비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
본 연구는 특정 돌연변이 배경에 기초하여 약물 반응을 예측 최적화 실리 모델에서와 체외 3D 폐 종양 모델을 조합. 모델은 기저막을 포함한 세포 외 매트릭스 성분과 구조에 관한 조직 - 특이 적 특징을 재현 decellularized 돼지 지지체 상에 생성된다. 우리는 약물 치료 사흘 포함한 14 일 이내에 인공 종양 조직의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 표준화. 우리의 기사는 3D의 몇 가지 자세한 설명은 판독 검사 기술의 효과를 평가하기위한 유용한 도구입니다 중간 엽 전이에 M30-ELISA에 의해 상층 액에서 확산 지수 사료된다 염색의, 세포 사멸의 결정 및 상피의 평가 (EMT)처럼 제공 치료 화합물. 우리는 2D 문화에 relat 우리의 3D 종양 모델에서 증식의 감소를 비교 보여줄 수임상 상황에 에드. 이 낮은 확산에도 불구하고, 모델 HCC827 폐 암종 세포주의 비교에 의해 도시 된 바와 같이 정확하게 바이오 마커의 상태에 따른 EGFR -targeted 약물 반응을 예측 (EGFR은 -mutated, KRAS 야생형)와 A549 (EGFR 야생형, KRAS - 티로신 키나제 억제제 (TKI) 피티 니브로 처리) 돌연변이. 멘틴 / 팬 사이토 케라틴 면역 형광 염색에 의해 평가 같은 고급 종양 세포의 약물 반응을 조사하기 위해, 우리는 TGF 베타 1 장기 치료에 의해 유도 EMT. 유동식 생물 반응기는 조직 생성을 향상 생리적 조건으로 배양을 조정하기 위해 사용되었다. 세포 사멸, 증식 지수 EMT - - 부울로 실리 모델 더욱이, 우리는 피티 니브 처리 또는 TGF 베타 1 자극시 약물 반응의 통합을 도시한다. 또한, 우리는 특정 돌연변이 배경 및 카운트를 갖는 종양 세포의 약물 반응 방법을 설명저항에 대한 erstrategies는 예측 될 수있다. 우리는 특히에 실리 확장과 체외 접근 방식에서 우리의 3D는 2 차원 세포 배양에서보다 더 현실적인 조건에서 임상 약물 테스트에 대한 부가 가치를 제공한다는 확신합니다.
서론
제약 산업은 막대한 비용 1-5 일으키는 임상 단계에서 암 치료의 분야에서 95 %까지의 높은 마모 속도를 향하게된다. 이 결핍 한 가지 이유는 현재 잠재적 인 새로운 화합물의 효능은 암 세포주의 2D 세포 배양 또는 동물 모델에서의 대규모 스크리닝에서 평가 된 사실이다. 동물 모델은 더 복잡하지만,이 마우스 및 인간 -6,7- 간의 중요한 차이가있다. 지난 10 년간, 다른 접근법을 사용하여 3 차원 암 모델 차원 암 세포주의 배양 및 생체 내의 종양 6,8,9 복잡한 간의 격차를 생성 하였다. 세포 분화에 또한 시그널링 3D 환경의 영향 년전 여러 연구에 도시되어있다 (예., 미나 BISSELL 의해) 10,11. 오늘날, 많은 3D 세포 배양 모델은 회전 타원체 문화, 하이드로 겔 또는 미세 유체 칩 12-16로 사용할 수 있습니다. 심지어 살전하지만전자 모델들은 주로 또한 종양지지 효과 및 영향 약효가 공지 된 미세 조직이없는 종래의 2 차원 배양 시스템에 비해 복잡도를 향상시킨다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 decellularized 돼지의 소장에서 유래 SISmuc (소 소장 - 점막하 + 점막)라고하는 생물학적 골격에 기초하여 3D 종양 모델을 생성. 따라서, 조직 구조와 같은 다른 콜라겐과 기저막의 구조와 ECM의 중요한 구성 요소 (17)를 유지한다. 이러한 독특한 특징은 상피에서 발생하고 고형 종양의 약 80 %를 포함하는 암의 종양 모델 생성을 위해 중요하다. 또한, 우리의 조직 공학 종양 모델의 확산 속도는 2D 문화에 달성 인위적으로 높은 가격에 비해 감소된다. 확산은 약물 효능을 평가하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 약물 검사는 더 비슷한 우리의 모델에서 사용 가능생체에 대한 조건은 17 종양이.
