Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

요약

장기 특이적 감각 뉴런은 식별하기 어렵습니다. Fast Blue 추적은 세포 분류를 위해 기도에 신경을 분포시키는 노도즈(nodose) 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다. 분류된 노도즈(nodose) 뉴런은 염기서열분석을 위해 고품질 리보핵산(RNA)을 추출하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 기도 특이적 뉴런의 유전자 발현을 측정합니다.

초록

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경 세포의 세포 기관은 감각 신경절 내에 위치하고 있습니다. 감각 신경은 신체의 특정 기관 또는 부분에 분포. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 신체 사지에 걸쳐 프로세스를 연장한다. 삼차 신경은 두개골에있는 얼굴을 신경을 분포시키다, 상부기도한다. nodose 신경절의 미주 구 심성은 창자, 심장, 폐를 통해 확장 할 수 있습니다. 호흡,기도 자극, 기침 반사 신경 다음 nodose 뉴런과 같은 기능의 다양한 배열을 제어 할 수 있습니다. 따라서, 이해하고 기능을 조작하기 위해서는기도 특정 신경 하위 집단을 확인하고 분리하는 것이 매우 중요하다. 마우스에서,기도는기도 별 nodose 신경 세포의 역행 추적을위한 형광 추적 염료, 빠른 블루,에 노출에스. nodose 신경이 분해되고 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬은 염료 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 다음으로, 고품질의 리보 핵산 (RNA)가 차세대 시퀀싱 염색 양성 세포로부터 추출된다. 특정 신경 세포의 유전자 발현이 결정되는이 방법의기도를 사용.

서론

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경의 세포 기관은 등 지느러미 루트, 삼차, 또는 nodose 신경절로, 감각 신경에 있습니다. 각각의 감각 신경절은 신체의 특정 지역을 innervates 및 해당 지역 내에서 별도의 기관과 조직을 신경을 분포시키다 세포가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 및 삼차 신경은 두개골에있는 동안기도 ¹ 위 얼굴, 눈, 수막 또는 신경을 분포시키다 뉴런을 포함, 몸과 팔다리에 걸쳐 프로세스를 ^{확장, 2.} 미주 신경의 nodose 신경 낮은기도와 폐에 ³ 두개골 아래 목에 위치하고 있으며, 위장관, 심장에 걸쳐 신경 섬유를 확장 세포 기관을 포함하고있다. 인간의 nodose 신경절 그러나, 마우스에이 융합 혼자 서또한 폐 ^(4)를 innervates 경정맥 신경절과 함께. 이 융합 된 신경절 자주 / 경정맥 nodose 복잡한, 미주 신경절이라고, 또는 단순히 nodose 신경절 ^5있다. 여기서,는 nodose 신경절로 지칭된다.

nodose의 구 심성 섬유는 뇌간의 고독한 기관 (NTS)의 핵에 내장 정보를 전달합니다. 이 독특한 신경절에 감각 입력은 소화관 운동성 ^6, 심장 박동 ^{7, 8, 9} 호흡 및 자극 활성화 호흡 응답 ^{10, 11와} 같은 기능의 다양한 배열을 제어합니다. 기능과 신경 지배 기관의 다양성, 대상과 개인의 연결 경로를 연구하기 위해 nodose 신경절의 기관 고유의 소집단을 분리하는 것이 중요합니다. 그러나 nodose의 작은 크기와이 사소한 작업이 아니다 포함 뉴런의 수가 제한을 부여. 신경절 nodose 각 마우스는 약 5,000 뉴런 ⁽¹²⁾ 포함위성 세포를지지하는 광범위한 집단에 추가한다. 5 % 정신 자극기도 - 5,000 nodose 신경 만 3. 따라서 인해 호흡기 자극 또는 병리에기도 - 근에 분포하는 신경 세포 내의 기능적인 형태 또는 분자 변화는, 조밀하게 포장 nodose 신경절에서 손실됩니다.

