방법 논문

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

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DOI:

10.3791/53886

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2016년 3월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 2Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, 3Department of Surgery, National Taiwan University Hospital and College of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

초록

비만은 전 세계적으로 제약이 없는 전염병입니다. 지방 조직 발달에서 분자 조절을 밝히는 것은 비만이나 당뇨병을 치료할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 수많은 불멸의 지방생성 세포주가 확립되었지만, 피하 백색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 유래한 지방 유래 줄기세포는 생체 내 지방 발달에 훨씬 더 가까운 신뢰할 수 있는 세포 시스템을 생체 외 세포로 제공합니다. 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)는 생후 7일에서 9일 된 새끼 돼지에서 분리됩니다. 돼지 피하 지방 조직의 등쪽 백색 지방 저장소를 얇게 썰고 다지고 콜라겐 분해 효소를 소화합니다. 이러한 pADSC는 지방세포로 분화할 수 있는 강력한 잠재력을 보여줍니다. 또한, pADSC는 선택적 줄기세포 마커로 평가된 다능성을 가지고 있어 지방세포, 골세포, 연골세포를 포함한 다양한 중간엽 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 이러한 pADSC는 고전적인 지방 세포 분화를 조절하거나 중배엽 기원의 다른 중간엽 세포 유형에 대한 방향으로 분자 스위치를 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 외배엽 및 내배엽 기원의 세포로 확장된 계통이 최근에 달성되었습니다. 따라서 이 프로토콜에서 파생된 pADSC는 지방 발달 연구 및 재생 의학의 조직 공학에 대한 적용을 위한 완전한 다능성을 가진 풍부하고 평가 가능한 성인 중간엽 줄기세포 공급원을 제공합니다.

서론

30 이상의 체질량 지수 미국 인구의 30 %에서 본 비만, 널리 보급 된 현상 전세계 1로 떠오르고있다. 비만은 심혈관 질환, 2 형 당뇨병, 암 2-4을 포함한 합병증으로 이어질하는 경향이있다. 따라서 비만을 다루는 것은 중요한 우선 순위입니다. 비만은 지방 조직의 대규모 확장으로 명시하고, 과도한 음식 소비와 현대 사회에 앉아있는 라이프 스타일에 기인한다. 따라서, 지방 조직과 지방 생성의 전사 조절을 해독하는 것은 비만이나 당뇨병 (5)을 치료하기 위해 약속을 개최 할 수있다.

3T3-L1, 3T3-F442A 및 기타 마우스 지방 세포 세포주는 지방 조직 개발 과정에서 지방 조직 또는 지방 생성을 연구하기 위해 적용되었습니다. 그러나, 생체 내 6 세포 체외에서 라인과 동물 사이의 규제 메커니즘에 약간의 차이가 있습니다. 차 지방-DERI간질 혈관 세포 분획 VED 줄기 세포 (ADSC)는 백색 지방 조직으로부터 직접 단리 분화하도록 유도 될 수있다. 지방 세포에 ADSC의 차별화은 대부분 생체 (7)의 지방 조직 개발에서 지방 조직과 지방 생성의 과정을 되풀이되었습니다.

돼지는 지방 조직 개발에서 지방 조직과 지방 생성을 연구하기위한 적절한 동물 모델이다. 이전 돼지 연구 8-10 스테롤 조절 요소 결합 전사 인자 1C (SREBP1c) 지방을 생성 지방산 합성 효소의 전사를 조절하는 것으로 알려져 중요한 전사 인자의 발현은 돼지 간에서 다중 불포화 지방산 (PUFA)에 의해 저해되는 것을 보여 및 지방 조직. 생체 내 및 시험 관내에서 PUFA 감소 돼지 SREBP1c의 발현은 인간과 쥐 11-13와 같은 다른 종과 유사하다. 체외에서이 돼지 연구는 DIFF에 주로있다돼지 ADSC (pADSC)에서 파생 된 erentiated 지방 세포. 따라서 pADSC이 일차 세포 배양 물은 지방 조직 발달 또는 기타 줄기 세포 응용 연구하는 신뢰성있는 셀룰러 시스템의 역할을 할 수있다.

