우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
지방 유래 줄기세포(ASC)의 분리는 지방 조직 생물학, 지방 형성 및 세포외 기질(ECM) 리모델링 분야에서 중요한 방법입니다. 생체 내에서, 섬유소 콜라겐으로 구성된 ECM이 풍부한 환경은 비만의 진행과 퇴행 동안 지방 조직에 구조적 지원을 제공합니다. 기질 금속단백분해효소(MMP)에 의해 매개되는 생리학적 ECM 리모델링은 지방 조직의 크기와 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다1,2. 생리학적 콜라겐 분해 ECM 리모델링의 손실은 과도한 콜라겐 축적(조직 섬유증), 대식세포 침투, 그리고 궁극적으로 인슐린 저항성을 포함한 대사 항상성의 상실로 이어질 수 있다3,4. 유전자 표적 마우스 모델에서 지방 조직의 표현형 변화가 관찰되는 경우, 체외 연구를 위해 지방 저장소에서 1차 ASC를 분리하는 것은 ASC의 기능을 조절하는 데 있어 특정 유전자의 역할을 정의하는 효과적인 접근 방식입니다. 다음에서는 Sca1높은 ASC의 면역자기 분리를 정의합니다.
서론
세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + - 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 - CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1 + : 증식 및 생체 조건 9 지방 세포로 분화 완벽하게 할 수있는 CD24 + 세포. CD24에서 CD24 +
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프로토콜
윤리 정책 : 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)은 (실험 동물 연구를위한 연구소, 국립 연구위원회)가 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 모든 방법과 프로토콜을 승인했다. 마우스는 미시간 대학의 동식물 사육장 유지하고, 음식과 물을 무료로 액세스 권한을 부여하고, 12 시간 어두운 / 라이트 사이클에 보관됩니다.
1. 준비
- DMEM, 10 % FBS, 1 배 P / S / G 및 1X 항생제 / 항진균제와 차 문화 미디어를 준비합니다. 이것은 이전 소화 조직을 유지하는 데 사용된다. 37 ºC 물을 욕조에 주식과 나누어 놓습니다.
- 5 ㎎ / ㎖ (+ 칼슘 + 마그네슘) 지방 패드의 각 유형에 대한 다섯 마우스에 최대, 고립 된 HBSS에 용해에서 유형 III 콜라겐 솔루션의 다섯 밀리리터를 준비합니다. 하나의 유전자형에서 SQ와 VIS를 분리 할 때 야생형과 돌연변이 SQ와 VIS는, 20 ㎖을 예를 들어, 10 mL로합니다. 7.4 인트하여 pH를 조정필터를 화나게. 50 ㎖ 튜브로 나누어지는. 따로 떨어져 빛에서 설정합니다.
- 수술 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 닦아와 푸른 패드 커버. 블루 패드에 약간의 에탄올을 스프레이. <....
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결과
다른 지방 패드에서 SCA1 고의 ASC의 농축.
SQ 지방 디스플레이와 같은 섬유 아세포로부터 단리 혈관 간질 세포 SCA1 발현 수준 (도 1a)에 관계없이 셀 형상 뻗어있다. VIS 한편, (EWAT이 유래) 높은 SCA1 및 SCA1 낮은 세포는 세포 형태에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. VIS SQ (iWAT 유래) SCA1 높은 세포처럼 VIS SCA1 낮은 세포가 상피 모양을 보여 반면 SCA1 높은 세포, 섬유 아세포와 같은 세포 모양을 뻗어 디스플레이 (EWAT는 유래). SCA1-GFP 마우스에서 분리 SCA1 높은 세포는 쉽게 조직 배양 (그림 1B)에서
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토론
여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 그럼에도, 면역 자기 분리의 이용은 주요 설비없이 여전히 작은 기관에서 많은 생물학적 연구에 쉽게 액세스 할 수없는 FACS 장치 (15)의 사용에 의존하지 않고 분석 될 세포의 수는 증가 .
성공적인 결과를 보장하기 위해 준수해야하는 절차의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. ADIP의 조달마우스 지방 조직 저장소의 분리 수술은 줄기 세포를 필요 OSE 유래. 따라서, 조직 복구의 속도와 정확도가 생세포의 높은 번호를 수득하는 .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| 트립신 (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| 세포 여과기 | BD Bioscience | 352360 | 100-μ m 셀 스트레이너 |
| 60mm 플레이트 | BD 팔콘 | 353004 | |
| 가위 | FST | 14001-12 | 대형 |
| 가위 | FST | 14091-11 | 미세하고 구부러진 팁 |
| 대형 집게 | FST | 11000-12 | |
| 미세 집게 | 모든 공급 업체 | ||
| 25G 5/8 "바늘 | BD | 305122 | |
| 22G 1.5" 바늘 | BD | 305159 | |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 352098 | |
| MACS 분리 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 마이크로비드 키트 (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1º Ab 및 anti-FITC 마이크로비즈 2º Ab |
| AutoMACS 러닝 버퍼 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 블루 chux 패드 | Fisher | 276-12424 | |
| 흡수 패드 | Fisher | 19-165-621 | |
| 스티로폼 보드 | 50ml 튜브에서 사용 | ||
| 70% 에탄올 | |||
| 이소플루란 | 모든 공급업체 | ||
| 쥐, IgG2a, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a, 안티 마우스 Sca1, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a, R-PE | , Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a, 안티 마우스 F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| 라운드 바텀 튜브 | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (– 캘리포니아, – Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | 콜라겐분해효소 용액 |
| I형 콜라겐(37mm 아세트산 중 2.7mg/ml | 집에서 준비12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | 집에서 준비 | ||
| 커버 슬립 | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 카르복실산, 숙시니미딜 에스테르, 혼합 이성질체 | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
참고문헌
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.
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재인쇄 및 허가