이 문제를 해결하기 위해 방법을 식별하고기도에 분포 뉴런을 격리하기 위해 개발되었다. 기도는 이후의 근에 분포 nodose 뉴런을 식별하는 추적 형광 염료에 노출시켰다. 빠른 블루 신경 세포에 의해 포착하고이 최대 팔주 ^(13)에 대해 유지됩니다 자신의 세포 기관에 신속하게 이동했다 ^{- 15.} 일단 부드러운, 아직 효율적 해리 프로토콜은 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬 염료 라벨 및 세포 생존을 유지하는 데 사용되었다 확인했다. 정렬 세포는 유전자 발현 또는 F를 결정하기 위해 고품질의 리보 핵산 (RNA)을 추출하는 데 사용됩니다또는 다른 다운 스트림 분자 분석. 이 프로토콜은 관심의 조직을 신경을 분포시키다 감각 뉴런을 분리하기위한 유용하고 강력한 기술을 제공한다.

프로토콜

동물 주제와 관련된 절차는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

빠른 블루 1. 비강 관리

빠른 블루의 경우, 최소 2 일 마우스를 안락사 전에 염료를 관리 할 수​​ 있습니다. 염료는 최대 8 주 동안 지속됩니다.

1. 천천히 시작 호흡 할 때까지 빛 흡입 마취 (2.5 %의 세보)와 마우스를 마취.
2. 마우스를 위해 때때로 일시 천천히 콧 구멍에 염료 용액 40 μL (0.4 mM의 패스트 블루, 1 % 디메틸 설폭 사이드, DMSO, 포스페이트 완충 식염수, PBS)을 심어 여과 팁 200 μL 피펫을 사용하여이 용액을 흡입한다 (도 1A).
3. 수직으로 마우스를 잡고 헤드 업, 부드럽게 염료 폐 전체에 확산하기 위해 가슴을 마사지.

해부 및 분석의 날 2. 준비

1. 10 ml의 준비0 표 1에 명시된 성분을 조합하여 신경절 해리 용액 (GADS).
2. 전용 실험실 영역에서 RNA 추출을 수행합니다. 실험, 70 % 에탄올, 10 % 표백제와의 RNase의 오염 제거 시약과 깨끗한 표면을 시작하기 전에. 이 RNA 원심 분리기 모든 튜브 랙 및 피펫을 포함한다. RNA 사용만을위한 전용 필터 팁 박스가 있는지 확인합니다. 이 샘플을 오염 바와 같이, DNA의 준비를 위해이 장비와 영역을 사용하지 마십시오.
3. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 신선한 70 %, 80 % 에탄올을 혼합한다. 샘플 당 1 ml의 RNA 추출에 사용될 준비한다.

성분	양
고급 DMEM / F12	9.5 ml의
글루타민	100 μL
HEPES (10 밀리미터)	100 μL
N2 보충	100 μL
B27 (NO 비타민 A)	200 μL
NGF (50 μg의 / ㎖)	10 μL

신경절 해리 솔루션 (GADS) 표 1. 시약의 혼합물.

3. 해부 절차

1. 500 μL GADS, 각 실험 샘플에 대한 하나의 긍정적 정렬 제어를위한 하나, 그리고 음의 정렬 제어를위한 하나의 1.5 ml의 튜브를 입력합니다. 해부에 걸쳐 얼음에 보관 튜브.
2. nodose 신경절을 해부 및 분리를 용이하게하기 위해 두 부분 컷을 한 후 실험 샘플 튜브에 넣어. nodose 신경절 ^(16)와 DRG ^(17)의 해부에 대해 다음 조브 프로토콜을 참조하십시오.
3. 정렬 컨트롤, 해부 및 부분적 지느러미 루트 신경절 (DRG)와 같은 비 표지 신경을 잘라. 양성 대조군과 두 gangli 두 신경절을 사용하여부정적인 제어를위한.
4. 성공적인 정렬을위한 충분한 nodose 신경 세포를 얻으려면 하나의 실험 샘플 튜브 포함 GADS에 5 쥐에서 신경을 결합한다.