프로토콜

참고 :이 방법은 설립과 연구에 사용 이전에이 실험실 14-17을보고되었다; 시간이 지남에 따라 방법은 수정되었습니다. 현재의 절차를 6 웰 조직 배양 플레이트에 시딩으로 (7 일 9 개월) 한 돼지에서 돼지의 피하 지방 조직의 60g의 평균을 사용하여 수행 하였다. 달리 지정하지 않는 한 모든 절차는 실온에서 수행 하였다. 모든 동물 실험은 국립 대만 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 소화 매체 준비

  1. 다시 목의 피하 지방 조직을 얻기; 돼지 당 40 g 80 (7 ~ 9 일 이전)은 돼지의 크기에 따라. 여기, 한 돼지에서 얻은 피하 지방 조직의 60g를 사용합니다.
  2. 소화 매체를 준비합니다 (DMEM을 54,000 단위의 총 콜라게나 제 II 분말의 무게를 90 둘 베코의 변형 이글 중간 가하여을 용해,100 ml의 혈청 학적 병 60 g 지방) (콜라게나 제 900 단위 / 1.5 ml의 DMEM / g 지방)합니다.
  3. 부드럽게 용해 후 살균을위한 0.22 μm의 필터를 통해 소화 매체를 전달하는 데 적어도 15 분 동안 진탕 테이블 (100 RPM)에서 소화 매체를 선동. 사용하기 전에 4 ° C에서 보관하십시오.

돼지 2. 해부 피하 지방이 조직

  1. 사용하기 전에 37 ° C에 대한 모든 악기, 유리 및 플라스틱 제품 따뜻한 모든 미디어를 소독.
  2. 전기 충격적이고 방혈 또는 로컬 IACUC의 규정에 따라 방법을 사용하여 돼지를 희생. 새끼 돼지가 희생 된 후 신중하게 즉시 절개를 수행합니다.
  3. 깨끗한 수술 테이블에 돼지를 놓고 (허리와 배를 아래로 향하도록). 중간 선 아래로 양쪽 꼬리와의 목에서 모든 머리를 제거 돼지 뒤쪽에서 머리를 면도.
  4. 7.5 %의 povidone-와 돼지의 등쪽 피부를 문질러요오드 세 (새로운 세 독립적-수술)와 시간 후 요오드 약 10 분 동안 피부의 표면 상에 앉을 수.
  5. 70 % 에탄올의 여러 스프레이로 포비돈 - 요오드를 제거합니다. 거즈 패드 또는 포비돈 - 요오드 뚜렷한 색이 관찰되지 않을 때까지 반복 한 방향으로 피부를 닦아내 70 % 에탄올을 함유하는 티슈 종이를 사용한다.
  6. 지방을 잡고 피부 집게를 사용하는 동안 근육에서 첨부 된 스킨 층과 함께 피하 지방 조직의 돼지 등의 지방 층을 분리 메스를 사용합니다.
  7. 즉시 무 혈청 DMEM을 함유하는 멸균 된 비이커 (200 ml)에 연결된 피부와 피하 지방 조직의 지방층 젖어.
  8. 층류 세포 배양 후드에서 70 % 에탄올 및 장소 기름 층을 포함하는 비커의 외부 스프레이. 후드의 대형 (40cm X 30cm) 멸균 트리플 레이어 커버 호일을 놓습니다. [A 삼중 층 지속적인 무결성을 보장하기 위해 사용된다.]
  9. 놓고피부 커버 호일에 아래로 향하도록 조직.
  10. 근육 조직의 오염을 피하기 위해 집게와 가위를 이용하여 지방 조직 오프 나머지 근조직 트림.
  11. 사각형 조각으로 지방을 잘라 (~ 7cm X 7cm) 메스 나 가위. 무 혈청 DMEM을 함유하는 새로운 멸균 비이커 (200 mL)에 지방층 이들 정보를 넣는다.
  12. 탄소 강철 슬라이서 블레이드 (그림 1) 조립 커버 호일에 사용자 정의 슬라이스 홀더를 설정합니다. 비커에서 지방의 한 조각을 가지고 슬라이서 (상단과 지방 레이어 아래에 피부 층)에 놓습니다.
  13. 약 1mm 두께의 조각으로 피하 지방 조직의 지방층을 슬라이스. 가능한 한 가까운 피부의 지방층 슬라이스하지만 피부를 얇게 마십시오.
  14. 말하다가 가능한 미세 가위로 지방 조직을 분리합니다.
  15. 다진와 250 ㎖의 삼각 플라스크 또는 혈청 학적 병 콜라게나 제를 포함하는 여과 소화 매체를 추가지방 조직 (콜라겐의 54,000 단위 / 90 ml의 DMEM / 60g 지방).
  16. 부화 및 콜라게나 제는 조직을 소화 할 수 있도록 37 ℃에서 90 분 동안 진탕 기에서 45 rpm으로 삼각 플라스크를 소용돌이 친다.
    참고 : 오버 소화를 방지하기 위해 매 15 ~ 30 분을 확인합니다. 소화 매체가 상당한 조직 덩어리없이 슬러리 경우 소화 과정이 완료된다.
  17. 콜라게나 제 소화를 중지 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM / F12를 함유하는 배지 (소화 매체 같음) 동량을 추가한다.

