장기 특이적 감각 뉴런은 식별하기 어렵습니다. Fast Blue 추적은 세포 분류를 위해 기도에 신경을 분포시키는 노도즈(nodose) 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다. 분류된 노도즈(nodose) 뉴런은 염기서열분석을 위해 고품질 리보핵산(RNA)을 추출하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 기도 특이적 뉴런의 유전자 발현을 측정합니다.
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이 논문에서
요약
초록
체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경 세포의 세포 기관은 감각 신경절 내에 위치하고 있습니다. 감각 신경은 신체의 특정 기관 또는 부분에 분포. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 신체 사지에 걸쳐 프로세스를 연장한다. 삼차 신경은 두개골에있는 얼굴을 신경을 분포시키다, 상부기도한다. nodose 신경절의 미주 구 심성은 창자, 심장, 폐를 통해 확장 할 수 있습니다. 호흡,기도 자극, 기침 반사 신경 다음 nodose 뉴런과 같은 기능의 다양한 배열을 제어 할 수 있습니다. 따라서, 이해하고 기능을 조작하기 위해서는기도 특정 신경 하위 집단을 확인하고 분리하는 것이 매우 중요하다. 마우스에서,기도는기도 별 nodose 신경 세포의 역행 추적을위한 형광 추적 염료, 빠른 블루,에 노출에스. nodose 신경이 분해되고 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬은 염료 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 다음으로, 고품질의 리보 핵산 (RNA)가 차세대 시퀀싱 염색 양성 세포로부터 추출된다. 특정 신경 세포의 유전자 발현이 결정되는이 방법의기도를 사용.
서론
체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경의 세포 기관은 등 지느러미 루트, 삼차, 또는 nodose 신경절로, 감각 신경에 있습니다. 각각의 감각 신경절은 신체의 특정 지역을 innervates 및 해당 지역 내에서 별도의 기관과 조직을 신경을 분포시키다 세포가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 및 삼차 신경은 두개골에있는 동안기도 1 위 얼굴, 눈, 수막 또는 신경을 분포시키다 뉴런을 포함, 몸과 팔다리에 걸쳐 프로세스를 확장, 2. 미주 신경의 nodose 신경 낮은기도와 폐에 3 두개골 아래 목에 위치하고 있으며, 위장관, 심장에 걸쳐 신경 섬유를 확장 세포 기관을 포함하고있다. 인간의 nodose 신경절 그러나, 마우스에이 융합 혼자 서또한 폐 (4)를 innervates 경정맥 신경절과 함께. 이 융합 된 신경절 자주 / 경정맥 nodose 복잡한, 미주 신경절이라고, 또는 단순히 nodose 신경절 5있다. 여기서,는 nodose 신경절로 지칭된다.
nodose의 구 심성 섬유는 뇌간의 고독한 기관 (NTS)의 핵에 내장 정....
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프로토콜
동물 주제와 관련된 절차는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
빠른 블루 1. 비강 관리
빠른 블루의 경우, 최소 2 일 마우스를 안락사 전에 염료를 관리 할 수 있습니다. 염료는 최대 8 주 동안 지속됩니다.
- 천천히 시작 호흡 할 때까지 빛 흡입 마취 (2.5 %의 세보)와 마우스를 마취.
- 마우스를 위해 때때로 일시 천천히 콧 구멍에 염료 용액 40 μL (0.4 mM의 패스트 블루, 1 % 디메틸 설폭 사이드, DMSO, 포스페이트 완충 식염수, PBS)을 심어 여과 팁 200 μL 피펫을 사용하여이 용액을 흡입한다 (도 1A).
- 수직으로 마우스를 잡고 헤드 업, 부드럽게 염료 폐 전체에 확산하기 위해 가슴을 마사지.
해부 및 분석의 날 2. 준비
- 10 ml의 준비0 표 1에 명시된 성분을 조합하여 신경절 해리 용액 (GADS).
