방법 논문

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

DOI:

10.3791/53909

⸱

2016년 3월 27일

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

이 논문에서

요약

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바이러스가 숙주 세포에 들어가는 동안 인플루엔자 A 바이러스 코어를 분해하는 것은 다단계 과정입니다. 우리는 바이러스 비코팅의 초기 단계를 분석하기 위한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 속도 구배 원심분리를 사용하여 정의된 조건에서 코팅 해제를 시작하는 단계를 생화학적으로 해부합니다.

초록

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산에 의해 유발된 분자 과정은 내포세포계를 통해 들어오는 많은 바이러스의 세포 진입을 밀접하게 제어합니다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 엔도솜 막과의 바이러스 융합 및 바이러스 캡시드의 후속 분해(코팅되지 않음)는 내포성 소포 내부의 이온 조건에 의해 결정됩니다. 바이러스 수명 주기의 초기 단계는 엔도솜에 실험적으로 직접 접근할 수 없기 때문에 연구하기 어렵기 때문에 in vitro 접근 방식이 필요합니다. 여기에서는 IAV 코어와 그 안정성을 분석할 수 있는 2층 글리세롤 구배를 통한 정제된 비리온의 속도 구배 원심분리를 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 구배는 하층에 비이온 세제(NP-40)를 함유하여 바이러스가 바닥으로 침전될 때 용해에 의해 바이러스 막을 제거합니다. 중성 pH에서 바이러스 코어는 안정적인 구조로 펠릿화됩니다. 주요 핵심 구성 요소인 매트릭스 단백질(M1)과 바이러스 리보핵단백질(vRNP)은 SDS-PAGE에 의해 펠릿 분획에서 명확하게 식별될 수 있습니다. 하단 층에서 pH를 6.0 이하로 낮추면 펠릿에서 M1이 선택적으로 제거된 후 더 산성 조건에서 vRNP가 방출됩니다. Coomassie-stained gel의 바이러스 단백질 띠는 IAV 분해의 중간 상태를 모니터링하기 위해 농도 측정 정량화를 수행할 수 있습니다. pH 외에도 염 농도 및 추정 바이러스 코팅 해제 인자와 같은 바이러스 코어 안정성에 영향을 미치는 다른 요인은 세제 함유 글리세롤 층을 적절하게 수정함으로써 간단히 평가할 수 있습니다. 종합하면, 제시된 기술을 통해 in vitro 바이러스 비코팅의 재현성이 높고 정량적인 분석이 가능합니다. 복잡한 코팅 제거 과정을 거치는 다른 외피 바이러스에 적용할 수 있습니다.

서론

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인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 포락선 바이러스와 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)의 가족에 속한다. 그 유전자는 세그먼트, 음의 감지 및 단일 가닥 RNA 게놈에 인코딩됩니다. 인간, IAV 계절 전염병의 발생에서 발생하는 호흡기 감염을 원인과 글로벌 전염병 일 가능성을 맺는다. 숙주 세포의 표면에이 시알 산 잔기에 결합하면, IAV는 클라 의존적 세포 내 이입 및 클라 독립 경로 3-8에 의해 내재화된다. 세포 내 이입 공포의 산성 환경 (PH <5.5) 바이러스의 융합과 후반 엔도 좀 막 9 초래 IAV 스파이크 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA)의 주요 구조적 변화를 트리거합니다. 사이트 오 - IAV 캡시드되면 말 엔도 좀 (레),이 핵에 바이러스 리보 (vRNPs)의 전송 다음 세포질에 코팅되지 않은됩니다에서 탈출했다 (여기 또한 바이러스의 "핵심"이라한다)F 바이러스 복제 및 전사 10-13. HA 산의 활성화에 앞서 바이러스는 연속 14-16 분해 용 코어를 준비하게 이입 시스템에서 pH의 점차적 감소를 경험한다. 이 "프라이밍"양성자와 K +10,14,16의 유입을 매개 바이러스 막 중의 M2 이온 채널 단계. 바이러스 내부에 이온 농도의 변화는 상호 작용이 바이러스의 매트릭스 단백질 (M1)과 여덟 vRNP 번들로 구축 방해 및 막 융합 10,14-17 다음 세포질 IAV의 uncoating을 용이하게한다.

프라이밍 공정 직접 정량 분석​​은 엔도 좀 실험적 액세스 어렵다는 사실에 의해 저해되었다. 진입 과정은 또한 매우 비동기이다. 또, 릴리스 바이러스 RNA 또는 감염성 측정 QRT-PCR 같은 종점 분석법은 바이러스 capsi의 생화학 적 상태에 대한 상세한 그림을 제공하지항목의 특정 단계 라. siRNA를하거나 약물 치료에 의해 ​​엔도 좀의 교란이 크게 IAV 항목 18 ~ 20의 이해에 기여하고 있지만, 미세 조정은 엄격하게 통제 엔도 좀 성숙 프로그램에서 불특정 부작용에 어렵고 쉽다.