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돼지 등의 피하 지방 조직에서 그림 1. pADSC의 분리에 사용되는 사용자 정의 슬라이서. 해부 지방 조직은 첨부 된 스킨 층과 지방층으로 구성되어있다. 슬라이서는 오버의 회피와 약 1mm 두꺼운 지방층을 슬라이스 필요스킨 층으로 슬라이싱. 슬라이스 홀더, 슬라이서 패드, 탄소 강철 슬라이서 블레이드, 나사 : 왼쪽에서 오른쪽으로. 슬라이서 블레이드 슬라이스 홀더 및 조립 슬라이서 패드 사이에 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기질 혈관 분획에서 pADSC 3. 컬렉션

  1. 깨끗한 살균 250 mL의 삼각 플라스크에 시폰의 단층 또는 250 ㎖의 혈청 병 통하여 소화 지방 조직을 포함하는 소화 매체를 통과한다. 안내 및 다이제스트의 통과를 돕기 위해 폰의 중간을 우울하게하는 집게를 사용합니다.
  2. 배수 및 통과를 완료하기 위해 집게와 쉬폰 트위스트.
  3. 네 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 (~ 튜브 당 40 ml의 매체)로 소화 매체를 배포합니다.
  4. 10 분 동안 700 XG에 원심 분리기 기질 혈관 세포의 펠렛을 수집합니다.
  5. 성숙한 지방 세포를 포함하는 지방 상부 층의 대부분을 제거하는 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 경사 분리한다. 피펫 튜브 부드러운 흔들림으로 펠렛을 재현 탁 각 튜브에 10 ㎖의 DMEM을 첨가하여 침전물을 세척 하였다.
  6. 6 분 동안 700 XG에 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다.
  7. 10 ml의 ACK 용해 버퍼를 추가 한 후 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 그것은 기질 혈관 부분에 붉은 혈액 세포를 용균하는 RT에서 7 분 (5 분 ~ 10)에 대해 서 보자.
  8. 튜브의 부드러운 흔들림으로 반응을 정지 한 후 10 분 동안 700 × g으로 원심 분리에 DMEM (10 ㎖)의 동일한 양을 추가한다.
  9. 각 튜브에 10 ML의 DMEM을 추가, 뜨는을 가만히 따르다 6 분 동안 700 XG에서 반복 피펫으로 펠렛, 원심 분리기를 재현 탁. 두 번 반복합니다.
  10. 수집하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 스트레이너를 통해 정지 세포와 DMEM (60g의 지방을 대표하는 4 관에서 40 ML의 DMEM의 총)을 전달합니다.
  11. 조심스럽게 피펫 메디칼음 여러 번 새로운 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 잘 나누어지는 0.4 % 트리 판 블루 용액 (1시 10분 희석) 180 μL와 혼합 세포 함유 매체의 20 μl를 혼합합니다.
  12. DMEM / F12, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 1 %의 항생제를 함유하는 배지와 배양 접시 나 플레이트의 원하는 크기에 60,000 세포 / ㎠의 밀도에서 후 혈구 종자 pADSC와 셀 개수 -streptomycin-암포 테리 신 B 용액 (P / S / A). 일반적으로, 지방 세포 또는 골 세포 분화 용 6- 웰 조직 배양 플레이트에 pADSC 시드. 줄기 세포 나 연골 세포 분화의 표면 마커 염색에 대한 10 cm 요리에 p​​ADSC을 시드.
  13. 접시에 세포 부착을 허용, 5 % CO 2 공기에서 37 ° C 배양기에서 접시 나 요리를 품어.