정확하게 자신의 EGFR -biomarker 상태 상이한 두 가지 폐암 세포주를 들어, 여기에서 본 데이터 바이오 마커 약물 의존적 효능을 예측하는 우리의 모델의 가능성을 평가하기 위해. 이 돌연변이 상태는 비소 세포 폐암 환자에서 일상적으로 결정하기 시작했다. 백금 기반 화학 요법 18-21 가진 사람에 비해 활성화 EGFR 돌연변이 쇼 우수한 결과를 베어링 종양에 대한 EGFR -inhibitor 피티 니브로 TKIs와 표적 치료.
우리는 화합물의 효능을 평가하기위한 관련이있는 여러 판독 기술을 설립했다. 또한, TGF 베타 1 자극 이후 우리는 악성 변형 22,23 중요한 단계로 생각되고 약물 resistan 접속되어되는 EMT 프로세스를 시작 암세포 복합 작업을 조사 할 수있다가전 24.
3 차원 종양 모델을 대상으로 치료, 화학 요법, 또는 좋은 대조와 약물의 조합에 세포 특이 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 더욱 강화하고 약물 검사의 속도와 저항을 발생하기 위해이가 실리 시뮬레이션에 의해 보완됩니다. 몇몇 실험에 기초하여, 종양 반응 약물 그들의 조합의 전체 범위에 대한 결과에 대하여 인 실리코 예측 될 수있다.
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프로토콜
1. 2 차원 세포 배양
- 상업적으로 종양 세포 라인 HCC827 (DSMZ)을 얻었다. 문화 RPMI-1640 폐 선암 세포주 HCC827 (돌연변이 EGFR, KRAS 야생형)을 20 % FCS로 보충. 삼일 - 매 2 중간 변경합니다. 일주일에 두 번 세포를 분할합니다. 통로 (20)에 도달 할 때까지 세포를 사용한다.
- 상업적 종양 세포주 A549 (DSMZ)을 얻었다. 문화 폐 암종 세포주 A549 (EGFR 야생형은 KRAS 변이) RPMI-1640에 10 % FCS로 보충. 전술 한 바와 같이 문화를 수행합니다. 통로 (20)에 도달 할 때까지 세포를 사용한다.
- (- 육주 모든 4) 마이코 플라즈마 오염 등 오염에 대한 정기적 세포를 테스트합니다.
- 커버 글라스에 A549 또는 HCC827 세포를 배양
- 트위터를 사용하여 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 멸균 유리 커버 슬립을 놓습니다.
- 웰을 500 ㎕의 부피로 두 세포주 시드 50,000 암세포유리 커버 슬립 각각.
- 배양 세포는 표준 배양 조건에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 (37 ℃, 5 % CO 2). 이 기간 동안, 파스퇴르 피펫을 사용하여 기존의 매체를 대기음 모든 2 500 μL에게 신선한 매체를 추가 - 문화 3 일.
생물학적 콜라겐 비계에 종양 테스트 시스템의 2 세대
- 정적 문화 조건
- decellularized 작은 창자 - 점막하 + 점막 (SISmuc)를 생성하고 이전 출판 (25)에 기술 된 바와 같이, 두 개의 금속 반지, 소위 셀 크라운 사이에 고정합니다.
- 세포 크라운에 고정 장내의 전 루멘의 측면 상에 500 μL의 총 부피에 HCC827 또는 A549 세포 중 하나의 씨앗 100,000 세포.
- 종양 세포는 37 ° C, 5 % CO 2에서 2 시간 동안 부착 할 수있다. 셀 왕관 내부에 1 ml의 매체를 추가하고 외부 1ml를.
