. 재관류 다음 허혈은 또한 소장의 손상을 악화시킬 수 있습니다. IR 손상 메커니즘은 복잡하고 잘못 이해된다. 따라서, 작은 동물 실험 모델 IR 손상의 병태 생리학 및 신규 한 치료제의 개발을 이해하는데 중요하다.

여기에서 우리는 사망하지 않고 소장의 재현성 부상을 제공 급성 장 IR 부상의 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이것은 시간적으로 occludin은 원위 회장의 영역 허혈 유도함으로써 달성된다g 미세 혈관 클립을 사용하여 60 분 동안 상 장간막 동맥 및 주변 단자 담보 가지. 1 시간, 또는 조직 학적 분석에 의해 조사 된 소장의 재현 상해에서 상해 결과 후 2 시간 동안 재관류. 미세 혈관 클립의 적절한 위치는 프로 시저에 대한 중요하다. 따라서, 동화상이 기술의 상세한 시각 단계별 설명을 제공한다. 장내 IR 손상이 모델은 부상 및 재생의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

서론

소장은 허혈 및 상피 손상의 원인 혈액 흐름의 중단에 매우 민감하다. 허혈 후 재관류는 조직의 재 산소를 제공하고, 더 병리학을 홍보 할 수 있습니다. 따라서, 장 허혈 재관류 손상은 괴사 성 장염, 소장 이식의 이식 거부, 복부 대 동맥류 수술, 심폐 바이 패스, 및 염증성 장 질환의 1,2- 합병증 포함 병리의 넓은 범위와 관련된다. 장 IR 부상, 특히 급성 장간막 허혈는 이환율과 사망률 3의 결과로 생명을 위협하는 상태이다.

잘 이해되지 않지만, 장 허혈 재관류 (IR) 상처는 장내 미생물의 변화뿐만 아니라, 반응성 산소 종 및 염증성 사이토 카인 및 케모카인 1,4-6의 생산과 관련된 것으로 생각된다. 이 둘의 활성화에 리드네이트 및 염증과 조직 손상 -1,7,8,8-을 촉진 적응 면역 메커니즘.

그들은 쉽게 이득 - 및 기능 상실 유전자 실험을 허용하는 동물 모델은 IR 손상의 메카니즘을 이해하는 데 중요하다. IR의 여러 동물 모델은 전체 혈관 폐색, 저 유량 허혈을 포함하는 개발 및 (최근의 종합적인 검토 9에 요약) 혈관 폐색을 분할하고있다. 장간막 동맥 (SMA)의 완전한 혈관 폐색에 의한 장 허혈 큰 동물과 설치류 9-11에서 IR의 쉽고 일반적으로 사용되는 모델입니다. 그러나, 창자의 다른 영역은 부상에 서로 다른 감수성이있다. 또한, 부상의 변수도에서 허혈 손상 및 복구 결과의 기간에 다양한 마취제, 진통제, 동맥 폐쇄 기술의 범위뿐만 아니라 불일치 여러 STUDIE에서 IR의 생물학에 대한 우리의 이해를 교란의. 표 1은 쥐의 IR 연구에서 이러한 불일치를 보여줍니다. 짧은 허혈 시간 (30-45 분)을 사용하는 가장 큰 단점은 케이스 및 컨트롤 간의 뚜렷한 차이가 관찰 될 수있는 복구 창을 대상으로한다. 상피에 가벼운 부상 따라서, 재관류 후 시간을 해결 병리학 적 지표가 상피 손해 배상의 차이를 발견해야 할 수 있습니다 전문 될 수있다. 반대로, 과도한 손상, 허혈성 손상을 100 분으로 본 사망률의 속도 및 복구 시간을 증가 반발이 더 이상 가능하지 않다 상피의 완전한 denudement 초래할 수있다. 따라서, 우리가 우리의 분야에서이 기술의 표준화를 장려하기 위해 사망률없이 재현 부상 결과 생쥐의 장내 IR의 상세 절차를 설명합니다. 장내 IR 손상이 모델은 부상 및 재생의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

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프로토콜

동물 연구는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행하고, 기관 동물 관리의 승인을하고, 트뤼도 학회의위원회를 사용합니다. 8~12주 오래 C57BL / 6 마​​우스를이 연구에 사용 하였다.