유동 세포 계측법에 의해 pADSC 4. 식별 줄기 세포 표면 마커

  1. 24 시간 후, 배지를 완전히 제거 회 씻어인산 완충 용액 (PBS), 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 1 ㎖ 수확 세포 회 전자 10 cm 접시.
  2. , 배지 (1 ml)을 같은 양으로 트립신 EDTA를 중화 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집 한 후 7 분 동안 400 × g에서 원심 분리기.
  3. 뜨는을 가만히 따르다. 7 분 동안 400 XG에서 원심 분리와 결합 피펫으로 두 번 3 ㎖ 얼음처럼 차가운 FCS-세척 버퍼에 사용하여 재 서스펜션 (PBS 10 % FBS를 포함) 펠렛을 씻으십시오.
  4. 재현 탁은 수 및 FCS 빙냉 세척 완충액에 10 6 세포 / ml로 pADSC을 조정한다. 여러 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 장소 세포 (100 μL / 각각의 튜브) 및 하나 피코 에리 트린 - 복합 CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE에 대한 항체와 30 분 동안 4 ° C에서 pADSC를 포함하는 튜브를 품어 , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE 또는 직접 염색 MHC II-PE. FCS-세척 완충액 400 × g에서의 centrifugat과 함께 10 ㎖로 두 번 세포를 세척하여 반응을 정지7 분 동안 이온.
  5. 수정 및 제조업체의 지침 및 이전 간행물 (18)에 따라 유동 세포 계측법에 대해 (0.01 %의 FBS와 1 %의 포름 알데히드 PBS)를 고정 버퍼에 세포를 재현 탁.

지방 세포, 골 세포와 연골 세포로 pADSC 5. 차별화

  1. 지방 세포에 pADSC의 차별화
    1. 지방 세포 유도 매체 지방 세포 유지 배지를 준비
      1. (10 ㎎ / ㎖ HEPES 완충액, pH가 8) 1 ml의 인슐린 스톡 최종 진한 = 지방 세포 유도 배지를 들어, 다음을 포함하는 (1 %의 항생제를 P / S가 / A)와 무 혈청 DMEM / F12 1 L를 조제 10 μg의 / ㎖; 1 μL의 T3의 재고 (3,3 ', 5 Triiodo-L-로닌, DMSO의 1 mM)을 최종 진한 = 1 nm의; 200 μL의 트랜스페린 재고 마지막 진한 = 10 μg의 / ㎖ (50 ㎎ / ㎖ 두 번 증류수 H 2 O); 100 ㎕를 덱사메타손 재고 (에탄올 10 mM)을 최종 진한 = 1 μM; 100 μL 로시글리타존 재고 (DMSO 10 mM)을 최종 진한= 1 μM.
      2. 유도 배지와 같은 첨가물 지방 세포 유지 배지를 준비하지만, 덱사메타손 생략하고.
    2. 지방 세포에 대한 분화 과정
      참고 : 6 웰 플레이트에 pADSC를 파종 한 후, pADSC 72 시간 이내에 컨 플루 언트 될 것이다.
      1. 3 일 후, 완전히 매체를 제거하고 각 웰에 지방 세포 유도 매체의 3 ㎖를 추가합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.이 차별화의 날 제로이다.
      2. 3 일 후, 완전히 지방 세포 유도 매체를 제거하고 지방 세포의 유지 보수 매체의 3 ㎖ 3 일마다 교체. 성숙한 지방 세포는 불치병에 약 9 일까지 차별화됩니다. 지방 세포의 90 % 이상이 아니라이 프로토콜을 사용하여 구분됩니다. 이러한 지방 세포는 오일 레드 O 염색에 대한 준비가되어 있습니다.
  2. 골 세포로 pADSC의 차별화
    1. 골 세포 유도 매체를 준비 : 완전한 문화 mediu을1 μM 덱사메타손, 10 밀리미터-β 글리세로 포스페이트, 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산 -2- 인산 함유 m (10 % FBS와 1 % P / S / A를 가진 DMEM / F12).
    2. 골 세포에 대한 분화 과정
      참고 : 6 웰 플레이트에 pADSC를 파종 한 후, pADSC 72 시간 이내에 컨 플루 언트 될 것이다.
      1. 3 일 후, 완전히 매체를 제거하고 각 웰에 골 세포 유도 매체의 3 ㎖를 추가합니다. 37 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. 이 차별화의 날 제로이다.
      2. 3 일마다 골 세포 유도 매체로 교체하십시오. 성숙한 골 세포는 분화 14 일에 의해 형성됩니다. 이 골 세포는 알리자린 레드 S 염색에 대한 준비가되어 있습니다.
  3. 연골 세포로 pADSC의 차별화
    1. 연골 유도 배지를 준비 : αMEM는 1 % FBS, 6.25 μg의 / ㎖ 인슐린, 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산 -2- 인산을 함유하고, (10) 성장 인자 β1 변환 / ㎖ 겨.
    2. 연골 세포에 대한 분화 과정
      1. 24 시간 동안 10 cm 배양 접시에 pADSC를 파종 한 후, 완전히 배지를 제거하고 PBS로 두 번 설거지.
      2. 후 1-5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA의 용액과 함께를 Trypsinize pADSC 1 ml의 배양액으로 중화. 수집, 계산 및 튜브 당 2.5 × 10 5 세포의 밀도로 15 ML 원뿔 튜브에 pADSC을 조정합니다. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
      3. 7 분 동안 400 × g에서 원심 분리 후, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 취소하고 15 ML 튜브에 연골 세포 유도 매체의 1ml를 추가합니다. 튜브는 37 ° C 배양기로 돌아갑니다. 이 차별화의 날 제로이다.
      4. 바닥에 세포를 제거하지 않고 연골 세포 유도 매체를 3 일마다 교체합니다. 성숙한 연골 세포는 약 14 일 형성 할 것이다. 이 연골 세포는 톨루이딘 블루 O 염색에 대한 준비가되어 있습니다.