4. 감각 신경절 해리

1. 관에 신경을 떠나, 500 μL의 GADS를 피펫. 신경절 후, 튜브의 바닥에 정착 PBS를 피펫을 위해 1 ml의 PBS를 추가하여 한 번에 신경을 씻어 기다립니다.
2. 1 ml의 GADS과 소화 효소의 22 μL (콜라게나 제 I / II 및 단백질 분해 효소 믹스, 2.5 ㎎ / ㎖에서 H ₂ O)에 각 튜브를 추가합니다.
3. 양성 대조군 튜브에 20 μl의 빠른 블루 (5.26 mm)를 추가합니다.
4. 이미 37 ℃에서 설정된 수욕 또는 가열 블록에 튜브를 넣고.
   참고 : 신경 소화의 시간은 소화 효소의 나이에 따라 달라집니다. 6개월 45 분 동안 소화 - (2) 내에 소화 효소를 용해 1 개월 내에 30 분 동안 소화. 효소가 6 개월 이상 된 경우, 신경 f를 소화또는 60 분.
5. 15 분마다 흔들어 튜브 짧게 신경을 보장하기 위해 그들을 가볍게는 솔루션이 적용됩니다.
6. 신경 소화되는 동안 입자 용액 (폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 콜로이드 실리카 입자)를 사용하여 농도 구배를 준비한다.
   1. GADS에서 12 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다.
   2. GADS에서 28 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다.
   3. 천천히 조심스럽게 각 샘플에 대한 신선한 1.5 ML 튜브에 400 ㎕의 28 % 농도의 용액의 상단에 400 μl의 12 % 밀도 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 두 층이 혼합하는 것을 허용하지 않습니다. 두 가지 층은 튜브에 표시한다 다른 것보다 어두운 하나.
7. 신경이 소화되는 동안, (정렬 샘플 당 하나의 빠른 긍정적 인 블루와 하나의 빠른 블루 부정적인 튜브를) 정렬 새로운 1.5 ml의 수집 튜브 라벨. INTERFER하지 않도록 정렬 기능 요구에 따라,이 튜브는 착탈 뚜껑 있어야셀 소터와 전자.
8. 적절한 소화 시간 후, 소화 효소와 GADS를 제거하고 1 ml의 PBS로 두 번 신경을 씻는다. 각 튜브에 신선한 GADS 200 μl를 추가합니다.
9. 떨어져 세포를 파괴하기 위해 위아래로 여러 번 100 μl의 볼륨 설정 200 μL 피펫, 피펫의 신경을 사용합니다. 조직에는 손상 조각이 볼 수없는 때까지 반복합니다. 용액에 거품을 만들지 마십시오.
10. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 해리 세포를 전달합니다.
11. 남아있는 나머지 길 잃은 셀을 선택하고 셀 스트레이너를 통해 추가 솔루션을 전달하는 원래 분리 튜브에 또 다른 100 μL의 GADS를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하여 여과기를 통과 메시에 집착 한 나머지 세포 함유 액체를 수집합니다. GADS 현탁 세포의 최종 부피는 300 μL이다.
12. 조심스럽게 이전에 만든 밀도 기울기의 상단에 세포의 300 μl를 층. 거품을 피하고 C의 혼합밀도 레이어 ELL 학생.
13. RT에서 2,900 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
14. 세포를 원심 분리에있는 동안 다음, 용해 완충액 (실험 샘플 당 1 ml)에 섞어 10 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 (RNA 추출 키트) 1 ㎖의 완충액 RLT있다.
    1. 빠른 블루 긍정적 인 포집 관에 300 μL 용해 버퍼와 빠른 블루 음의 포집 관 (단계 4.7에서 표시 관) 600 μl를 추가합니다. 이 볼륨을 수집 할 예정 셀의 수에 의존한다. 7000 세포 600 μl를 추가 들어 <2,000 세포, 300 μl를 추가>가. 이것은 상당히 용해 완충 용액을 희석하지 않는 정렬 피복 유체를 보장한다.
15. 원심 분리가 완료된 후, 조심스럽게 제거하고 700 ㎕의 상단 층을 버린다. 이 계층은 다른 세포 정렬을 방해 세포 파편의 대부분을 포함하고 있습니다.
16. 용액을 피펫 함유 나머지 셀에 700 μL의 신선한 GADS 추가테 위아래로 여러 번 혼합한다.
17. 세포 펠렛 2,900 XG에 15 분 동안 원심 분리기.
18. 세포를 원심 분리기에있는 동안, 1 ML의 GADS 5 μL의 DNase의 (10 ㎎ / ㎖)을 추가하여 GADS를 (샘플 당 500 μl를) 정렬 섞는다.
19. 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 세포 펠렛을 떠나, 제거하고 상층 액을 버린다.
20. 다시 일시 정지 (200)에서 세포 펠렛 - 최대 피펫 팅하여 200 ㎕를 여러 번으로 설정 1,000 μL 피펫과 아래로 300 ㎕를 정렬 GADS를. 얼음에 샘플을 넣습니다. 셀은 정렬 할 준비가 된 것입니다.