수술 1. 준비

  1. 준비 및 수술 도구를 소독.
  2. 코 콘, 가열 패드 이소 플루 란 기반 마취 시스템을 준비합니다. 확인 가열 패드가 과열되지 않는다 (<39 ° C).
  3. 이소 플루 란 가스 소기 용기가 차단되거나 어떤 식 으로든 폐색되지 않은 용기의 하단에 배기구를 보장하기 위해 올바르게 배치되어 있는지 확인합니다. 캐니스터 절차 및 문서의 무게에 앞서 가스 소기 용기의 무게를. 캐니스터 중량 누적 중량 (~ 12 시간) 50 g을 초과하면 캐니스터 버린다.

2. 마취

  1. 유도 챔버에 3 % 이소 플루 란 마취 마우스 (1 L / 분O 2).
    1. 똑바로 유지하기 위해 무능력에 의해 마취 깊이를 평가, 목적이 자발적인 움직임, 깜박임 반사 손실, 근육 이완 및 응답의 손실의 손실 (회사의 압력과 발가락 또는 꼬리 핀치) 자극을 리플렉스합니다.
    2. 가슴 벽과 복부의 움직임을 관찰하여 호흡 패턴을 평가합니다. 최적의 마취에서 호흡 속도는 분당 ~ 55-65 호흡해야한다.
    3. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 빠르게 마우스의 복부 영역을 면도.
  2. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈에 개성 안과 연고를 배치합니다.
  3. 가열 패드에 마우스를 놓고 마취 시스템에 코 콘을 통해 연결합니다. 확인 라텍스 코 콘 막 단단히 마우스의 머리에 맞는 이소 플루 란의 아무 누수가 없다.
  4. 피하 고통 폭포의 바람을 방지하기 위해 1.5 %로 이소 플루 란 속도를 줄이고, 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏)과 케타민 (10 ㎎ / ㎏)을 주입.
  5. 일을 닦아70 % 에탄올 다음 Betadine 수술 용액으로 적신 멸균 면봉으로 작업 영역의 전자 피부.

3. 수술

  1. 운영 가위로 중간 선 3-5cm의 개복술을 확인합니다. 식염수에 적신 멸균 비 접착 패드 커버 작업 영역입니다. 맹장과​​ 회장을 분리하고 식염수에 적신 면봉을 사용하여 장간막 동맥을 노출.
  2. , 적용 클립을 용이하게이 작업을 수행 scissors.To 미세 조리개를 사용하여 장간막 동맥 주위의 장간막에 작은 흠을하려면 부드럽게 드레싱 집게로 장을 마련하고 (원하는 클립 위치에 그림을 장간막 동맥의 양쪽에 장간막을 잘라 1A). 그런 다음 클립을 적용하기 전에 원하는 클립 위치의 영역에 멸균 생리 식염수를 몇 방울을 추가합니다.
    참고 : 가짜 수술을 3.2 단계로 수술을 따르십시오. 클립을 적용하지 마십시오. 대신, 추가 따뜻한들에 의해 습기가 조직을 유지알린 같이 1 시간 동안 3.6에 기재. 그 후, 4.1 단계로 진행,
  3. 맹장 (도 1B)에 인접하는 허혈성 회장의 5-7 센티미터 영역을 생성하기 위해 클립 부착기를 이용하여 미세 혈관 클립 (70g 력)과 장간막 동맥 1 차 분기 폐색. 선박의 위치가 보수적이지만, 마우스 사이에 약간의 차이 (그림 1의 예 참조)가있을 수 있습니다. 따라서, 2 또는 3 클립은 일반적으로 (도 1A, D, E, 검은 색 화살표에있는 클립의 위치 참조)를 요구한다.
    참고 : 높은 품질의 선박 클립을 사용합니다. 고압 클립 혈관 손상을 완전히 혈액 흐름을 차단할 수 저압 클립 (<30g) 반면 재생을 방지 할 수있다.
  4. 허혈성 부위의 영역 (도 1) demarking 선박간에 개의 미세 혈관 클립을 사용하여 창자 (40g 포스)을 통해 측부 혈류 차단. 측부 혈관의 폐색에 필요인접한 혈관으로부터 혈액 공급이되지 않도록 (도 1a, D, E, 녹색 화살표의 클립의 위치 참조).
  5. 옵션 : 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린 용액 (6 USP 단위 / ㎖)을 추가합니다. 단리 된 부위에 헤파린 용액 0.5ml를 추가 적가 하였다.
  6. 식염수 젖은 멸균 비 접착 패드 섬세한 와이프는 37 ° C로 미리 예열 및 수술 영역에 적용됩니다. 와이프는 전체 절차를 수행하는 동안 젖은 남아 있는지 확인합니다.
  7. 전체에서 1.5 % 이소 플루 란 마취를 사용하여 60 분 동안 허혈을 유지한다. 허혈 절차가 제대로 수행되면, 허혈성 지역은 약 30 분에서 색상 와인 레드로 변경됩니다. 성공적인 폐쇄를 나타내는 허혈 (그림 1, 오른쪽 패널) 동안 확대 된 클립의 위치로 말초 혈액 혈관을합니다.
  8. 밀접하게 허혈 단계에서 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 수술 부위를 덮는 비 접착 패드에 식염수를 계속 적용.
  9. 표조직에 Gill`s 3 헤 마톡 실린 20 μl를 피펫 팅에 의한 허혈 영역의 가장자리 (그림 1E, 오른쪽 패널) 비교를 위해 동일한 마우스에서 허혈성 조직과 인접한 건강한 조직을 수확 용이합니다.