이러한 문제를 방지하기 위해 속도 구배 원심 분리 (17)의 사용에 기초하여 이전에 개발 된 시험 관내 프로토콜을 채택하고있다. 대부분의 단백질 분해 절단 및 EM 분석 하였다 세제 처리의 조합을 기반으로 한 다른 시도가 21, 22, 23, 24, 대조적으로,이 방법은 쉽게 정량화 결과 수 있었다. 다른 구배 층을 통해 원심 분리는 침강 입자에 노출 제어 된 방식으로 상황 변화에 반응 할 수있다. 제시된 프로토콜, IAV 정화 막액 또는 정제 된 바이러스 입자로부터 유도는 2 층 글리세롤로 침강구배하는 바닥층은 비이 온성 세제 NP-40 (도 1)을 포함한다. 바이러스 제 세제 함유층 들어갈 때, 바이러스 외피 지질 및 엔벨로프 당 단백질 부드럽게 가용화 남아있다. 코어 8 개의 vRNP 다발로 구성되며, 매트릭스 층에 의해 둘러싸인 펠렛 분획으로 안정한 구조와 퇴적물. 이러한 M1과 vRNP 관련 핵 단백질 (NP)과 같은 바이러스 코어 단백질은, SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 펠렛으로 식별 될 수있다. 특히, 시판 구배 겔을 활용하고 고감도 콜로이드 쿠마시 염색 25, 고정밀 바이러스 코어 - 관련 단백질에도 소량의 검출을 가능하게한다.

이는 pH를, 염 농도, 및 추정 uncoating 요인 핵심 구성 요소 및 핵심 STABIL의 침강 거동에 영향을 상이한 조건 여부를 시험하기위한 기준을 설정 성만. 이를 위해, 글리세롤 구배 만 이하, 세제 함유층 인자 또는 관심 조건을 도입함으로써 변경된다. 이 기술은 IAV 코어 (16)의 무결성에 대한 pH 값 염화칼슘 농도 가지의 효과를 조사하고 특히 가치있다. IAV의 uncoating의 중간 단계의 pH 5.5와 낮은 16, 17 (그림 1)에서 vRNP 해리 뒤에 약간 산성 pH (<6.5)에서 매트릭스 층을 포함하는 해리를 모니터링 할 수 있습니다. 후자 단계는 상기 늦은 이입 환경 (16)을 반영 글리세롤 층이 높은 K + 농도의 존재에 의해 개선되었다. 바이러스 코어는 그라데이션을 침전으로서 따라서, 그들은 변화 환경 엔도 좀에서 모방 조건을 경험 하였다. 결과는 세포 생물학 분석에서 도출 된 결과를 보완, 체외에서 바이러스 코어의 단계적 해체했다.

t "> 여기에 제시된 방법은 빠른 활성화 및 IAV의 높은 재현성 분석했다 (X31 및 A / WSN / 33) 및 IBV (B가 리 / 40 /) 산성 pH에 의해 트리거 및 분해뿐만 아니라 K +16,17 증가 uncoating 그것은 생각할 알칼리 pH를 17 노광시의 코어 paramyxovirus. 접근법은 셀 입력시 바이러스 캡시드 구조 캡시드 분해의 생화학 적 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 외피 바이러스에 적용 할 수있다.

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프로토콜

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버퍼 및 재고 솔루션 1. 준비

  1. 80 ML의 DDH 2 O.에 470 mg의 트리스 염산염 390 mg을 MES 수화물 580 mg의 NaCl을 용해하여 (20 MM의 MES, 30 mM 트리스, 100 mM의 염화나트륨)을 MNT 버퍼를 준비 pH를 7.4로 버퍼를 조정하고 DDH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 가져
  2. 80 ml의 DH 2 O 각각에 9.76 g의 MES 수화물을 용해하여 500 mM의 MES 버퍼의 3 개의 동일한 솔루션을 준비합니다. 농축 된 NaOH로 적정하여 각각의 pH 5.8, 5.4, 5.0,에 버퍼를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 각 버퍼를 가지고
  3. DH 2 O 80 ㎖에 각각 7.88 g 트리스 염산에 용해시켜 500 mM 트리스 버퍼의 두 개의 동일한 솔루션을 준비하고 진한 HCl로 적정하여, 각각 7.4와 6.4로 pH를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 버퍼를 가지고
  4. DH 2 O 50 % 글리세롤 솔루션을 준비하고 glyc 때까지 잘 저어EROL는 균일하게 혼합이다. 유리 병으로 Steritop 필터 부 (0.22 ㎛의 공극 크기)를 통해 용액을 필터.
  5. 10 % NP-40 용액 DH 2 O. 1 M NaCl을 준비
  6. 4 ML의 DDH 2 O. 두 개의 정제를 용해시켜 25 배 농축 된 단백질 분해 효소 억제제를 준비