5. 형광 활성 셀 (FAC) 정렬

참고 :이 섹션은 운영 FACS 분류기의 지식이나 숙련 된 인력의 도움을 필요로한다.

1. 세포 생존 능력을 테스트하기 위해 각각의 샘플 1 ㎕의 요오드화 프로피 듐 (PI) 스톡 용액 (50 μg의 / ㎖)을 추가한다. 이 튜브, PI 하나 하나없이로 음성 대조군을 분할합니다. PI는 죽은 세포에서 DNA를 결합한다. 만약처음 몇 종류 후, PI의 사용이 필요하지 않은 레이블을 할 죽은 세포가 없습니다.
2. 전송 세포는 얼음에 예., BD FACS AriaII이, 디바 8 소프트웨어를 실행, 악기 유동 세포 계측법합니다.
3. 셀 크기는이 모집단에서 가변하기 때문에, 정렬에 많은 노즐 (100 μm의)을 사용한다. 응력 세포 경험의 양을 감소시키고 세포 생존력은 낮은 압력 (20 PSI)을 사용하여 증가한다.
4. 분석 플롯, 필요한 경우 앞으로 산란, 사이드 분산 형 (SSC), 패스트 블루, 그리고 PI를 설정하는 FACS 분류기 소프트웨어를 사용합니다.
5. 세포를 다시 일시 중단하려면, 부드럽게 분류기에로드하기 전에 샘플 잠시 소용돌이.
6. 게이트 임계 값 (그림 2A)를 설정, 음성 대조군, 더 빠른 블루 또는 PI로 시작합니다. 이 세포 집단의 자기 형광의 양을 결정할 것이다. 옵션 : 죽은 세포의 인구가 있는지 여부를 확인하는 PI와 음성 시료를 실행합니다.
7. (INC 양성 대조군 샘플을 정렬보상 매개 변수를 설정하기 위해) 빠른 블루와 ubated.
8. 문 및 매개 변수가 설정되면, 실험 샘플을 정렬 시작합니다. RNA 샘플을 용해 완충액을 포함하는 제조 수집 튜브로 정렬된다.
9. 셀 정렬이 완료 될 때까지 얼음에 정렬 된 샘플을 유지합니다.
10. 세포는 정렬 후 즉시 RNA 추출 단계를 시작한다.