4. 재관류 단계

  1. 허혈 끝에 클립 영역에 식염수를 몇 방울을 가하여 부드럽게 클립 적용자와 미세 혈관 클립을 제거한다. 그런 다음, 부드럽게 식염수를 적신 코튼 팁을 사용하여 다시 복강에 소장을 밀어 넣습니다. 비 접착 패드를 분리 9mm 스테인레스 스틸 상처 클립을 사용하여 복벽 및 피부를 닫는다. 재관류 3 시간보다 오래 수행되면, 피부 창상 클립을 적용하기 전에 복벽을 닫 vicryl 흡수성 봉합사를 사용한다.
  2. 재관류 단계에 대한 시간의 원하는 금액 (30 분, 60 분, 120 분, 180 분)에 대한 가열 깨끗한 케이지에 마우스를 유지한다.
  3. 매 30 분 안정성을 보장하기 위해 적어도 동물을 확인합니다.
5. 부검 및 소장의 수확

  1. CO에 의해 재관류 다음 원하는 시간에 자궁 경부 전위 다음이 과다 복용을 쥐를 안락사.
  2. 복강을 열고 추가 분석을 위해 허혈성 장 조직을 수집합니다. 부상에 대한 전신 반응 계정에 대한 내부 통제로 손상된 조직에 인접 수확 건강한 정상 조직.
    참고 :이 컨트롤은 가짜 운영 마우스 IR-유도 부상에 대한 전신 반응을받지 않기 때문에 가짜 제어 마우스를 운영하는 것보다 더 적합하다.
  3. 길이 방향으로 다음 생리 식염수로 채워진 및 장착 된 위관 바늘로 장을 30 ML의 주사기를 잘라 사용하여 장 내용을 세척 할 것. 소장의 샘플의 유전자 발현 분석을 위해 필요한 경우, 종 방향으로 1.5 mm 절편을 절단하고, 조직 학적 분석을 위해 나머지 부분을 사용한다.
  4. 조직 학적 분석을 위해, intest 롤 쌍의 집게를 이용하여 스위스 롤을 제조오프라인.
  5. , 롤 형태를 유지 조직 카세트에서 조직 검사 폼 패드 (그림 2) 사이에 대장의 조각을 배치합니다. 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다.
  6. 최소 24 시간 동안 포르말린에 조직을 수정합니다. 추가로 24 시간 동안 70 %의 에탄올과 포르말린을 교체합니다. 실온에서 무기한 70 % 에탄올에 보관 조직.
  7. 파라핀에 포함, 5 μm의 섹션을 절단하고 헤 마톡 실린 및 에오신 표준 프로토콜 (그림 3)를 사용하여와 얼룩.

6. 점수

  1. 표 2에 요약되어있다. 쥐의 허혈 - 재관류 손상 점수 적절한 채점 방법을 선택합니다.
  2. 선택 사항 : 부상의 심각성이 섹션에 걸쳐 변화 때문에 네 개의 섹션으로 시야를 나눈다.
  3. 맹목적으로 얻은 점수에서 각 섹션의 평균 등급을 계산합니다.
  4. 케이스 및 컨트롤 사이의 손상된 조직의 성적을 비교뿐만 아니라 토륨하기전자는 던의 다중 비교 테스트에 이어 크루스 칼 - 월리스 테스트를 사용하여 조직을 손상되지 않은.

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결과

우리는 쥐의 회장의 재현 IR 유도 부상을 얻기 위해 IR 수술의 실험 프로토콜을 최적화. 대표 결과이 절에서 설명한다.