- 전용 실험실 영역에서 RNA 추출을 수행합니다. 실험, 70 % 에탄올, 10 % 표백제와의 RNase의 오염 제거 시약과 깨끗한 표면을 시작하기 전에. 이 RNA 원심 ....
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결과
이 방법을 사용하여,기도 - 근에 분포하는 신경 세포는 비강 빠른 블루 (그림 1A)를 주입하여 표시되어 있습니다. 이일 후, 빠른 블루 라벨 세포는 nodose 신경절 (그림 1C)에 나타납니다. nodose 신경절의 총 신경 인구의 5 % -이 세포들은 3을 차지합니다. 이러한 목적을 위해 사용 된 다른 역행 염료 DII (1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3 ', 3'- tetramethylindocarbocyanine 과염소산) 및 Fluorogold을 포함한다. 신경 nodose DII 라벨 폐 노출. 그러나, DII가 신경절에 도달하는 데 시간이 더 소요 7~14일 점안 (18, 19) 이후, 따라서 적극적으로 이송 염료를 사용 하였다. Fluorogold 또한기도 뉴런 14, 20 라벨에 사용되었습니다 적극적으로 이송 염료이다. 경험 그러.......
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토론
이 프로토콜은 미주 신경의 신경절에 nodose기도 - 근에 분포하는 신경 세포를 대상으로하는 방법을 설명한다. 일단 라벨링 신경절 부드럽게 최적 세포 수 및 생존력을 유지하기 위해 분해된다. 이들 뉴런은 FAC가 용해 버퍼에 직접 정렬 및 RNA를 추출 후이다. 이 프로토콜의 의미는, 분리 대상 및 특정 감각 세포 집단의 품질을 보존하는 능력이다. 유전자 발현은 신경이 작은 집단에서 설명되고, 기관 특이 기능 및 신경망이 식별된다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 분리 과정을 통해 빠른 진행과 이후의 세포 정렬을 포함한다. 분리 직후에 시작되도록 정렬 시간을 예약하는 것이 중요하다. 이 RNA 추출을위한 모든 튜브와 장비는 모든 RNA 추출 시약, 신선 70 %와 80 % 에탄올 솔루션은 신선한 만든, 그리고 것이 중요하다무료 깨끗하고의 RNase 있습니다.
이 프로토콜은 세포가 단일 세포 RNA 추출 및 시퀀싱 웰 플레이.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
NIH에서 지원하는 SEJ에 R01HL105635을 부여합니다. 저자는 기술적 조언 디에고 V. Bohórquez에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 기술 지원을 R. 이안 커밍 감사 및 공작 인간 백신 연구소 연구 유동 세포 계측법 공유 자원 시설 (더럼, NC)에 유동 세포 계측법을 수행하는 단계를 포함한다. 세포 계측법 건강의 국립 연구소, 알레르기 국립 연구소 감염증 (UC6-AI058607)에서 건설 부분 지원을받은 듀크의 지역 Biocontainment 연구소에서 수행 한 흐름.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 패스트 블루 | 폴리사이언스, Inc. | 17740-2 | 물 중 2mg/ml 재고 |
| NeuroTrace 530/615 레드 니슬 염색 | Life Technologies | N21482 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS) Ca 및 Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| 글루타민( Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (비타민 A 없음) | Gibco | 12587-010 | |
| 신경 성장 인자 (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µ PBS/10% FBS 소화 효소의 g/ml |
| , Liberase DH 연구 등급 | Roche | 5401054001 | 재고 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| 가열 블록 | LabNet | ||
| 70 µ m 세포 여과기 | Falcon | 352350 | |
| 절대 에탄올(200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase 오염 제거 시약, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA 추출 키트, RNeasy 플러스 마이크로 키트 | Qiagen | 74034 | |
| DNase 키트, RNase-Free DNase 세트 | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | 재고 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | 재고 10 µ에 10 mg/ml; PBS |
| 미세유체 전기영동 시스템(TapeStation 2200) | 질런트 |
참고문헌
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T.
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재인쇄 및 허가