차별화 된 지방 세포, Osteocy 6. 염색TES와 연골 세포

  1. 차별화 된 지방 세포 오일 레드 O 염색
    1. 일 9시​​, 분화 된 지방 세포를 6 웰 배양 플레이트에서 지방 세포 유지 배지를 제거하고 PBS로 두 번 플레이트를 세척한다. [다음 단계에서, 6 웰 플레이트의 각 웰을 덮도록 충분한 지정된 시약을 추가한다.]
    2. 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액으로 지방 세포를 고정한다.
    3. 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오.
    4. 두 세척 한 후, 배양 접시에 100 % 프로필렌 글리콜을 추가 1 분 동안 방치하자.
    5. 100 % 프로필렌 글리콜을 분리 한 다음 배양 용기에 오일 레드 O 용액 (프로필렌 글리콜 0.5 %)를 추가합니다. 부드러운 교반 (100 RPM)와 로커 통에 적어도 10 분 동안 서 보자.
    6. 기름 빨간 O 솔루션을 제거한 다음 60 % 프로필렌 글리콜로 교체합니다. 1 분 동안 서 보자.
    7. 60 %의 프로필렌 글리콜을 제거한 후 D로 두 번 접시를 씻어물을 ouble는 증류.
    8. 10 % 포르말린 용액으로 교체합니다. 지방 세포의 내부의 스테인드 지질 방울은 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
    9. 세포 내 오일 레드 O의 정량 (아래 선택적 단계) : 현미경 관찰 한 후, 10 %를 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오.
    10. 완전히 판을 배출하고 6 웰 플레이트에 이소프로판올 500 μl를 추가합니다.
    11. 이소프로판올 오일 레드 O.의 염료를 용해 적어도 10 분 동안 부드러운 로커 통 (100 RPM)에서 6 웰 플레이트에 서 보자
    12. 오일 레드 O를 함유하는 이소프로판올을 흡인하고 96 웰 플레이트 상에 배포한다. 510 nm에서 분광 광도계 판독을 사용하여 상기 추출 된 오일 레드 O 정량화.
  2. 차별화 된 골 세포에 대한 알리자린 레드 S 염색
    1. 14 일에서 차별화 된 골 세포와 6 웰 플레이트에서 골 세포 유도 매체를 제거하고 PBS로 두 번 접시를 씻으십시오. [followi에서NG는 6- 웰 플레이트의 각 웰을 덮도록 충분한 지정된 시약을 추가하는 단계.]
    2. 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액에 골 세포를 고정한다.
    3. 각 웰에서 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오.
    4. 이 세척 한 후, 6 웰 플레이트에 2 % 알리자린 레드 S 용액 (= 4.1-4.3의 pH)를 추가하고 부드러운 로커 통 (100 RPM)에 적어도 15 분 동안 서 보자.
    5. 알리자린 레드 S 솔루션을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오.
    6. 10 % 포르말린 용액으로 교체합니다. 골 세포는 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
  3. 차별화 된 연골 세포에 대한 톨루이딘 블루 O 염색
    1. 14 일에, PBS로 두 번 상기 튜브를 상기 튜브의 하단에 분화 된 연골 세포의 침전물을 제거하고 세척없이 15ml의 원뿔형 튜브로부터 대기음 연골 유도 배지. [다음 단계에서, 코브만큼 지정 시약을 추가r은 튜브 또는 섹션 슬라이드 하단에 연골 세포.]
    2. 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액에 연골 세포를 고정한다.
    3. 각 관에서 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 튜브를 세척한다.
    4. 이 세척 한 후, 5 ㎛의 두께로 저온 유지 장치와의 OCT 화합물 및 섹션의 알약을 포함.
    5. 톨루이딘 블루 O 용액 (pH가 4.1으로, 0.1 %)로 저온 유지 부의 슬라이드 얼룩.
    6. 톨루이딘 블루 O 솔루션을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 절을 씻는다.
      참고 : 슬라이드에 연골 세포를 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다.