- 종양 문화37 ° C에서 정적 조건에서 모델 14 일 동안 인큐베이터에서 5 % CO 2. 삼일 - 매 2 배지를 변경합니다. (10 %, HCC827 20 % A549) 셀 크라운 내외 동일한 배지 150 ml를 따라서, 파스퇴르 피펫 및 피펫 FCS 적정량 1 mL의 신선한 RPMI를 사용하여 매체를 흡인.
- 동적 문화 조건
- 2.1.3에 항 2.1.1에 설명 된대로 셀 크라운 세포 파종 내부 decellularized 행렬 종양 테스트 시스템을 설정합니다.
- 정적 배양 조건 하에서 종양 모델을 37 ℃ 3 일 동안 인큐베이터에서 5 % CO 2.
- 멸균 생물 반응기를 조립하고 이전에 (25)이 공표 한 시드 SISmuc를 삽입합니다.
- 피펫 FCS 적당량 45 ml의 RPMI (A549 : 10 % HCC827 : 20 %)를 플라스크에 넣고 바이오 리액터와 사이의 배관 시스템에 무침 샘플링 장치를 연결할매체 플라스크.
- , 인큐베이터에있는 생물 반응기를 놓고 37 ° C, 5 % CO 2에서 일정한 매체 흐름 (3 ml / 분)와 펌프와 문화에 추가로 14 일 동안 종양 모델을 연결합니다.
- 7 일 후 전체 문화 매체를 변경합니다. 이를 위해 층류 후드 아래의 배양기에서 생물 반응기를 이동. 파스퇴르 피펫을 사용하여 미디어 플라스크에서 매체를 기음. 튜브 시스템에서 매체를 제거하는 흡입하면서 생물 반응기를 들어 올립니다. 플라스크에 피펫 45 ml의 신선한 매체. 다시 인큐베이터로 생물 반응기를 놓고 펌프에 연결합니다.
피티 니브와 정적 종양 모델 3. 치료
- 문화 2.1 절에 설명 된대로 종양 모델입니다.
- 문화의 날 11시, 1 μM의 피티 니브 (각 셀 왕관 2.5 ml)로 RPMI / FCS를 준비합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물에서 이전 미디어를 기음과 t 내부 준비 RPMI / FCS가 / 피티 니브 1 ㎖를 추가그는 세포 왕관과 외부 동일한 매체의 1.5 ml의.
주 : 해동 피티 니브 스톡 용액을 일주일 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. - 항 3.2에 설명 된대로 하루에 13에서 매체를 변경합니다.
EMT 유도에 대한 TGF-베타 1과 정적 종양 모델 4. 자극
- 문화 2.1 절에 설명 된대로 종양 모델입니다.
- 문화의 3 일에서 2 NG / ㎖ TGF 베타-1 캐리어 (각 셀 왕관 2.5 ml)로 RPMI / FCS를 준비합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물에서 기존의 미디어를 대기음 1 준비 RPMI / FCS / TGF 베타-1 세포 왕관 내부 ㎖의 외부 동일한 매체의 1.5 ml를 추가 할 수 있습니다. 4.2에 설명 된대로, 14 일까지 3 일 - 매체 TGF-베타 1 매 2 보충 변경합니다.
5. 읽기 아웃
- ELISA의 측정을위한 샘플을 채취
- 정적 (2.1) 및 동적 (2.2 절) 문화의 상층 액 중에서 샘플을 채취일 문화의 11-14 그림 2에 표시된대로에서 게 피티 니브 (섹션 3)으로 처리. 또한, 처리 (T0) 이전에 샘플을.
- 정적 인 배양 조건 하에서, 세포의 관 내부에서 100 μL 샘플을 취할. 동적 배양 조건에서 샘플링 장치 주사기 스크류 및 바이오 리액터에서 1 ml의 배지를 취할. 엘리사가 수행 될 때까지 -80 ° C에서 수집 된 모든 상층 액을 저장합니다.
- 세포 사멸의 정량화를위한 M30-ELISA
- 상등액은 제조업체의 지시에 따라 세포 사멸 분석을 수행에서 아폽토시스를 정량. 모든 시약은 분석을 수행하기 전에 RT에 도달 할 수 있습니다.