글리세롤 그라디언트 2. 준비

  1. 5 ml의 세제 버퍼 마스터 믹스 준비 (PH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, 5.0) 시험을 각각의 pH 조건에 대한 용액 (300 mM의 NaCl을 2 % NP-40을 2 배는 단백질 분해 효소 억제제를 집중). 이를 위해, 1 M의 NaCl 9 ㎖, 10 % NP-40 6 ml 일 25X 프로테아제 저해제 스톡 2.4 ㎖, 9 ML의 DDH 2 0 섞는다.
  2. 각각의 pH 조건 피펫 대한 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 마스터 믹스의 4.4 ml의.
  3. pH 값의 경우 5.8 위의 튜브에 각각의 pH를 조정 500 mM 트리스 주식 솔루션의 0.6 ml를 추가합니다. pH가 5.8와 하부를 들어 각각의 pH를 조정 500 mM의 MES 주식 솔루션의 0.6 ml를 추가합니다.
  4. 5 확인300 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 ml의 2 배 프로테아제 억제제는, 60 mM 트리스 pH를 7.4 DDH 2 O. 조정 이 세제없이 제어 그라데이션 버퍼로서 기능한다.
  5. 필요한 경우, 각각 농축 HCI 또는 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH를 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 및 5.0의 용액 pH를 미세 조정한다.
  6. 여섯 가지의 25 % 글리세롤 용액의 결과로 세제 함유 세제 프리 버퍼의 혼합물을 5 ml의 50 % 글리세롤 5 mL를 추가한다. 산도 표시기 스트립을 사용하여 pH 값을 확인한다.
    주 : 측정 된 pH가 목적하는 값에서 크게 다를 경우, 각각의 용액을 다시 제조한다.
  7. 7 비율 : 3에서 DH 2 O 50 % 글리세롤 주식을 혼합하여 15 % 글리세롤 솔루션을 준비합니다.

IAV의 3 초 원심 분리

  1. 5 ML의 주사기와 옛 성은을 사용하여 매우 명확한 원심 분리 튜브에 (13.2 ml를, 14mm X 89mm)을 3 ml의 15 % 글리세롤 솔루션을 추가DLE (9cm 길이 21 G). 이 그라데이션의 무결성을 방해 하듯 튜브의 내부 벽에 방울을 두지 마십시오. 여섯 원심 분리 튜브, 시험 법에 다섯 pH 조건 각각에 대해 하나 제어 샘플에 대한 하나의 총에 대해이 작업을 반복합니다.
  2. 조심스럽게 5 ㎖ 주사기 긴 바늘을 사용하여 15 %의 글리세롤 층 아래에​​ 3.4 ml의 25 % 글리세롤 용액을 놓는다. 두 개의 레이어를 혼합하지 않도록주의하십시오. 각각의 pH를 조정 글리세롤 솔루션을 테스트하는 여섯 조건에 대해이 작업을 반복합니다.
    참고 : 다음 단계 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에서 작업 할 수 있습니다.
  3. 부드럽게 1 ml의 MNT 버퍼에 희석 IAV (X31, H3N2)를 포함 뇨 유체를 정화 30 μL와 글리세롤 그라디언트 오버레이 각 그라데이션 (약 20 ~ 30 μg의 총 바이러스 성 단백질에 해당).
  4. 균형 튜브를 반대하고 SW41의 초 원심 분리 회 전자에 배치합니다. 55,000 XG에 150 분, 12 ° C에 대한 원심 분리기.
  5. 원심 분리 후, 신중하게깨끗한 파스퇴르 피펫 및 흡입기를 사용하여 상층 액, 즉, 두 글리세롤 레이어를 제거합니다. 40 μL (1X) LDS 샘플 완충액 비 환원성의 펠렛을 재현 탁. 완전히 펠렛을 용해 다운 수회 피펫을하고 중요하다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 샘플을 전송합니다.