결과

돼지 등의 피하 지방에서 유래 pADSC는 배양 플레이트 또는 요리에 시드 및 그림 2에 나타내었다. 기질 혈관 분획으로부터 파생 된 pADSC의 형태는 마우스 또는 인간의 ADSC 유사하다. 스물 네 시간 시딩 후, subconfluent의 pADSC는 접착과 확장 된 섬유 아세포와 같은 형태 (그림 2A)가있다. pADSC 72 시간 이내에 합류를하게하고 지방 세포 또는 다른 중간 엽 형 분화 (그림 2B)에 대한 준비가되어 있습니다. 화학 유도 및 성숙 지방 세포가 지방 세포 분화 (그림 2C)를 보여주는 pADSCs의 90 % 이상으로 분화 9 일 후에 관찰 할 수 후 강한 지방 세포의 잠재력을 전시 pADSC.

이 프로토콜에서 유래 pADSC의 특성을 해결하기 위해 pADSC의 표면 마커는 유동 세포 계측법 항문으로 평가이 Analysis. 도 3에 도시 된 바와 같이, CD29, CD44, CD90 및 MHC I (또는 HLA I)를 포함하는 중간 엽 줄기 세포에 대한 표면 마커는 고도로 발현되었다. 이러한 CD4a, CD31, CD45 및 MHC II (또는 HLA II)와 같은 음의 표면 마커는 프로토콜 (그림 3)에서 파생 된 pADSC에서 거의 감지했다. 이러한 결과는 보여 그 골수성 또는 림프 전구 세포를 포함하는 중요한 내피 세포 또는 조혈 줄기 세포 오염없이이 pADSC 전시 중간 엽 형 줄기 세포 특성.

또한 그 pADSC는 중간 엽 줄기 세포를 나타내는 확인하려면 pADSC의 다 능성은 지방 세포, 골 세포와 연골 세포로의 분화에 의해 조사 하였다. 이러한 지방 세포, 골 세포와 연골 세포는 특정 염료, 오일 레드 O, 알리자린 레드 S, 및 톨루이딘 블루 O, 각각 (그림 4)에 의해 염색 하였다. 이러한 데이터는이 프로토콜은 무을 유지 pADSC 생성을 나타냅니다간엽 형 선조 닮은 전체 특성 ltipotency.