- 소용돌이 모든 시약. 500 ml의 신선한 탈 이온수 세척 태블릿을 녹인다. 복합체 희석 버퍼의 9.2 ml의 HRP 접합체를 희석 혼합한다. 피펫 표준 또는 샘플 당 잘 25 μL.
- 희석 된 HRP Conju의 75 μl를 추가물론 당 게이트 솔루션입니다. 접시를 덮고 실온에서 4 시간 동안 진탕에 품어. 접시를 씻으 수동으로 준비 세척 용액 250 ㎕를 5 번.
- 각 웰에, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판 3,3 '200 μl를 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 어둠 속에서 인큐베이션. 각 웰에 스톱 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 10 초 동안 마이크로 플레이트를 흔들어 흡광도를 읽기 전에 5 분 동안 마이크로 둡니다. 마이크로 플레이트 리더에서 450 nm에서 흡광도를 결정합니다. 표준 곡선 및 원점 ELISA 타입의 데이터를 처리하기위한 적절한 프로그램을 이용하여 샘플의 농도를 계산한다.
- 샘플 염색
- 고정, 파라핀-포함하고 3D 모델 제의 제조
- 2 시간 동안 세포 크라운 당 2.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 시드 SISmuc을 수정하고 파라핀에 그것을 포함
- 이전에 발표 된 염색을 위해 3 μm의 조직 섹션을 준비25.
- 2D 문화 조건에서 자란 세포의 고정
- 70 %의 합류에 도달하면, PBS로 한번 24 웰 플레이트에 커버 글라스에 배양 된 세포를 씻어 500 μL 4 % PFA / 웰 10 분으로 그들을 해결.
- PFA를 제거하고 오염이 수행 될 때까지 4 ° C에서 PBS로 덮여 잘 판의 커버 글라스를 저장합니다.
- H & E 염색
- 표준 프로토콜에 따라 개요 염색으로 헤 마톡 실린 / 에오신으로 재수 섹션을 얼룩.
- 3 차원 모델의 면역 염색
- 면역 염색의 경우, 20 분 동안 예열 된 구연산 완충액 (pH 6.0)와 증기 밥솥에 탈 파라핀과 재수 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다.
참고 : 구연산 완충액의 제조 재료 및 장비의의 표를 참조하십시오. - 슬라이드로 이동세척 버퍼 (0.5 M PBS 버퍼 + 0.5 % 트윈)로하는 PAP 펜으로 동그라미 부분은 염색 솔루션에 필요한 볼륨을 최소화하고 수분 챔버에서 슬라이드를 배치합니다.
- RT에서 20 분 동안 항 5.3.4.6에 사용 된 이차 항체를 숙주 종에서 5 % 혈청으로 조직 절편을 차단.
- (100), 토끼 항 vimentin에 1 : 100, 마우스 항 범 사이토 케라틴 1 제조업체의 지시 (사료된다 1 항 토끼에 따른 희석에 둘러싸여 섹션에 차 항체를 부드럽게 용지 조직에 슬라이드를 눌러 차단 혈청을 제거하고 적용 : 100). 4 ° C에서 O / N을 품어. 이중 염색의 경우, 다른 호스트 종에서 일차 항체를 사용해야합니다.
- 5 분 동안 조심스럽게 세척 완충액으로 3 회 결합되지 않은 항체를 씻어.
- 섹션 400을 1 시간 동안 실온에서 품어 : 특정 항원 - 항체 바인딩의 검출을 위해, 희석 1 차 항체를 적용합니다.
- UNB 씻어세척 버퍼 운드, 항체 5 분 3 회.
- 핵을 Counterstain과 건조 O / N을 수 있도록 DAPI를 포함하는 수성 매체와 슬라이드를 탑재합니다.
- 면역 염색의 경우, 20 분 동안 예열 된 구연산 완충액 (pH 6.0)와 증기 밥솥에 탈 파라핀과 재수 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다.