펠렛 분획 및 쿠마시 염색 4. SDS-PAGE

  1. 10 분 동안 95 ° C에서 모든 샘플을 가열. 이들은 SDS-PAGE에 의해 분석 될 때까지이 지점에서 샘플을 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 로드 프리 캐스트 구배 (4~12%) 상에 용해 된 펠릿 20 μl를 비스 - 트리스 미니 젤 버퍼를 실행 1 배 MOPS SDS 200 V에서 1 시간 동안 실행합니다.
  3. DDH 2 O. 40 % 메탄올 및 10 % 빙초산 고정 용액을
  4. 1 시간 동안 고정 용액 내에서 겔을 쿠마 부화 콜로이드 용액의 충분한 부피를 가진 15cm 세포 배양 접시에서 하룻밤 동안 부드럽게 얼룩실온에서 진탕.
    주 : 염색 용액의 증발을 방지하기 위해 접시를 가까이하는 것이 중요하다.
  5. DDH 2 O.에서 젤 Destain 겔 배경이 명확해질 때까지 DDH 2 O마다 15 ~ 20 분 교체합니다. 이 밴드 정량 검사 될 때까지 4 ° C에서 DDH 2 O에서 젤을 저장합니다.
  6. 높은 해상도에서 젤을 스캔 단백질 밴드 강도의 정량화를위한​​ 시판 또는 사용자 정의 만든 소프트웨어를 사용합니다. 각 밴드에 근접한 영역에서 바탕 신호를 빼고 (PH 7.4) 세제없는 대조 시료에 이들 값을 정규화.

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결과

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이미 설명한 바와 같이, 엔도 좀에서 프라이밍 능력 uncoating IAV 코어를 렌더링하는 데 필요합니다. 코어의 양성자는 M1 및 vRNPs의 상호 작용을 약화 (바이러스 RNA, NP 구성을하고, 중합 효소 복합체 PB1 / PB2 / PA). 들어오는 바이러스 초기 엔도 좀 (EES) 6.5 (이하)의 pH에​​ 노출 레 약 5.0의 pH에​​서의 바이러스 퓨즈까지 계속 될 때이 프로세스는 시작된다.

산도의 감소를 모방하기 위해, 글리세롤 구배 바닥층은 일정 염 농도에서 pH를 7.4 및 5.0 사이의 값으로 조정 하였다. 명확히 막액으로부터 유도 X31은 SDS-PAGE에 의해 속도 구배 원심 분리하여 분석 하였다 (도 2A, B). 패턴의 특징에 의해 반영된 바와 같이 경사

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토론

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바이러스 캡시드는 준 안정 거대 분자 복합체이다. 비리의 어셈블리가 바이러스 게놈의 이입 및 응축을 필요로하지만, 감염의 다음 라운드의 시작이 소형 캡시드 구조의 해체에 따라 달라집니다. 바이러스는 세포 수용체, 보호자, 단백질 분해 효소, 모터 단백질 또는 헬리뿐만 아니라 pH와 이온 스위치 (26, 27)에 의해 제공되는 물리적 인 힘을 포함하는 코팅 - uncoating주기를 제어하는 다양한 세포 메커니즘을 악용 진화했다. 여기서는 구체적 IAV 코어의 분해를 촉진하는 요인의 영향을 테스트하기 위해, 글리세롤 구배 원심 분리에 기초한 시험 관내 방법을 설명한다. 이 기술은 잠재적으로 다른 외피 바이러스 uncoating 프로세스 해부하도록 구성 될 수있다.

콜로이드 쿠마, M1은, NP는, HA와 명확하더라도 비교적 작은 바이러스 partic하여 SDS-PAGE에서 검출 될 수있는 주요 구조물 IAV 단백질을 사용하여르 번호. 그러나,...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 시약으로 우리를 제공 요헤이 야마우치와 로버타 만치니 감사합니다. 아 연구소는 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (ITN)에 의해 지원되었다, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 유럽 연구위원회 (ERC) (SINERGIA).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
cOmplete™, EDTA-free 프로테아제 억제제 정제Sigma-Aldrich11873580001원액은 2 to 8 ° C 1에서 2주 동안
빙하 아세트산Merck Millipore100063
글리세롤 무수 BioChemicaAppliChemA1123
염산Merck Millipore100317
긴 주사 바늘 (21  G, 9cm, 베벨 또는 무딘 끝)
MES 수화물Sigma-AldrichM8250
메탄올Merck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896현재 IGEPAL ®로 상업적으로 이용 가능; CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 미니 젤, 10  웰, 1.0mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4개)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼(20개)Life TechnologiesNP0001
pH 지시자 스트립, pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC 콜로이드 Coomassie 염색BIO RAD1610803
나트륨 염화물Merck Millipore106406
나트륨수산화물Merck Millipore106498
Steritop 필터 유닛Merck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, 초원심분리 로터 세트Beckman Coulter331336
Thinwall, 초투명 원심분리기 튜브, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Tris hydrochloride AppliChemA1087
X31 인플루엔자 A 바이러스 (H3N2), 계란 성장, 정화 된 알란토스 유체Virapur4 °에서 갓 해동; 씨

참고문헌

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NP 40pHSDS PAGEM1

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