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다시 돼지의 지방 지역에서 pADSC 그림 2. 형태론. (A)는 Subconfluent pADSC는 접착 6 웰 배양 접시에 24 시간 시딩 후 확장했다. (B) pADSC는 6 웰 배양 접시에 72 시간 이후에 컨 플루 언트 파종되었다. (C)이 성숙한 지방 세포의 지방 세포 분화 pADSC 9 일 후에 관찰되었다. 이미지는 위상차 현미경을 사용하여 100 × 배율로 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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줄기 세포의 그림 3. 확인pADSC위한 표면 마커. pADSC 1 × 105은 특이 적 항체 반응 및 분석을 유동 세포 계측법에 의한 줄기 세포 마커에 대해 분석 하였다. 숫자는 흠없는 대조군과 비교 인구 (레드)에서 염색 된 세포의 비율을 나타낸다. x 축은 상대적인 형광 강도를 나타낸다. y 축은 세포의 인구를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
pADSC의 pADSC. 능성의도 4 능성 분화는 (A) 지방 세포, (B) 골 세포 (C) 연골 세포로 pADSC를 미분함으로써 결정될 대표적인 염료 각각 오일 레드 O, 알리자린 레드 S, 및 톨루이딘 블루 O에 의해 염색 . 난 ...GES는 (A) 100 × (B) 200 X 및 위상차 현미경을 사용하여 (C) 100 × 배율로 촬영 한 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서 우리는 pADSC의 기본 세포 배양에서 지방 조직 개발을 연구하는 신뢰할 수있는 셀룰러 시스템을 제시한다. 다른 불멸화 세포주에 비해,이 방법은 지방 세포 또는 생체 내에서 동물의 개발과 관련된 다른 중간 엽 계통의 분화 과정 연구에 적용 할 수있는 고품질의 성인 중간 엽 줄기 세포를 대량으로 분리하는 편리한 방법을 제공한다. 이 프로토콜의 중요한 수정 단계는 우리가 다른 종 (19, 20), 수율 및 pADSC의 다 능성에 오래된 돼지에 비해 작은 돼지를 처리하기 쉽고과 유사하기 때문에 7- 9 일된 새끼 돼지를 사용 pADSC를 유도한다는 것입니다 돼지의 나이 (21)로 감소한다.

전위의 줄기 세포 공급원은 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC) 산후 성체 줄기 세포를 포함한다. 다 능성 성체 줄기 세포로 분류 ADSC의 제약은 성체 줄기 세포의 다 능성이고발산 계보를 차별화 상대적으로 ESC 또는 IPSC에 비해 제한됩니다. 그러나, IPSC의 ESC 및 종양 특성의 유도에 관한 윤리적 문제는 ESC 및 IPSC 22, 23의 적용을 억제. 따라서, 수많은 연구자는 다 능성을 향상시키기 위해 노력 성체 줄기 세포에 집중했다. 오랫동안 연구되어왔다 성인 중간 엽 줄기 세포 (MSC), 가장 일반적인 소스는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (24)이다. 그러나 수확 골수은 상대적으로 고통스러운 절차로 간주됩니다. 또 다른 관심사는 골수 줄기 세포의 수율이 유한하다는 것이다. 골수 흡인 mL의 당 6 × 106 유핵 세포의 평균을 산출하고, MSC는 모든 유핵 세포를 0.001 내지 0.01 %를 나타낸다. 이러한 단점을 고려하여, ADSC는 다 능성 줄기 세포 (25, 26)를 얻기 덜 돌출 소스로 권장합니다.

regenera에서 ADSC의 사용에 대한 제한적인 의학은 세포 수율과 품질에 큰 정도에 따라 달라집니다. 따라서,이 프로토콜에 ADSC를 분리 돼지를 채용하는 의미는 고품질의 성체 줄기 세포를 대량으로 수득하는 것이다. 돼지 때문에 27-30 종 간의 비교 장기 크기와 다양한 생리 학적, 생화학 적 유사성을 나타내는 인간 유용한 동물 모델이다. 상업적인 회사에서 hADSC 취득 비싸고 대부분의 경우에 세포가 조작 된 계대 또는 냉동 보관한다. 인간의 임상 샘플을 취득하기 때문에 윤리적 인 문제로 인해 상대적으로 어렵고, ADSC의 생산이 제한됩니다. 우리는 콜라게나 소화 후 g 지방 당 약 6 × 10 5 hADSC을 유도. 여성의 유방 지방 조직의 100g (평균 샘플링)를 6 × 10 7 세포 총 수확 할 수있다. 각각의 마우스를 사용하여 수율이 더욱 제한된다. 1 × 10 6 세포의 총 피하 마우스 내가 0.4 g에서 수확 할 수있다성인 FVB 마우스의 양쪽 다리에서 nguinal 지방 조직 (6-8 주 이전). 그러나 한 개인 돼지 (7 ~ 9 일) 이전에, 2 × 10 8 세포의 총 쉽게 지느러미 지방 저장소에서 얻을 피하 지방 조직의 60g에서 수확 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 유도 된 pADSC 전체 중간 엽 형 능성 적절한 중간 엽 줄기 세포 마커를 가지고있다. 따라서 pADSC 줄기 세포의 품질을 손상시키지 않고 성체 줄기 세포를 대량으로 얻기위한 바람직한 원이다.