- 2D 배양 세포의 면역 염색
- PBS를 제거하고 permeabilization 5 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 - X100과 시드 유리 커버 슬립 커버. 5 분 동안 세척 완충액 (0.5 M PBS 버퍼 + 0.5 % 트윈)와 유리 커버 슬립을 씻으십시오.
- 5.3.4.7에 단계 5.3.4.3를 수행합니다. 락 플랫폼에서 잘 플레이트의 모든 단계를 실행하고 판을 반전 시약을 제거합니다.
- 장착하기 위해, 코팅되지 않은 유리 슬라이드 상에 핵을 Counterstain과 겸자를 사용하여 장착 매체 대향 세포와 그것을 커버 슬립을 전송 DAPI를 포함하는 수성 매질의 드롭 자리. 이미징 전에 건조하자.
- 고정, 파라핀-포함하고 3D 모델 제의 제조
- 대량 살상 무기 확산 지수의 결정
- 면역를 수행섹션 5.3.4에 따라 사료된다 대하여 염색. 또는 5.3 5.
- 거꾸로 현미경으로 조직 섹션 또는 2D 배양 세포의 형광 이미지를 가져 가라. DAPI 염색에와 사료된다 염색에의 이미지를 복용에 대해 서로 다른 필터를 사용합니다. 정량화를 들어, 시료의 비 중첩 부분에서 각 조건의 3 차원의 섹션 (10)의 이미지 또는 2 차원 배양 (배율 20 배)를도 5의 이미지를 사용한다.
- 2D로 사료된다위한 핵의 수와 양의 핵의 수를 결정
- 사료된다에게 수동으로 소프트웨어 피지 (26)의 플러그인 셀 카운터를 사용하여 긍정적 인 핵을 계산합니다. 따라서, 이미지를 열고 "플러그인"→ "분석"→ "셀 카운터"를 클릭합니다. 보도는 "초기화"와 카운터 유형을 선택합니다. 각 사료된다 긍정적 인 핵을 클릭합니다. 클릭 수 선택된 대향 형 옆 나타낸다.
- 핵의 총수의 자동 셀 카운트 피지 27,28하여 매크로를 생성한다. 치UST 모든 염색 및 세포 라인에 대한 매크로입니다. 다음, 매크로를 만드는 방법을 예를 참조하십시오.
- 매크로 레코더를 시작합니다. DAPI 이미지를 열고 "이미지"→ "입력"→ "8 비트"를 클릭하여 8 비트 형식으로 변환합니다. 설정 "정상화" "1"로 '포화'와 "대비 강화"를 클릭합니다.
- 이미지를 선명하게 "언샵 마스크"를 설정합니다. "0.60"의 "1"과 '마스크'의 '반경'을 사용합니다. 이미지를 binarise하는 '검은 색 바탕에 흰색 물체'로 방법 "RenyiEntropy"을 선택, "자동 임계 값"을 클릭합니다.
- 세포를 분리하기 위해 "5"의 침식 반경 "플러그인"→ "BioVoxxel"→ "유역 불규칙한 기능"을 클릭합니다. → "분석"을 클릭 "입자를 분석"과 "0.02 무한대 '로'크기 '를 설정합니다.
주 : 입자 / 세포의 수가카운트로 요약 표에 표시된. - 또한 이미지의 분석을 위해 매크로를 저장합니다 "만들기"를 클릭합니다.
- 항 5.4.3.1에 설명 된대로 수동으로 3D로 핵의 수와 사료된다 양성 핵의 수를 결정합니다.
- 다음 식에 따라 평균 확산 지수 (PI)를 계산한다 :
n은 이미지의 수 (3D : 10, 2D : 5)
HCC827 세포에서 안티 EGFR 치료의 실리 종양 모델 생성 및 시뮬레이션 6.
- 네트워크 세대 네트워크 분석 소프트웨어를 사용하여
- 중요한 실험 판독 파라미터와 HCC827 세포주 돌연변이 배경에 기초하여 종양 네트워크를 생성하기 위해 다른 공지 된 데이터베이스를 사용한다.
- 시각화 네트워크 분석 소프트웨어 (21)를 열고네트워크.