6. RNA 추출

1. 1 분 동안 용해 버퍼에 소용돌이 분류 세포를 균질화한다.
2. 몇 번을 피펫 팅 아래로 70 % 에탄올과 혼합의 1 볼륨을 추가합니다.
3. 스핀 컬럼에 시료 700 ㎕의 최대 전송합니다. 8,000 × g으로 15 초 동안 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
   1. 시료의 총 부피가 스핀 컬럼을 통과 할 때까지 반복한다.
4. 제조자 protoco에있어서, 상기 DNase를 처리 단계를 포함하는, 350 ㎕의 완충액 RW1을 추가하고 RNA 정제 과정을 계속셀 리터.
5. RNA 추출 된 후에, 제조자의 명세에 따른 전기 영동 미세 유체 시스템을 사용하여 RNA의 품질을 테스트한다.

결과

이 방법을 사용하여,기도 - 근에 분포하는 신경 세포는 비강 빠른 블루 (그림 1A)를 주입하여 표시되어 있습니다. 이일 후, 빠른 블루 라벨 세포는 nodose 신경절 (그림 1C)에 나타납니다. nodose 신경절의 총 신경 인구의 5 % -이 세포들은 3을 차지합니다. 이러한 목적을 위해 사용 된 다른 역행 염료 DII (1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3 ', 3'- tetramethylindocarbocyanine 과염소산) 및 Fluorogold을 포함한다. 신경 nodose DII 라벨 폐 노출. 그러나, DII가 신경절에 도달하는 데 시간이 더 소요 7~14일 점안 ^{(18, 19)} 이후, 따라서 적극적으로 이송 염료를 사용 하였다. Fluorogold 또한기도 뉴런 ^{14, 20 라벨에} 사용되었습니다 적극적으로 이송 염료이다. 경험 그러...

토론

이 프로토콜은 미주 신경의 신경절에 nodose기도 - 근에 분포하는 신경 세포를 대상으로하는 방법을 설명한다. 일단 라벨링 신경절 부드럽게 최적 세포 수 및 생존력을 유지하기 위해 분해된다. 이들 뉴런은 FAC가 용해 버퍼에 직접 정렬 및 RNA를 추출 후이다. 이 프로토콜의 의미는, 분리 대상 및 특정 감각 세포 집단의 품질을 보존하는 능력이다. 유전자 발현은 신경이 작은 집단에서 설명되고, 기관 특이 기능 및 신경망이 식별된다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 분리 과정을 통해 빠른 진행과 이후의 세포 정렬을 포함한다. 분리 직후에 시작되도록 정렬 시간을 예약하는 것이 중요하다. 이 RNA 추출을위한 모든 튜브와 장비는 모든 RNA 추출 시약, 신선 70 %와 80 % 에탄올 솔루션은 신선한 만든, 그리고 것이 중요하다무료 깨끗하고의 RNase 있습니다.

이 프로토콜은 세포가 단일 세포 RN​​A 추출 및 시퀀싱 웰 플레이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
패스트 블루	폴리사이언스, Inc.	17740-2	물 중 2mg/ml 재고
NeuroTrace 530/615 레드 니슬 염색	Life Technologies	N21482
디메틸설폭사이드(DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS) Ca 및 Mg free	Gibco	14190-144
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
글루타민( Glutamax)	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27 (비타민 A 없음)	Gibco	12587-010
신경 성장 인자 (NGF)	Sigma	N6009	stock 50 µ PBS/10% FBS 소화 효소의 g/ml
, Liberase DH 연구 등급	Roche	5401054001	재고 2.5 mg/ml in water
particle solution (Percoll)	Sigma	P1644-25ML
가열 블록	LabNet
70 µ m 세포 여과기	Falcon	352350
절대 에탄올(200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
RNase free water	Fisher Scientific	BP2484-100
RNase 오염 제거 시약, RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-mercaptoethanol	VWR	EM-6010
RNA 추출 키트, RNeasy 플러스 마이크로 키트	Qiagen	74034
DNase 키트, RNase-Free DNase 세트	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	재고 0.15 M NaCl
Propidium Iodide	Sigma	P4170-10MG	재고 10 µ에 10 mg/ml; PBS
미세유체 전기영동 시스템(TapeStation 2200)	질런트