도 1은 회장의 허혈을 유도하는 미세 혈관 클립 위치의 예를 도시한다. 검은 색 화살표는 장간막 동맥의 첫 번째 순서 가지를 폐색 메인 클립의 위치를​​ 보여줍니다. 녹색 화살표 담보 혈관으로부터 혈액 공급을 차단하기 위해 추가 클립의 위치를​​ 나타낸다. 클립의 위치와 intestinte의 허혈 영역의 색상 변화에 원위부 폐색 된 혈관의 증가 크기를합니다. 허혈 혈관의 단부에서 클립을 제거한 후 혈류를 회복 정상 크기로 복귀.

도 2는 콘로부터 제조 스위스 롤을 포함하는...

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토론

장내 IR 부상의 마우스 모델의 개발이 크게 조직 손상의 메카니즘에 대한 이해를 향상 7,9,11,34 조직 손상을 최소화하기 위해 잠재적 인 치료 전략의 개발에 도움을했다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 미세 혈관 클립의 적절한 위치, IR 부상의 허혈 및 적절한 조직 학적 평가의 정확한 타이밍이다.

허혈 시간은 후속 상피 손상에 대해 매우 중요하다. 이환율과 실험 쥐의 사망률없이 재현 IR 부상을 유도하는 데 필요한 일반적인 시간은 2 ~ 3 시간 재관류 다음 45 ~ 60 분이다. 허혈의 장기간 수도 상피 및 사망률 증가의 완전한 손실이 발생합니다. 120 분 동안 폐쇄는 융모 상피 (35)의 전체 손실을 주도하는 반면 예를 들어, jejunal 허혈의 돼지 모델에서, 60 분 폐색은 빌라 상피의 일부 손실이 발생했습니다. 나는mportantly, 무균 및 유전자 조작 마우스는 예비 실험에서 최적화 될 필요가있다 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

러시아어 과학 재단의 지원이 작품은, 아니 부여합니다. 14-50-00060 및 LLC RUSCHEMBIO. 이 작품은 또한 (CJ에) 294083 (AVT에), 그리고 NIH 부여 RO1 DK47700에 의해 부여 미국의 크론과 대장염 재단에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가열 패드SunbeamE12107-819대안: Braintree Scientific 가열 패드
탁상용 연구 마취 기계VascoUCAP 0001-0000171대안: Parkland Scientific, V3000PS
노즈 콘Parkland ScientificARES500
청소부 캐니스터 및 교체 카트리지Parkland Scientific80000, 80120
인덕션 챔버서지벳V711802
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-013-10규제 물질, IACUC
Animal clipper 에오스터 Oster Golden A5 078005-050-003
안과 연고Webster8804604
BuprenorphineMcKesson562766규제 물질, IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)PfizerNADA 45-290규제 물질, IACUC
Cotton tipsPuritan medical products806-WCAutoclave 사용 전에
BetadinePurdue 제품67618-150-1710% Povidone-Iodine
멸균 식염수Aspen46066-807-60사용 전에 실온에 조정
IR 설치류 온도계BIOSEBBIO-IRB153
마이크로 혈관 클립, 70 gRoboz Surgical RS5424, RS5435대안: WPI 14121, SMA 폐색
마이크로 혈관 클립, 40 gRoboz Surgical RS6472대안: WPI 14120, 담보 혈관 폐색
클립 적용 펜치World Precision Instruments14189대안: Roboz #RS-5410 또는  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylinThermo Scientific14-390-17
수술용 스테이플, Reflex 9 mmCell Point Scientific201-1000
Autoclip applierBeckton Dickinson427630
Byopsy 폼 패드SimportM476-1
조직 카세트Fisher Healthcare15182701AHistosette II 조합 뚜껑 및 베이스
10% 완충 포르말린Fisher Scientific245-684
수술용 홍채 가위World Precision Instruments501263-G SC대안: Roboz RS6816
운영 가위World Precision Instruments501219-G대안: Roboz RS6814
드레싱 펜치Roboz Surgical RS-5228, RS-8122대안: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP 단위/바이알, 50 mgSigma2106
Reflex 상처 클립 제거 펜치Roboz Surgical RS-9263대안: 세계 정밀 기기: 500347
마우스 C57BL/6J 마우스 Jackson Laboratory재고 번호 0664
Telfa 비접착성 드레싱, 3 x 4, 멸균Coviden1050
Fisherbrand 이송 피펫Fischer Scientific13-711-5AM피펫을 사용하여 식염수를 적가합니다
연락;.

참고문헌

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