- "파일"→ "새"→ 유형 'JoVE_tumor 모델'을 클릭 → 새로운 네트워크를 생성하기 위해 "OK"를 클릭합니다. 이중 막에 수용체를 시각화 "OK" "광장 근접 촬영 북한"→ 클릭합니다. 사각형 → 유형 'EGFR'→ '확인'을 클릭 개의 노드 (= 단백질)를 시각화하는 "일반 단백질"을 클릭; 네트워크의 각 노드에 대해이 작업을 반복합니다.
- 네트워크의 노드 레이블 : 마우스 오른쪽 클릭 → "변경 색상 및 모양은 ..."→ 노드 EGFR과 (EGF-EGFR) 색상 코드 "255,0,0"(붉은 색)에 대한 선택; 노드 C-MET 및 (c-MET) 색상 코드 "0, 255, 0"(색상 녹색)에 대한; 피티 니브 색상 코드 "255,255,0"(색 노란색); PI3K-Inh입니다 색상 코드 "204204204"(컬러 라이트 그레이) MEK-Inh입니다 색상 코드 "102102102"(색 어두운 회색) 네트워크 선택 색상 코드의 다른 모든 노드에 대한4, 255, 255, 255 "(색상 흰색).
- 육각형 → 유형 '확산'으로 판독 매개 변수를 시각화하기 위해 "표현형"를 클릭 → "확인"을 클릭 → 오른쪽 → "변경 색상 및 모양 ..."→ 선택 색상 코드 "255204204"(색상 연어)를 클릭; 선택 색상 코드 "255,51,204"(색 보라색) → 매개 세포 사멸에 대해이 작업을 반복합니다.
- 자제력을 위해 (무딘 화살표)을 "억제"를 클릭, 활성화 (화살표)은 "상태 전이"를 클릭; 가장자리 (= 상호 작용)를 시각화 네트워크의 각 상호 작용에 대해이 작업을 반복합니다.
- "파일"→ "다른 이름으로 저장 ..."→ 유형 'JoVE_tumor의 models.xml'를 클릭 → .XML 형식으로 생성 된 신호 네트워크를 저장하려면 "저장"을 클릭합니다.
- 실리 시뮬레이션에서 SQUAD를 사용하여
참고 : SQUAD는 일을 나타냅니다즉 네트워크 이산 논리 부울 시스템 (AND, OR, NOT)과 같은 토폴로지와 정상 상태 분석을 수행한다. 정상 상태 분석 시스템 평형 및 신호 자극시 책임 (예., 약물 애플리케이션 또는 변이)를 반영한다.- 열기 SQUAD 17 소프트웨어, 업로드 → "로드 네트워크" 'JoVE_tumor의 models.xml'파일을 클릭합니다. "실행 분석"을 클릭합니다 :
주 : 다음 SQUAD 시간 이상의 네트워크 동작의 동적 시뮬레이션 (컬러 S 자형 곡선을 활성) 수 부울 네트워크 연결을 보간, 지수 함수를 적용한다. - 시뮬레이션 프로토콜을 작성하는 "고급"→ "Perturbator"을 클릭합니다. 안티 EGFR 저항을 시뮬레이션 : 클릭 "편집 프로토콜"
- "섭동"→ 표준 사용 "초기 상태 (Initial) = SS-4"(정상 상태 4) → '새 정수 펄스'를 추가하려면 "추가"를 클릭 → 괜찮다을 클릭[선택] 매개 변수 "상태"를 선택 시간 → → 선택 대상 "FLIP"는 "0"→ 선택 값 "0.4"→ "확인"을 클릭합니다.
- 이 과정을 반복합니다 : → 선택 매개 변수가 "상태"→ 선택 대상 "C-MET"→ 선택 시간 "0"→ 선택 값 "0.4"→ "확인"을 클릭하여 "추가"를 클릭; 클릭 선택 시간 → → 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "피티 니브"를 "추가"를 "0"→ 선택 값은 "1"→ "확인"을 클릭합니다.