pADSC의 적용은 지방 조직 및 지방 생성을 포함한 지방 세포 분화를 해독에 한정되지 않는다. 최근 ADSC 회생 22,31,32 의학 분야에서 줄기 세포의 인기있는 소스되었다. 다른 줄기 세포의 공급원에 비해, ADSC는 쉽게 접근되는 풍부한 독특한 장점을 보유하고, 그들의 강력한 다 능성 줄기 세포 치료 및 조직 예 유망한 소스 것으로 입증되었다ngineering 22,33,34. 지방 조직의 쉬운 접근성 ADSC 다 능성 전구 세포를 얻을 수있는 최소 관입 가지 방법 중 하나를합니다. 최근에, 우리는 pADSC가 중간 엽 분화 (게시되지 않은 데이터)에 한정되지 않고 있음을 나타냅니다 포도당 응답 인슐린 분비 클러스터로 pADSC 차별화. 기타는 ADSC는 또는 외배엽의 신경 세포 (hADSC 35 pADSC 36) (hADSC 37 또는 pADSC 38)에서 내배엽의 간세포와 같은 다른 세균 층에서 파생 된 여러 종류의 세포로 분화 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 따라서 pADSC 원하는 계통을 수득 발산 분화 과정에 세포를 유도하여 높은 처리량 약물 또는 생체 검사를 위해 사용될 수있다. 따라서,이 프로토콜에서 파생 된 pADSC는 재생 의학 연구를위한 줄기 세포 치료 및 조직 이식의 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.

공개 사항

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감사의 글

저자는 광범위한 토론에 대한 모든 실험실 회원들에게 감사의 말씀을드립니다과 기술이 프로토콜을 지원합니다. 실험실에서 수행 연구는 과학 기술부에서 교부금에 의해 지원되었다 (MOST 103-23​​14-B-002-126과 MOST 102-2313-B-002-026-MY3) 및 상위 대학 계획에 대한 목표 보조금으로 국립 대학, 대만 (104R350144).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>시약
콜라겐분해효소, II형시그마-알드리치C6885
DMEM, 고포도당, 피루브산Life Technologies11995-040
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032
소 태아 혈청 (FBS) 생물공업04-001-1   
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B (P/S/A) 용액생물학 산업03-033-1항생제 및 항진균제 용법
&알파; MEM, 뉴클레오시드 없음 Life Technologies12561-049
ACK 용해 완충액 라이프 테크놀로지A10492-01
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드라이프 테크놀로지스25200072
CD4a-PE시그마-알드리치SAB4700063
CD29-PE시그마-알드리치SAB4700398
CD31-PE시그마-알드리치SAB4700467
CD44-PE시그마-알드리치SAB4700183
CD45-PE시그마-알드리치SAB4700483
CD90-PE시그마-알드리치SAB4700686
HLA 클래스 I-PE(MHC I) 시그마-알드리치SAB4700640
HLA-DR-PE(MHC II) 시그마-알드리치SAB4700662
인슐린 Sigma-AldrichI9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)Sigma-AldrichT6397
트랜스페린 Sigma-AldrichT2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-AldrichI7018
덱사메타손 시그마-알드리치D4902
로시글리타존케이맨71740
&베타;-글리세로포스페이트 Sigma-AldrichG9422
2-Phospho-L-아스코르브산 Sigma-Aldrich49752
TGFB1 재조합 인간 단백질 R& D 시스템 240-B-002
오일 레드 O 시그마-알드리치O0625
알리자린 레드 S시그마-알드리치A5533
톨루이딘 블루 O시그마-알드리치198161
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Equipment
탄소강 블레이드Thomas Scientific6727C18
Falcon 100 µ m 세포 여과기Corning 352360
Falcon 6웰 플레이트Corning 
팔콘 100mm  디쉬코닝 
스 353046353003

참고문헌

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