- 활성 노드 (EGF-EGFR)에 상태 값을 설정합니다 "activenode"를 클릭 → "편집"→ 선택 상태가 "0.8"→ "확인"을 클릭합니다; 다른 모든 노드에 대해 "편집"을 클릭 → 상태가 "0"→ "확인"을 클릭하여 선택합니다. 프로토콜을 저장하려면 "OK"를 클릭합니다.
- 특정 곡선을 표시합니다 패널로 이동 "옵션"→ "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "카스파", "(C-MET)", "PI3K" "(EGF-EGFR)"을 선택, "피티 니브", "고사", "확산", "MEK-Inh입니다"와 그래픽 표현을위한 "PI3K-Inh입니다." 시스템의 응답의 전체 시뮬레이션을 시작합니다 "초기화"→ "실행"을 클릭합니다. "재설정"을 클릭 새로운 시뮬레이션을 시작합니다.
- 결합 PI3K 및 MEK 억제제 치료를 시뮬레이션 : 클릭 "편집 프로토콜"
- 6.2.2.3 - 6.2.2.1에 설명 된대로 동일한 노드 매개 변수를 사용합니다. → "추가"를 클릭하여 '새 정수 펄스'→ 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "PI3K-Inh입니다"→ 선택 시간이 "0"→ 선택 값이 "1"→ "확인"을 클릭을 추가하는 "동요"를 클릭; "추가"를 클릭선택 시간 → '새 정수 펄스'→ 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "MEK-Inh입니다"를 추가하려면 "0"→ 선택 값은 "1"→ "확인"을 클릭합니다.
- 프로토콜을 저장하려면 "OK"를 클릭합니다. "옵션"패널로 이동 6.2.2.4에 설명 된대로 그래픽 표현에 대해 같은 노드를 사용합니다. 시스템의 응답의 전체 시뮬레이션을 시작합니다 "초기화"→ "실행"을 클릭합니다. 시뮬레이션을 완료하려면 "재설정"을 클릭합니다.
- 열기 SQUAD 17 소프트웨어, 업로드 → "로드 네트워크" 'JoVE_tumor의 models.xml'파일을 클릭합니다. "실행 분석"을 클릭합니다 :
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결과
SISmuc 지지체 (C로도 2A)에 기초하여, 우리는 3D 종양 테스트 시스템 (도 2D)의 생성을 자극하고 치료를위한 표준 운영 프로토콜을 세웠다. 이 모델은 확산 지수는 각각도 1 및도 3에 도시 된 바와 같이, M30-ELISA를 사용하여 아폽토시스를 정량의 결정을 가능하게한다.도 3 A549 및 HCC827 모델 나타내는 H & E 염색 및 게 피티 니브 한 대표적인 아폽토시스 측정도. 여기에 제시된 모델은 성공적으로 병원에서 대상 억제제로 치료 EGFR -mutated 비소 세포 폐암의 예를 사용하여 설계되었습니다. 대응하여, 단지 EGFR은 HCC827 -mutated 세포 및 A549 세포 아폽토시스의 증가에 의해 평가 우리의 모델에서 ...
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토론
우리는 시험 관내 결합 확립 / 바이오 마커 유도 치료를위한 예측 실리 종양 테스트 시스템이다. 시험 관내 모델은 또한 실리코 (17)에서 시뮬레이션 될 수있는 특정 돌연변이 배경에서 종양 세포 증식 및 아폽토시스의 변화와 같은 복합 작업의 다른 중요한 측면을 평가한다. 여기서는 3D 종양 모델 생성 및 증식 및 아폽토시스의 정량 및 실리코 모델 예측의 확립을 포함하여 화합물을 시험하기위한 표준 프로토콜을 제안한다. 3 차원 모델은 종양 특이 돌연변이를 담지 종양 세포주에 기초한다. 세포는 세포 크라운에 decellularized 조직 매트릭스에서 재배된다. 발판의 매트릭스 생물 반응기 시스템의 조립 탈세 포화, 두 개의 금속 링 (셀 크라운) 사이에 고정뿐만 아니라 시드 25 전에 조브에서 가시화되고있다.
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 연구는 뷔르츠부르크 대학 병원의 학제 임상 연구 (IZKF, 보조금 BD247) 센터와 (헤이 케 Walles 부여) 바이에른 맞춤 프로그램에 의해 후원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조직 | 공학 및 재생 의학의 생물 반응기 의장, Wü rzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell | crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wü rzburg (GER) | 정적 3D 배양을 위한 | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | 이 소프트웨어는 네트워크를 그리는 데 사용되었습니다. |
| 집에서 생산하는 | 구연산염 완충액 (10x) | 42 g/L 구연산 일수화물, 17.6 g/L 수산화나트륨 펠릿, 탈이온수, pH 6.0, RT에 저장됨. | |
| 가정 생산 | 구연산염 완충기 작동 해결책 | RT에 저장된 탈염수에 있는 10% 구연산염 완충기 재고 해결책. | |
| 구연산 일수화물 | VWR, 다름슈타트(GER)1002441000 | 구연산염 완충액에 사용 | |
| 커버 슬립 | VWR, 다름슈타트(GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| KEGG, HPRD 및 QIAGEN과 같은 데이터베이스(유전자 및 Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | 네트워크 토폴로지를 생성하기 위해 서로 다른 알려진 문헌 데이터베이스가 사용되었습니다. |
| 여성용 루어 러그 스타일 티셔츠 | 메드넷, Mü nster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor 설정 |
| 여성 루어 스레드 스타일 5/16" 육각에서 1/4-28 UNF 스레드 | 메드넷, Mü nster (독일) | SFTLL-J1A | 바이오리액터 설정 |
| 태아 송아지 세럼 | Bio& 매도, 포이흐트 (독일) | FCS. ADD.0500 | 비열 비활성화 |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER) | S1025-100 mg | 100 mM 스톡 솔루션 |
| DMSO 유리 플라스크 (Schott, GER) 유리 호스 연결과 함께 제공 | Weckert, Kitzingen (GER) | 맞춤형 | |
| Histofix 4 % (파라 포름 알데히드) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| 호스 커플 링 | Mednet, M & uuml; nster (GER) | CC-9 | 생물 반응기 설치 |
| 생물 반응기 용 인큐베이터 | 조직 공학 및 재생 의학 의장, W ü rzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Mü nster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor 설정 |
| 수분 챔버 | 맞춤 제작 | ||
| 마우스 안티 Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | 클론 C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, 면역형광에 1/100 사용 |
| 바늘 없는 스왑 밸브 여성 Luer | Mednet, Mü nster (GER) | NVFMLLPC | 바이오리액터 셋업, 샘플링용, 감마선 멸균 |
| O-링 MVQ 10 레드 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-링 대형, 바이오리액터 설정 |
| O-링 MVQ 70 레드 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-링 스몰, 바이오리액터 셋업 |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| 파라핀 | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| 연동 펌프 | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | 생물 반응기 설정 | |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| 펌프 튜빙 카세트 | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, IF |
| Rabbit anti Vimentin | , Cambridge (UK) | ab92547 | 에 1/100 사용 |
| , 다름슈타트 (GER) | 61870-044 | 37 °에서 따뜻하게; C 사용 전 수조 | |
| 실리콘 튜브 | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | 생물 반응기 설정 |
| 수산화나트륨 | Sigma-Aldrich, M ü | 구연산염 버퍼 | 30620-1KG-R |
| -이 소프트웨어는 반 정량 시뮬레이션을 수행하는 데 사용되었습니다. | |||
| 멸균 공기 필터, 기공 크기 0.2 &마이크로; m | Sartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER) | 16596-HYK | 생물반응기 설정 |
| 주사기 Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, 하이델베르크(GER) | 309649 | 생물반응기 샘플링 |
| 조직 배양 테스트 플레이트: 6-, 12-, 24-, 96-웰 | TPP 테크노 플라스틱 제품 AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| 변형 성장 인자-베타 1 (TGF-β 1) | 멸균 시트르산염 완충액 pH 3.0 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Mü의 Frankfurt (GER)8915LC 원액; nchen (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | 시그마-알드리치, Mü nchen (GER) | P7949-500ml | 면역 형광 염색 세척 완충액 |
참고문헌
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